ÚLOHY AKTIVNÍHO A PASIVNÍHO VYHÝBÁNÍ SE MÍSTU: SLIBNÉ NÁSTROJE V KOGNITIVNÍCH NEUROVĚDÁCH ACTIVE AND PASSIVE PLACE AVOIDANCE TASKS: PROMISING TOOLS IN COGNITIVE NEUROSCIENCE Aleš Stuchlík Fyziologický ústav Akademie věd České Republiky, Praha SOUHRN Mechanizmy prostorové orientace patří k nejstudovanějším oblastem kognitivních neurovědeckých disciplin posledních desetiletí. Nedávno byly vyvinuty dvě nové metody pro experimentální zkoumání prostorové navigace: aktivní a pasivní vyhýbání se místu. Při aktivním vyhýbání se místu se potkan pohybuje po rotující aréně, na které je v souřadnicovém systému místnosti definován zakázaný sektor, jehož navštívení je potrestáno elektrickým šokem. Potkan tak musí být stále aktivní, rozpoznat zakázané místo v prostoru, aktivně se mu vyhýbat a nenechat se do něj pasivně přemístit rotací arény. V úloze pasivního vyhýbání se místu je sektor definován v souřadnicovém systému rotující arény, ale pokud je aréna stabilní, je definován shodně v souřadnicových systémech arény i místnosti. V závěru článek představuje vybrané poznatky získané za použití popisovaných technik. Klíčová slova: aktivní vyhýbání se místu, pasivní vyhýbání se místu, hipokampus, prostorová orientace SUMMARY Mechanisms of spatial orientation belonged to the most studied fields in cognitive neuroscience in past years. Recently, two novel place navigation tests were designed: active and passive place avoidance. During active place avoidance, rat moves on a rotating arena and avoids a sector (defined in the coordinate frame of the room), entering of which is punished by a footshock. In the passive place avoidance task, the shock sector is defined in the coordinate frame of the rotating arena, but in case that arena is stable, the shock sector is defined concordantly in the coordinate frame of the room and arena. Paper also presents several interesting findings obtained using place avoidance tasks. Keywords: active place avoidance, passive place avoidance, hippocampus, spatial navigation Stuchlík A. Úlohy aktivního a pasivního vyhýbání se místu: slibné nástroje v kognitivních neurovědách. Psychiatrie 2004;8(1):17 20. Úvod
Studium prostorového chování potkanů coby modelu vyšších kognitivních funkcí zaujímá v experimentálních kognitivních vědách důležité místo. V minulých desetiletích byla vyzkoušena řada prostorových bludišť a úloh, umožňujících detekovat a kvantitativně i kvalitativně popisovat změny prostorového chování v důsledku farmakologických zásahů, lézí, genových manipulací apod. V nedávné době byly navrženy dvě nové prostorové úlohy: aktivní a pasivní vyhýbání se místu (active and passive place avoidance). Jejich podstata vychází z principu klasických metod experimentální psychologie, a to aktivního a pasivního vyhýbání (active and passive avoidance). Metoda pasivního vyhýbání je založena na předpokladu, že pokud je nějaká biologicky pravděpodobná či spontánní reakce zvířete ukončena nepříjemným averzivním stimulem, zvíře bude mít tendenci tuto reakci potlačit. Latence této reakce, která se s postupujícím tréninkem zvyšuje, odráží sílu paměťové stopy. Typickým příkladem takovéto úlohy je tzv. step-down avoidance, kdy je zvíře posazeno na kruhovitou vyvýšenou platformu, ze které má přirozenou tendenci slézt na podložku, kde však dostane mírnou elektrickou ránu do končetin. Následující den se měří latence od položení zvířete na platformu do sestupu na podložku, která se v případě, že si zvíře tuto úlohu osvojí, oproti předešlému dni podstatně prodlouží. Úloha aktivního vyhýbání naopak vyžaduje po zvířeti, aby vykonalo specifickou činnost, např. pohyb, s cílem vyhnout se potrestání. Typickým příkladem úlohy tohoto typu je např tzv. two-way shuttle box, kde zvíře musí opakoveně přebíhat mezi dvěma kompartmenty, aby se vyhnulo elektrickému šoku. Tyto úlohy v sobě obsahují velice silnou averzivní motivační složku a jsou často využívány ve studiích zkoumajících pamatování si kontextu dané úlohy. Nedávno byly na základě těchto úloh zkonstruovány jejich prostorové verze, tedy úlohy pasivního a aktivního vyhýbání se místu. Tyto úlohy vlastně vycházejí z uspořádání open-field (testu spontánní pohybové aktivity pokusného zvířete ve vymezeném novém prostředí), protože se při nich zvířata pohybují ve vymezené, zpravidla kruhovité aréně, a umožňují in vivo elektrofyziologickou registraci aktivity místních neuronů a neuronů směru hlavy, což jsou nervové buňky, které generují akční potenciály pouze pokud se zvíře nachází v určité části prostoru, respektive pokud se dívá určitým definovaným směrem (Muller a Kubie, 1987; Taube et al., 1998; Cimadevilla et al., 2000a; Cimadevilla et al., 2001b; přehled viz Stuchlík, 2003). Zatím byly vyvinuty arény pro testování laboratorních potkanů a myší. Aktivní a pasivní vyhýbání se místu s potravově motivovanou lokomocí Při této úloze se potravově deprivované zvíře (krmené na 85 90 % hmotnosti při kvantitativně omezeném příjmu potravy) pohybuje po otevřené kruhovité aréně a sbírá malé potravové kuličky, které dopadají v pravidelných intervalech do různých míst arény. Zároveň je nuceno vyhýbat se sektoru definovanému buď v souřadnicovém systému arény, nebo v souřadnicovém systému místnosti. Pokud se aréna otáčí a sektor je definován v koordinátách místnosti, jedná se o aktivní alotetické vyhýbání se místu. Aktivní proto, že pokud by potkan pouze pasivně seděl, byl by zavezen do zakázané oblasti pouhou rotací arény, a alotetické proto, že k pamatování si polohy zakázané oblasti musí potkan používat, tzv. alotetické orientační body, tedy vzdálené orientační značky v místnosti, jejichž vzájemnou polohu vzhledem ke své vlastní poloze a k poloze zakázaného místa si zvíře ukládá do mozkové reprezentace okolního prostředí, tzv. kognitivní mapy (přehled viz Stuchlík, 2003). Pokud jsou aréna i sektor stabilní, jedná se o pasivní vyhýbání se místu a subjekt může k jeho vymezení používat jednak alotetickou informaci, jednak tzv. substrátovou idotezi, která je představována syntézou vnitřích podnětů generovaných během vlastní lokomoce a ke tvorbě zpátečního vektoru vedoucího k výchozímu bodu trