Mutace genu KRAS a citlivost k inhibitorům receptoru pro epidermální růstový faktor u kolorektálního karcinomu: praktická aplikace při výběru pacientů

ročník 1 číslo 1 31. dubna 2009 Jou r n a l o f Clinical On c o l o g y speciální článek Mutace genu KRAS a citlivost k inhibitorům receptoru pro epidermální růstový faktor u kolorektálního karcinomu: praktická aplikace při výběru pacientů Antonio Jimeno, Wells A. Messersmith, Fred R. Hirsch, Wilbur A. Frankli a S. Gail Eckhardt University of Colorado Cancer Center, Aurora, CO. Podáno 23. srpna 2008, přijato 20. října 2008; publikováno online před tiskem 5. ledna 2009 na www.jco.org. Vyjádření autorů o možném střetu zájmů a podíl autorů na článku se nacházejí na jeho konci. Adresa pro korespondenci: Antonio Jimeno, MD, PhD, Medical Oncology Division, PO Box 6511, MS 8117, Aurora, CO, 80045; e mail: Antonio.Jimeno@UCDenver.edu. 2009 by American Society of Clinical Oncology 0732 183X/09/2707 1130/$20.00 DOI: 10.1200/JCO.2008.19.8168 S o u h r n Nedávné důkazy z několika retrospektivních randomizovaných klinických studií prokázaly, že pacienti s pokročilým kolorektálním karcinomem nesoucím mutovaný gen KRAS neprofitují z léčby monoklonálními protilátkami proti receptoru pro epidermální růstový faktor, jako jsou cetuximab nebo panitumumab. Toto zjištění představuje prvek, který mění zavedený přístup a bude mít významný dopad na současný i budoucí vývoj protinádorových léčiv. Uvedené výsledky přispívají k ekonomickým a etickým úvahám při vývoji nových prostředků cílené biologické léčby a měly by vést k podrobnějšímu zkoumání mechanismů rezistence a výzkumu prediktivních biomarkerů v časnějších fázích vývoje těchto přípravků. V tomto článku podáme souhrn dostupných klinických údajů, budeme diskutovat otázku možných důsledků pro budoucí vývoj léčiv, určených k terapii kolorektálního karcinomu a poskytneme ucelený přehled technických aspektů laboratorního testování mutace genu KRAS. Soustředíme se zejména na výčet dostupných procedur pro detekci mutací a jejich hlavní charakteristiky, stejně jako na jejich srovnání z hlediska použitelnosti v klinické praxi. Vzhledem k tomu, že skutečná specificita a senzitivita těchto metod musí být teprve přesně stanovena, bude lepší porozumění rozdílům mezi uvedenými testy kritickým faktorem při jejich plnohodnotném začleňování do procesu rutinní péče o pacienty s kolorektálním karcinomem ze strany klinických lékařů a patologů. J Clin Oncol 27:1130 1136. 2009 by American Society of Clinical Oncology Úvod Biologický úvod a souhrn klinických údajů Jeden z nejvíce skličujících problémů, který musí řešit dnešní onkologové, je otázka výběru pacientů, zejména výběru pro cílenou biologickou léčbu. Příkladem racionální, ale nakonec nepřesné strategie k dosažení tohoto cíle byl kolorektální karcinom (colorectal cancer, CRC). Cetuximab, monoklonální protilátka proti receptoru pro epidermální růstový faktor (epidermal growth factor receptor, EGFR), byl původně uvolněn pouze pro léčbu pacientů, u kterých byla prokázána exprese EGFR, 1 ale později se prokázalo, že pacienti, kteří EGFR neexprimují, mohou z této léčby profitovat podobným způsobem jako nemocní s detekovatelným receptorem. 2 Bylo tedy akceptováno, že účinnost (nebo naopak neúčinnost) tohoto nebo podobných cílených léčiv budou lépe určovat jiné faktory, než je exprese EGFR. Po sérii nerandomizovaných studií referujících o minimálním či žádném profitu z anti EGFR léčby u pacientů s mutací KRAS, ať už byla tato léčba užita jako monoterapie, nebo v kombinaci s chemoterapeutiky, 3 8 jsou již k dispozici i důkazy vyplývající z výsledků randomizovaných studií (tab. 1 a 2). Přesvědčivý charakter těchto retrospektivních údajů umožní vyhnout se sběru prospektivních dat před tím, než se učiní příslušná opatření. Pacienti s CRC nesoucí mutaci KRAS neprofitují z terapie monoklonálními protilátkami cílenými proti EGFR, ať už jsou použity jako léčba první linie, 9,10 druhé linie 11 nebo třetí linie. 12 Biologie KRAS Proteiny RAS náleží do tzv. superodiny guanosin 5 trifosfatáz (GTPáz), z nichž nejzná mější členové jsou KRAS, NRAS a HRAS. 13 Jejich úlohou je přenos signálu z receptorů pro růstové faktory na buněčném povrchu, ale vzhledem k existenci mnohočetných, souběžně se uplatňujících zdrojů signálů (z různých receptorů, ligandů) jsou ve stále větší míře považovány spíše za integrátory těchto signálů než za pouhé přenašeče. Ke komplexnosti výše uvedených dějů přispívá navíc existence negativních a pozitivních zpětných vazeb. Proteiny RAS podstupují při aktivaci tzv. prenylaci (tj. navázání řetězce tvořeného 15 uhlíky) v oblasti sekvence CAAX (C, cystein; A, alifatické aminokyseliny; X, serin nebo methionin) katalyzovanou enzymem farnesyltransferázou. Tato modifikace činí molekuly RAS hydrofobnějšími, s vyšší afinitou k adhezi na vnitřní povrch cytoplazmatické 2009 by American Society of Clinical Oncology 51

Jimeno et al. Tabulka 1. Výsledky studií s jednou větví obsahujících v léčebném režimu inhibitor EGFR, které analyzovaly korelaci mezi účinností této léčby u kolorektálního karcinomu a stavem genu KRAS Studie Léčba Celkový počet pacientů Míra léčebné odpovědi (%) KRAS MT KRAS WT Benvenuti 3 P nebo C nebo C CT 48 6 31 De Roock 4 C CT 113 0 40 Finocchiaro 5 C CT 81 6 26 Di Fiore 6 C CT 59 0 28 Khambata 7 C 80 0 10 Lievre 8 C CT 89 0 40 Zkratky: EGFR, receptor pro epidermální růstový faktor (epidermal growth factor receptor); CRC, kolorektální karcinom (colorectal cancer); C, cetuximab; CT, chemoterapie; MT, mutovaná forma; P, panitumumab; WT, normální, divoká forma (wild-type). membrány, kde aktivují další přenašeče, jakou jsou PI3K a MAPK. Protože mutace KRAS postihují oblast, která reguluje úroveň enzymatické aktivity, umožňují na stimulu nezávislou a setrvalou aktivaci těchto molekul. Existuje pouze omezené množství mutací genu KRAS a 90 % z celkového počtu postihuje pouze tři kodony (12, 13 a 61). Například mutace kodonu, který normálně kóduje aminokyselinu glycin v pozici 12, vede k zařazení některé jiné aminokyseliny s postranním řetězcem (glycin je jediná aminokyselina, která nemá postranní řetězec), což prostorově interferuje s geometrickou strukturou GTP, která za normálních okolností umožňuje jeho hydrolýzu za účelem návratu molekuly RAS do inaktivního stavu. 13 Získání určitých mutací KRAS tak vede k permanentně aktivovanému stavu těchto molekul, což umožnuje buňkám uniknout apoptóze a získat proliferační výhodu. Skutečnost, že počet těchto mutací je velmi malý, stejně tak jako jejich vnitřní stabilita a detekovatelnost, činí mutace genu KRAS ideálním farmakodiagnostickým ukazatelem. KRAS jako prognostický faktor u CRC Konečný dopad mutací KRAS na klinický průběh, který je nezávislý na terapii, je vzhledem k protichůdným zprávám v případě kolorektálního karcinomu kontroverzní. V rámci rozsáhlé studie s 3 439 pacienty s CRC bylo zjištěno, že z 12 možných mutací v oblasti kodonů 12 a 13, měla pouze mutace kodonu 12, která vedla k záměně valinu za glycin (8,6 %), statisticky významný dopad na průběh onemocnění. 14 Menší studie prokázaly poněkud podobné výsledky, 15 ale retrospektivní údaje z jiných velkých randomizovaných studií, jako např. ze studie hodnotící přidání bevacizumabu k terapii CRC první linie tvořené irinotecanem, 5 fluorouracilem (5 FU) a leucovorinem (IFL), 16 nebyly schopné shodně demonstrovat významný efekt mutace KRAS na klinický výsledek u pacientů s CRC. V uvedené studii však byla léčba podávána ve všech větvích, čímž se zastřel čistý prognostický vliv mutace. Ve fázi III rozsáhlé randomizované studie porovnávající efekt panitumumabu proti nejlepší podpůrné terapii (best supportive care, BSC; pozn. překl.: podpůrná léčba, kromě chemoterapie, pro maximalizaci kvality života, slouží jako kontrolní větev u randomizovaných studií s chemoterapií) nebyl pozorován žádný rozdíl v PFS u neléčených pacientů, přičemž PFS byl 7,3 týdne jak u pacientů s nemutovanou (wild type, WT), tak s mutovanou formou. 12 Kanadský národní onkologický institut (The National Cancer Institute of Canada) referoval, pouze formou posteru, o studii, která randomizovala pacienty refrakterní ke konvenční chemoterapii do skupiny léčené cetuximabem a skupiny BSC 17 ; ve skupině BSC bylo přežití u pacientů s KRAS WT 4,8 měsíců a u pacientů s mutovanou formou 4,6 měsíců (P =,97). KRAS jako prediktivní faktor u CRC V poslední době poskytlo několik klinických studií důkazy naznačující, že mutace KRAS může u kolorektálního karcinomu určovat odpověď na terapii monoklonálními protilátkami proti EGFR. Randomizovaná studie fáze III CRYSTAL hodnotila účinnost cetuximabu ve spojení s režimem obsahujícím kontinuálně infuzí podávaný 5 FU, leucovorin a irinotecan proti režimu 5 FU (podávaný bolusově a kontinuálně) + leucovorin + irinotecan v léčbě první linie u pacientů s metastazujícím CRC, který exprimoval EGFR. U pacientů zařazených do skupiny léčené režimem obsahujícím cetuximab bylo prokázáno statisticky významné zlepšení celkové léčebné odpovědi a prodloužení střední délky přežití bez progrese onemocnění (progression free survival, PFS). Nicméně v podskupině pacientů, u kterých bylo možno provést analýzu přítomnosti mutací KRAS, se ukázalo, že prospěch z léčby cetuximabem byl omezen pouze na nemocné s nemutovanou formou genu KRAS. 9 Jednalo se o retrospektivní analýzu provedenou u podskupiny pacientů podle původního léčebného záměru, ale nemocní s mutovanou i divokou formou KRAS se vzájemně podobali svými demografickými charakteristikami i charakterem onemocnění. Obdobně ve fázi II studie OPUS, která hodnotila režim FOLFOX ± cetuximab v léčbě první linie, profitovali z léčby cetuximabem ve spojení s režimem FOLFOX pouze pacienti s KRAS WT v porovnání s těmi, kteří byli léčeni pouze režimem FOLFOX, a to jak ve smyslu léčebné odpovědi (61 % vs. 37 %; p = 0,01), tak PFS (7,7 vs. 7,2 měsíců; p = 0,02). 10 Studie EVEREST sledovala, zda eskalace dávky cetuximabu založená na kožní reakci (rash) v kombinaci s irinotecanem v léčbě druhé linie bude schopna zvýšit léčebnou odpověď. 11 Kromě hodnocení kožní reakce jakožto předpokládané náhražky za farmakoki Studie Léčba KRAS MT KRAS WT Celkový počet pacientů Trvání HR Trvání HR Amado 12 P vs. BSC (třetí linie) 427 7,4 týdne 0,99 12,3 týdne 0,45 Van Cutsem 9 Bokemeyer 10 Tabulka 2. Výsledky ze skupin léčených inhibitory EGFR v rámci randomizovaných studií, které analyzovaly korelaci mezi účinností biologické léčby u kolorektálního karcinomu a stavem genu KRAS FOLFIRI ± C (první linie) 540 7,6 měsíců 1,07 9,9 měsíce 0,68 FOLFOX ± C (první linie) 233 5,5 měsíce 1,83 7,7 měsíce 0,57 Zkratky: EGFR, receptor pro epidermální růstový faktor (epidermal growth factor receptor); CRC, kolorektální karcinom (colorectal cancer); BSC, nejlepší podpůrná péče (best supportive care); C, cetuximab; FOLFIRI, bolusový a kontinuální fluorouracil + leucovorin + irinotecan; FOLFOX, bolusový a kontinuální fluorouracil + leukovorin + oxaliplatina; HR, poměr rizika (hazard rate); MT, mutovaná forma; P, panitumumab; WT, normální, divoká forma (wild-type). 52 2009 by American Society of Clinical Oncology Journal of Clinical Oncology

Role experimentální medikace v léčbě pacientů s pokročilým metastatickým nádorovým onemocněním netické či farmakodynamické parametry byla též testována pozitivní prediktivní hodnota stavu KRAS. U pacientů s nádorem nesoucím KRAS WT nebyly zaznamenány žádné rozdíly a léčebná odpověď se pohybovala od 30 % ve skupině s nízkou dávkou do 42 % ve skupině s vysokou dávkou; u pacientů s mutovanou formou KRAS byla prokázána 0% léčebná odpověď. V terapii třetí linie byl u pacientů s CRC prokázán přínos panitumumabu ve smyslu prodloužení přežití ve srovnání s BSC. 12 V rámci podskupinové analýzy bylo demonstrováno, že efekt léčby panitumumabem na PFS byl ve skupině pacientů s WT KRAS nádory signifikantně větší než ve skupině s mutací KRAS (HR, 0,45 vs. 0,99; p = 0,0001). Střední délka PFS ve skupině nemocných s nádory WT KRAS byla 12,3 týdne u panitumumabu a 7,3 týdne při BSC a míra léčebné odpovědi byla u panitumumabu 17 % a u BSC 0 %. Na základě těchto výsledků schválila Evropská léková agentura (European Medicines Agency, EMEA) léčbu panitumumabem pouze u pacientů s nádory, které nesou WT KRAS. Jednalo se o první schválení léku pro terapii CRC založené na přítomnosti/absenci genové mutace, a otevřela se tak nová éra v biomarkery řízené léčbě tohoto onemocnění. Dopady a souvislosti Výše uvedené údaje mají obecné důsledky. Předně z nich logicky vyplývá předpoklad: jsou mutace KRAS odpovědné za horší léčebné výsledky pozorované u podskupiny pacientů léčených konvenční chemoterapií v kombinaci s inhibitory EGFR v porovnání se samotnou konvenční chemoterapií? Z medicínského hlediska se tímto otevírá nová cesta, neboť u pacientů s CRC a mutací KRAS existuje jasná potřeba nových léčebných alternativ. Z praktického hlediska znamená implementace tohoto selekčního parametru u celkové populace pacientů s CRC důležitý logistický úkol, neboť metody detekce mutace KRAS (na rozdíl od dřívějších zkušeností s imunohistochemickým testováním HER2 a EGFR) nebyly ve všech studiích shodné a v současné době není k dispozici žádný standardizovaný test schválený americkým Úřadem pro potraviny a léčiva (FDA). KRAS jako potenciálně škodlivý faktor pro anti EGFR léčbu Může přítomnost mutací genu KRAS znamenat potenciálně škodlivý faktor pro anti EGFR terapii? Ačkoli studie CRYSTAL neprokázala jasný škodlivý efekt inhibitorů EGFR u nemocných s mutací KRAS, v menší studii OPUS byl u pacientů s mutací KRAS, kteří podstoupili léčbu režimem FOLFOX a cetuximabem, zaznamenán horší výsledek ve smyslu PFS (5,2 vs. 8,6 měsíců; p = 0,02) a hraničně horší léčebná odpověď (33 % vs. 49 %; p = 0,1) v porovnání se skupinou léčenou pouze režimem FOLFOX. Tyto výsledky jsou ve shodě s dřívějšími údaji ze studií u pokročilého nemalobuněčného karcinomu plic (non small cell lung cancer, NSCLC), kde podskupinové analýzy naznačovaly, že pacienti s mutací KRAS léčení chemoterapií a inhibitorem EGFR (erlotinib) měli signifikantně horší výsledky než ti, kteří byli léčeni pouze samotnou chemoterapií. 18 V následné studii, která vyhodnocovala udržovací terapii gefitinibem proti placebu u pacientů s karcinomem plic, bylo zjištěno, že skupina léčená gefitinibem měla horší výsledky, které nemohly být vysvětleny toxicitou, ale byly přisuzovány zvýšené nádorové progresi. 19 Výsledky biologického testování u těchto pacientů jsou netrpělivě očekávány, zcela jasně však vyvstává otázka, zdali neselektivní inhibice uvedené signální dráhy není nejen spojena se ztrátou prospěchu, ale zda li rovněž nevede k horším výsledkům. V současnosti není pro tato zjištění k dispozici žádné jasné vysvětlení. Zmíněné náznaky protichůdných účinků jsou nicméně ve shodě se známou komplexností signálních drah u nádorů a poukazují na to, že linearita těchto drah představuje pouze koncepční model. Jak bylo prokázáno v případě aktivace Akt po neselektivní inhibici mtor (mammalian target of rapamycin), mohou zpočátku nejasné a protismyslné nálezy vést k identifikaci kompenzační zpětné vazby. 20,21 Konečný výsledek farmakologické intervence bude záležet na specifických buněčných souvislostech a dynamické rovnováze, které jsou zase pravděpodobně určovány komplexním, geneticky určovaným prostředím. 22 Jak zvýšit míru léčebné odpovědi u pacientů s KRAS WT? Přítomnost nemutované formy KRAS u CRC je nezbytnou, ale ne dostatečnou podmínkou pro získání prospěchu z léčby inhibitory EGFR. Jde o podobnou situaci jako u NSCLC, kde mutace KRAS rovněž signalizují ztrátu prospěchu z terapie inhibitory EGFR (i když důkazy jsou zde méně přesvědčivé) a navzájem se vylučují s pozitivním prediktorem, mutacemi EGFR. 18 Mezi pozitivní prediktivní ukazatele, které jsou v současné době vyhodnocovány u pacientů s KRAS WT patří zvýšení počtu kopií genu EGFR (EGFR gene copy number, EGFR GCN); z terapie cetuximabem profitují více pacienti, jejichž nádorové buňky mají zvýšený EGFR GCN. 23 Nejnovější zprávy potvrdily, že testování EGFR GCN poskytuje nezávisle na stavu KRAS významné informace pro odhad léčebné odpovědi a celkového přežití; 24 stále problematické však zůstávají záležitosti kolem reprodukovatelnosti metody, týkající se hraniční hodnoty EGFR GCN. Efektivitu léčby u populace pacientů léčených biologickou terapií by mohla rovněž zvýšit identifikace dalších negativních prediktivních faktorů. Pozornost by měla být věnována výzkumu a testování tzv. síťových, na genetických parametrech založených přístupů, při kterých jsou generovány mnohočetné podskupiny nemocných s cílem dalšího zpřesnění při výběru reagující populace pacientů. Tyto postupy napodobují standardy v léčebné péči o pacienty s hematologickými malignitami, jako např. s chronickou myeloidní leukémií (CML). Máme nové terapeutické alternativy pro pacienty s mutovanou formou KRAS? Bylo prokázáno, že molekuly RAS představují jeden z nejobtížnějších cílů při vývoji protinádorových léčiv. Různé přístupy primárně zaměřené na inhibici aktivity enzymu farnesyltransferázy u karcinomů s mnohočetnými mutacemi RAS, včetně CRC, selhaly. 25 U některých tumorů, jako např. u karcinomu pankreatu, kde jsou mutace RAS přítomny prakticky ve všech případech, selhaly rovněž postupy založené na inhibici kroků následujících po RAS. 26 Co tedy činí RAS tak nedostižitelným cílem? Fakt, že alterované proteiny mají fyzikální a geometrickou překážku bránící návratu do inaktivního stavu, může vysvětlovat, proč je tak obtížné vyvážit jejich aktivaci. Jako alternativní řešení jsou zkoumány možnosti současného mnohočetného ovlivnění následných signálních drah, zvýšení obratu mutovaných bílkovin cestou inhibice proteinu hsp90, blokování alternativních aktivačních kroků (jiných než farnesylace) nebo využití výhody různé imunogenicity mutovaných forem RAS. Inhibitory MEK mají potenciál zhostit se této úlohy, neboť inhibují následné efektorové kroky v systému KRAS. 27 Testování KRAS: zvažování výběru analytické metody Obrovská organizační výzva leží v dosavadním testování nádorové tkáně u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem, testování, o němž se předpokládá, že bude v blízké budoucnosti pro www.jco.org 2009 by American Society of Clinical Oncology 53

Jimeno et al. váděno u všech pacientů s CRC. V době, kdy se regulační orgány a spolupracující skupiny připravují na tuto novou situaci, je mimořádně významná otázka, jaký test u obecné populace nemocných použít pro detekci, ale též pro klinické rozhodování. Vzhledem k tomu, že mutace jsou binární jevy (přítomné nebo nepřítomné) s menším prostorem pro interpretaci testů pro jejich přímý průkaz než u metod založených na průkazu proteinů nebo mrna, jsou úvahy o konkrétní analytické metodě důležité pro určení optimální vyváženosti mezi přesností a praktičností. Výběr vzorku: problémy s použitím klinicky nejvíce dostupných zdrojů Vzorky dostupné pro analýzu mutací jsou typicky tkáňové bločky fixované formalinem a zalité v parafínu (formalin fixed paraffin embedded, FFPE). Donedávna představovala extrakce DNA z FFPE obtížnou a časově náročnou práci s nízkou výtěžností a kvalitou takto získaného materiálu. 28 Původní studie přímo srovnávající míru detekce mutací ve zmrazených a do parafínu zalitých vzorcích stejné tkáně zjistily, že procento mutací detekovaných ve FFPE vzorcích bylo asi poloviční v porovnání se zmrazenými vzorky. 29 Propracování techniky FFPE nicméně vykompenzovalo omezení těchto vzorků a zvýšilo senzitivitu testů DNA v materiálech fixovaných formalinem. Fixace poškozuje molekuly DNA tak, jak formaldehyd štěpí vodíkové vazby a desintegruje dvouvláknovou DNA, čímž usnadňuje vytváření kovalentních vazeb mezi formaldehydem a bázemi DNA. 30 Důsledkem je alterace v pořadí bazí, která může být příčinou detekce arteficiálních mutací při konvenční PCR analýze (PCR polymerase chain reaction, polymerázová řetězová reakce). Naštěstí není tento jev při dostatečném množství buněčného materálu dostupného pro sekvenování častý; v jedné studii nebyl tento jev pozorován, byl li pro analýzu k dispozici ekvivalent 300 a více buněk. 31 Aby se předešlo tomuto typu artefaktů, je proto důležité používat dostatečné množství DNA, přičemž pro testování KRAS je doporučováno minimálně 30 ng vzorové DNA, což je množství, které lze snadno získat z většiny tkáňových bločků FFPE. Tkáňové obohacení Dalším zdrojem potenciálních chyb při testování KRAS je naředění nádorových DNA molekulami DNA z reaktivních buněk v okolí tumoru (jako třeba z fibroblastů, leukocytů nebo endoteliálních buněk), které neobsahují mutace, ale mohou soutěžit s mutovanou DNA v amplifikačních reakcích. Určité způsoby obohacení vzorku nádorovými buňkami zvyšují senzitivitu testování mutací, přičemž tyto způsoby mohou zahrnovat mikro nebo makrodisekci nebo selektivní vzorkování parafínových bločků bioptickou jehlou tak, jak je to široce využíváno při přípravě tkáňových mikroanalýz. Při použití těchto metod je třeba věnovat značnou péči získávání dostatečného množství DNA (> 30 ng) pro amplifikaci, aby se předešlo vlivu arteficiálních mutací zmíněných výše. Výběr testu: vyvážení senzitivity a přesnosti s použitelností v klinické praxi Konečně i vlastní analytická metoda může mít různou senzitivitu a specificitu. Bylo vypracováno několik metod pro detekci mutací; seznam představitelů uvedených testů poskytuje tab. 3. Všechny tyto metody jsou založeny na polymerázové řetězové reakci (PCR). Nejvíce přístupnou technikou pro testování KRAS, která po dlouhou dobu představovala zlatý standard pro detekci mutací, je přímé sekvenování KRAS amplifikovaných procesem PCR. 32 Tato metoda je schopna detekovat všechny mutace v amplifikovaných sekvencích DNA, ale vyžaduje, aby obsah mutovaných kopií dosahoval alespoň 20 % až 50 % obsahu všech doprovodných WT sekvencí. Získání dostatečného množství vysoce kvalitní DNA z FFPE bločků může být dosti obtížné, a byla to právě technika přímého sekvenování, která byla použita ve studiích, jež referovaly o nižší senzitivitě testování mutací v tkáňových FFPE blocích. 28,29 Nízká senzitivita a vysoké náklady přímého sekvenování vedly k vývoji přijatelnějších metod, které jsou pro analýzu klinických vzorků vhodnější. Metody detekce bodových mutací byly vyvinuty již před více než deseti lety, 32 od té doby ale byly pro detekci KRAS v klinických vzorcích zavedeny do praxe modernější, specifičtější a senzitivnější testy. Tyto techniky využívají polymorfismu v délce restrikčních fragmentů (restriction fragmentation length polymorphism, RFLP), 33 35 vazby alelově specifických oligonukleotidů (allele specific oligonucleotide hybridization, ASO), analýzy křivek teplot tání s vysokým rozlišením (high resolution melting analysis, HRMA) a analýzy systému mutací vzdorujících amplifikaci (amplification refractory mutation systém, ARMS). Dnes již Tabulka 3. Metody analýzy mutací KRAS Metoda Přímé sekvenování (direct sequencing) Polymorfismus v délce restrikčních fragmentů ověření přímým sekvenováním Alelově specifická oligonukleotidová sonda Analýza křivek teplot tání s vysokým rozlišením, ověření přímým sekvenováním Analýza systému mutací vzdorujících amplifikaci Princip Určení nukleotidové sekvence testovaného vzorku (nespecificky s ohledem na konkrétní mutaci) a následné srovnání s normální, referenční sekvencí Přítomnost mutace indukuje nebo eliminuje specifické oblasti DNA, které jsou štěpeny restričními endonukleázami Polymerázová řetězová reakce/selektivní detekce specifické mutace Sekvence s přítomnou mutací tají při různých, určených teplotách Polymerázová řetězová reakce/detekce specifické mutace Zkratky: MT, mutovaná forma; WT, divoká forma (wild-type). Senzitivita (MT/WT; %) Doba zpracování Nevýhody 20 50 0,10 10 5 1 Dlouhá (4 dny až 2 týdny Dlouhá (4 dny až 2 týdny Rychlá (méně než 2 dny Dlouhá (4 dny až 2 týdny Rychlá (méně než 2 dny Obtížně kvantifikovatelné, velmi nízká senzitivita, dlouhá doba zpracování Komplikované; vyžaduje konfirmaci přímým sekvenováním; vyžaduje značné manuální vstupy; není kvantitativní; sporná specificita Relativně nízká senzitivita Komplikované; vyžaduje konfirmaci přímým sekvenováním; vyžaduje značné manuální vstupy V průběhu jedné reakce detekuje pouze jednu specifickou mutaci; vyžaduje speciálně připravené primery/sondy 54 2009 by American Society of Clinical Oncology Journal of Clinical Oncology

Role experimentální medikace v léčbě pacientů s pokročilým metastatickým nádorovým onemocněním klasická metoda genového sekvenování spočívá v zásadě ve skládání sekvence genu (nebo oblasti genu nejčastěji postihované mutacemi) nukleotid po nukleotidu a následném srovnání s normální sekvencí příslušného genu. Metoda RFLP je založena na rozdílech v citlivosti ke štěpení restrikčními enzymy mezi mutovanou a WT KRAS DNA, kdy ke štěpení dochází pouze v oblasti DNA s definovanou sekvencí. Většinou se využívá včlenění restrikčního místa do normální, ale nikoli mutované DNA, pomocí záměny jedné baze v PCR primerech. Podstatou vlastní techniky je pak výběr různých restrikčních endonukleáz, které mohou štěpit DNA pouze v případě, že není přítomna mutace; jestliže mutace přítomna je, restrikční enzym nebude schopen, v důsledku změny nukleotidů, rozeznat štěpící oblast genu a mutovaný vzorek tak bude rozštěpen na větší části. Například v případě enzymu BstNI může být restrikční místo inzerováno do kodonu 11 pouze normální, nikoli mutované formy genu. 35 Štěpení PCR produktů enzymem BstNI snižuje koncentraci WT DNA, což má za následek preferenční amplifikaci mutovaných kopií, které můžeme detekovat pomocí gelové elektroforézy 34 a nověji pomocí přístroje 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Ačkoli jde o vysoce senzitivní metodu, je bohužel zároveň značně složitá a vyžaduje přísnou kontrolu podmínek pro PCR a restrikční štěpení, abychom se vyhnuli replikačním chybám a tvorbě arteficiálních mutací. Důležitým nedostatkem techniky RFLP je skutečnost, že v případě mutace nemůže být určen specifický nukleotid. Metoda proto vyžaduje konfirmaci pomocí přímého sekvenování a nejeví se tak příliš praktickou pro masové klinické použití. Problémy týkající se specificity tohoto přístupu brání jeho rutinnímu použití v klinické praxi. Metoda vazby alelově specifických oligonukleotidů (ASO) je založena na principu snížení teploty tání dvouvláknové DNA zapříčiněném mutací navozeným chybným párováním jednoho páru bazí a tím snížením energie této vazby. 36 Rozdíl zjištěný mezi teplotou tání sekvence s normálním párováním a sekvence s poruchou párování jednoho páru bazí může být využit k odlišení WT sekvencí od sekvencí s bodovou mutací. 37 Metoda ASO může být použita formou tečkové hybridizace (dot blot), 38 40 ale na jejím principu byly rovněž vyvinuty technologie oligonukleotidových DNA čipů a analýzy křivek teplot tání s vysokým rozlišením (HRMA). Obtížným problémem však zůstává vyhledávání velmi malého množství kopií spoře se vyskytujících mutovaných alel ve směsi DNA, zvláště v preparátech s vysokou koncentrací normálních alel, jako je tomu typicky v případě klinických vzorků. Navíc tato metoda vyžaduje speciální zařízení a speciální software pro analýzu, což ji činí celkově velmi nákladnou. Nicméně technologie DNA biočipů byla pro testování klinických onkologických vzorků již ověřena a schválena. 41 Metoda HRMA spočívá v měření rozdílů teplot tání mezi dvouvláknovou DNA se správně a chybně párovanými bazemi, které jsou způsobeny buď polymorfismem nebo somatickou mutací. 42 Při vlastní realizaci jsou naměřené teploty tání porovnávány se známou referenční škálou. Principem je snížení vzájemné afinity obou řetězců DNA způsobené mutací, kdy vazby mezi řetězci mají nižší energii, a řetězce tak mohou být působením tepelné energie snadněji odděleny. Vlastní provedení HRMA následuje po PCR, přičemž jde o metodu nenákladnou a rychlou. Senzitivita testu je vysoká, se schopností záchytu chybného párování bazí DNA při koncentraci mutovaných alel již pět procent. 43 Předběžné studie mutací KRAS u kolorektálního karcinomu 43 a NSCLC 44,45 naznačovaly, že specificita testu bude vysoká, zvláště ve světle zjištění, že různé křivky teplot tání jsou spojeny s konkrétními typy alelických mutací. Tento test však není schopen specificky identifikovat konkrétní mutace. Vzhledem k tomu, že abnormality křivek teplot tání mohou způsobit jakékoli změny DNA, je v těchto případech nutné ověření pomocí přímého sekvenování. To však prodlužuje testovací čas, zvyšuje náklady metody a snižuje tím její výhody proti samotnému přímému sekvenování. HRMA tak může být rychlým screeningovým testem, avšak v klinické praxi snižuje její využitelnost nutnost konfirmace přímým sekvenováním. Metoda ARMS je založena na zjištění, že oligonukleotidy se záměnou jedné baze na konci 3 nemohou fungovat jako primery. 46 Při vhodné konstrukci primeru na jeho konci 3, mohou být ve vzorku s nízkou koncentrací mutovaných genových kopií preferenčně amplifikovány právě tyto mutované alely. Vlastní proces je založen na skutečnosti, že reakce je dokončena (tj. je zkopírována celá sekvence a emitován automaticky detekovaný signál) pouze tehdy, jestliže je přítomna abnormální (mutovaná) sekvence. Systém ARMS byl využíván pro detekci mutovaných forem KRAS u kolorektálního karcinomu již před deseti lety. 47 V nedávné době začal být prováděn na platformě kvantitativní PCR, 40 a to ve spojení s bifunkčním fluorescenčním primerem/sondou 48 (Scorpion 49 ). Tento kombinovaný test používá sedm primerů/sond k detekci sedmi různých mutací KRAS v jednom setu, který je schopen detekovat přítomnost mutace KRAS v heterogenních vzorcích s nízkou koncentrací alel (1 %), a to bez nutnosti konfirmace přímým sekvenováním. Uvedený test byl úspěšně odzkoušen ve fázi III klinických studií u metastatického karcinomu tračníku, kde byli pacienti léčeni anti EGFR protilátkou panitumumabem. 12 Nevýhodou testu je, že mohou být detekovány pouze již známé mutace. I tak se však zdá, že tato metoda bude vzhledem ke své jednoduchosti a rychlosti provedení cenným pomocníkem v klinické praxi. Do budoucna lze očekávat aplikaci řady nových technologií, určených k detekci mutací KRAS v klinických vzorcích. Moderní metodou, která již prokázala svoji využitelnost při detekci mutací KRAS u kolorektálního karcinomu je např. technika tzv. pyrosekvenování, 50 velmi výkonná technologie, která je v současnosti užívána při vysoce výkoných sekvenovacích procesech. 51 Dalším slibným přístupem se jeví detekce mutací KRAS v periferní krvi. 52 Závěr Neselektivní aplikace monoklonálních protilátek proti EGFR, jako je cetuximab nebo panitumumab, všem pacientům s metastatickým CRC nemůže být již nadále považována za standardní léčbu, neboť tato léčiva jsou u nemocných s mutovanou formou KRAS neúčinná. Uvedené výsledky přispívají k ekonomickým a etickým úvahám při vývoji nových prostředků cílené biologické léčby a měly by vést k podrobnějšímu zkoumání mechanismů rezistence a výzkumu prediktivních biomarkerů v časnějších fázích vývoje těchto přípravků. Skutečná specificita a senzitivita dostupných metod musí být teprve přesně stanovena; finanční náklady a technické problémy jsou v současnosti obrovské. Lze se domnívat, že finanční náklady budou postupně klesat a vysokokapacitní technologie, které poskytnou komplexní celkovou analýzu genomu nádorových buněk, umožní individualizovanou terapii, jež bude ve shodě s molekulární patologií tumoru stejně jako s histologickým a buněčným typem. V tomto období, kdy jsou pacienti selektivně vyřazováni z anti EGFR terapie bez možnosti alternativní biologické léčby, je důležité tyto nemocné s mutovanou formou KRAS ujistit, že současné chemoterapeutické režimy pro CRC jsou účinné a že rozhodnutí o vyřazení z biologické léčby má v jejich případě za cíl pouze zlepšení poměru rizika ku prospěchu. Stejně tak by měla být v případě těchto pacientů naší prioritou v doporučeních stran tera www.jco.org 2009 by American Society of Clinical Oncology 55

Jimeno et al. pie podpora k účasti v klinických studiích. Adekvátní sběr a zpracování tkáňových vzorků je kritickým krokem nejen při poskytování nejlepší možné léčebné péče našim současným pacientům, ale rovněž při zvyšování naší připravenosti pro stále se rozšiřující pole genetických a proteomických biomarkerů, které budou v blízké budoucnosti testovány a postupně zařazovány do běžné denní praxe. PROHLÁŠENÍ AUTORŮ O MOŽNÉM střetu ZÁJMŮ Autoři neudávají žádný možný střet zájmů. Podíl autorů na článku Koncepce a návrh: Antonio Jimeno, Wells A. Messersmith, Fred R. Hirsch, Wilbur A. Franklin, S. Gail Eckhardt Sběr a kompletace dat: Antonio Jimeno, Wells A. Messersmith, Fred R. Hirsch, Wilbur A. Franklin, S. Gail Eckhardt Analýza a interpretace dat: Antonio Jimeno, Wells A. Messersmith, Fred R. Hirsch, Wilbur A. Franklin, S. Gail Eckhardt Psaní rukopisu: Antonio Jimeno, Wells A. Messersmith, Fred R. Hirsch, Wilbur A. Franklin, S. Gail Eckhardt Konečné schválení rukopisu: Antonio Jimeno, Wells A. Messersmith, Fred R. Hirsch, Wilbur A. Franklin, S. Gail Eckhardt Literatura 1. Cunningham D, Humblet Y, Siena S, et al: Cetuximab monotherapy and cetuximab plus irinotecan in irinotecan refractory metastatic colorectal cancer. N Engl J Med 351:337 345, 2004 2. Chung KY, Shia J, Kemeny NE, et al: Cetuximab shows activity in colorectal cancer patients with tumors that do not express the epidermal growth factor receptor by immunohistochemistry. J Clin Oncol 23:1803 1810, 2005 3. Benvenuti S, Sartore Bianchi A, Di Nicolantonio F, et al: Oncogenic activation of the RAS/RAF signaling pathway impairs the response of metastatic colorectal cancers to anti epidermal growth factor receptor antibody therapies. Cancer Res 67:2643 2648, 2007 4. De Roock W, Piessevaux H, De Schutter J, et al: KRAS wild type state predicts survival and is associated to early radiological response in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. Ann Oncol 19:508 515, 2008 5. Finocchiaro G, Capuzzo F, Janne K, et al: EGFR, HER2 and Kras as predictive factors for cetuximab sensitivity in colorectal cancer. J Clin Oncol 25:168s, 2007 (suppl; abstr 4021) 6. Di Fiore F, Blanchard F, Charbonnier F, et al: Clinical relevance of KRAS mutation detection in metastatic colorectal cancer treated by cetuximab plus chemotherapy. Br J Cancer 96:1166 1169, 2007 7. Khambata Ford S, Garrett CR, Meropol NJ, et al: Expression of epiregulin and amphiregulin and K ras mutation status predict disease control in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab. J Clin Oncol 25:3230 3237, 2007 8. Lievre A, Bachet JB, Boige V, et al: KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. J Clin Oncol 26:374 379, 2008 9. Van Cutsem E, Lanf I, D haens G, et al: KRAS status and efficacy in the first line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mcrc) treated with FOLFIRI with or without cetuximab: The CRYSTAL experience. J Clin Oncol 26:5s, 2008 (suppl; abstr 2) 10. Bokemeyer C, Bondarenko I, Hartmann JT, et al: KRAS status and efficacy of first line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mcrc) with FOLFOX with or without cetuximab: The OPUS experience. J Clin Oncol 26:178s, 2008 (suppl; abstr 4000) 11. Tejpar S, Peeters M, Humblet Y, et al: Relationship of efficacy with KRAS status (wild typeversus mutant) in patients with irinotecan refractory metastatic colorectal cancer (mcrc), treated with irinotecan (q2w) and escalating doses of cetuximab (q1w): The EVEREST experience (preliminary data). J Clin Oncol 26:178s, 2008 (suppl; abstr 4001) 12. Amado RG, Wolf M, Peeters M, et al: WildtypeKRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 26:1626 1634, 2008 13. Malumbres M, Barbacid M: RAS oncogenes: The first 30 years. Nat Rev Cancer 3:459 465, 2003 14. Andreyev HJ, Norman AR, Cunningham D, et al: Kirsten ras mutations in patients with colorectal cancer: The RASCAL II study. Br J Cancer 85:692 696, 2001 15. Esteller M, Gonzalez S, Risques RA, et al:k ras and p16 aberrations confer poor prognosis in human colorectal cancer. J Clin Oncol 19:299 304, 2001 16. Ince WL, Jubb AM, Holden SN, et al: Association of k ras, b raf, and p53 status with the treatment effect of bevacizumab. J Natl Cancer Inst97:981 989, 2005 17. National Cancer Institute of Canada Clinical Trials and the Australasian Gastro Intestinal Trials Group: The influence of K Ras exon 2 mutations on outcomes in a randomized phase III trial of cetuximab + best supportive care (BSC) versus BSC alone on patients with EGFR positive colorectal cancer. 10th World Congress on Gastrointestinal Cancer, Barcelona, Spain, June 25 28, 2008 18. Eberhard DA, Johnson BE, Amler LC, et al: Mutations in the epidermal growth factor receptor and in KRAS are predictive and prognostic indicators in patients with non small cell lung cancer treated with chemotherapy alone and in combination with erlotinib. J Clin Oncol 23:5900 5909, 2005 19. Kelly K, Chansky K, Gaspar LE, et al: Phase III trial of maintenance gefitinib or placebo after concurrent chemoradiotherapy and docetaxel consolidation in inoperable stage III non small cell lung cancer: SWOG S0023. J Clin Oncol 26:2450 2456, 2008 20. O Reilly KE, Rojo F, She QB, et al: MTOR inhibition induces upstream receptor tyrosine kinase signaling and activates Akt. Cancer Res 66:1500 1508, 2006 21. Jimeno A, Kulesza P, Wheelhouse J, et al: Dual EGFR and mtor targeting in squamous cell carcinoma models, and development of early markers of efficacy. Br J Cancer 96:952 959, 2007 22. Sjoblom T, Jones S, Wood LD, et al: The consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers. Science 314:268 274, 2006 23. Cappuzzo F, Finocchiaro G, Rossi E, et al: EGFR FISH assay predicts for response to cetuximab in chemotherapy refractory colorectal cancer patients. Ann Oncol 19:717 723, 2008 24. Personeni N, Fieuws S, Piessevaux H, et al: Clinical usefulness of EGFR gene copy number as a predictive marker in colorectal cancer patients treated with cetuximab: A fluorescent in situ hybridization study. Clin Cancer Res 14:5869 5876, 2008 25. Rao S, Cunningham D, de Gramont A, et al: Phase III double blind placebo controlled study of farnesyl transferase inhibitor R115777 in patients with refractory advanced colorectal cancer. J Clin Oncol 22:3950 3957, 2004 26. Rinehart J, Adjei AA, Lorusso PM, et al: Multi center phase II study of the oral MEK inhibitor, CI 1040, in patients with advanced non small cell lung, breast, colon, and pancreatic cancer. J Clin Oncol 22:4456 4462, 2004 27. Adjei AA, Cohen RB, Franklin W, et al: Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of the oral, small molecule mitogen activated protein kinase kinase 1/2 inhibitor AZD6244 (ARRY 142886) in patients with advanced cancers. J Clin Oncol 26:2139 2146, 2008 28. Frayling IM: Methods of molecular analysis: Mutation detection in solid tumours. Mol Pathol 55:73 79, 2002 29. Gallegos Ruiz MI, Floor K, Rijmen F, et al: EGFR and K ras mutation analysis in non small cell lung cancer: Comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Cell Oncol 29:257 264, 2007 30. Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S: Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol 161:1961 1971, 2002 31. Williams C, Ponten F, Moberg C, et al: A high frequency of sequence alterations is due to formalin fixation of archival specimens. Am J Pathol 155: 1467 1471, 1999 32. Nollau P, Wagener C: Methods for detection of point mutations: Performance and quality assessment: IFCC Scientific Division, Committee on Molecular Biology Techniques. Clin Chem 43:1114 1128, 1997 33. Haliassos A, Chomel JC, Grandjouan S, et al: Detection of minority point mutations by modified PCR technique: A new approach for a sensitive diagnosis of tumor progression markers. Nucleic Acids Res 17:8093 8099, 1989 34. Levi S, Urbano Ispizua A, Gill R, et al: Multiple K ras codon 12 mutations in cholangiocarcinomas demonstrated with a sensitive polymerase chain reaction technique. Cancer Res 51:3497 3502, 1991 35. Jiang W, Kahn SM, Guillem JG, et al: Rapid detection of ras oncogenes in human tumors: Applications to colon, esophageal, and gastric cancer. Oncogene 4:923 928, 1989 36. Wallace RB, Johnson MJ, Hirose T, et al: The use of synthetic oligonucleotides as hybridization probes: II. Hybridization of oligonucleotides of mixed sequence to rabbit beta globin DNA. Nucleic Acids Res 9:879 894, 1981 37. Conner BJ, Reyes AA, Morin C, et al: Detection of sickle cell beta S globin allele by hybridization with synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A 80:278 282, 1983 38. Sidransky D, Von Eschenbach A, Tsai YC, et al: Identification of p53 gene mutations in bladder cancers and urine samples. Science 252:706 709, 1991 39. Sidransky D, Tokino T, Hamilton SR, et al: Identi fication of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors. Science 256:102 105, 1992 40. Clayton SJ, Scott FM, Walker J, et al: K ras point mutation detection in lung cancer: Comparison of two approaches to somatic mutation detection using ARMS allele specific amplification. Clin Chem 46:1929 1938, 2000 41. Beaudet AL, Belmont JW: Array based DNA diagnostics: Let the revolution begin. Annu Rev Med 59:113 129, 2008 42. Gundry CN, Vandersteen JG, Reed GH, et al: Amplicon melting analysis with labeled primers: A clo 56 2009 by American Society of Clinical Oncology Journal of Clinical Oncology

Role experimentální medikace v léčbě pacientů s pokročilým metastatickým nádorovým onemocněním sed tube method for differentiating homozygotes and heterozygotes. Clin Chem 49:396 406, 2003 43. Simi L, Pratesi N, Vignoli M, et al: Highresolution melting analysis for rapid detection of KRAS, BRAF, and PIK3CA gene mutations in colorectal cancer. Am J Clin Pathol 130:247 253, 2008 44. Takano T, Ohe Y, Tsuta K, et al: Epidermal growth factor receptor mutation detection using high resolution melting analysis predicts outcomes in patients with advanced non small cell lung cancer treated with gefitinib. Clin Cancer Res 13:5385 5390, 2007 45. Do H, Krypuy M, Mitchell PL, et al: High resolution melting analysis for rapid and sensitive EGFR and KRAS mutation detection in formalin fixed paraffin embedded biopsies. BMC Cancer 8:142, 2008 46. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, et al: Analysis of any point mutation in DNA: The amplifi cation refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res 17:2503 2516, 1989 47. Fox JC, England J, White P, et al: The detection of K ras mutations in colorectal cancer using the amplification refractory mutation system. Br J Cancer 77:1267 1274, 1998 48. Whitcombe D, Theaker J, Guy SP, et al: Detection of PCR products using self probing amplicons and fluorescence. Nat Biotechnol 17:804 807, 1999 49. Thelwell N, Millington S, Solinas A, et al: Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids Res 28:3752 3761, 2000 50. Ahmadian A, Ehn M, Hober S: Pyrosequencing: History, biochemistry and future. Clin Chim Acta 363:83 94, 2006 51. Poehlmann A, Kuester D, Meyer F, et al: K ras mutation detection in colorectal cancer using the Pyrosequencing technique. Pathol Res Pract 203: 489 497, 2007 52. Gautschi O, Huegli B, Ziegler A, et al: Originand prognostic value of circulating KRAS mutations in lung cancer patients. Cancer Lett 254:265 273, 2007 www.jco.org 2009 by American Society of Clinical Oncology 57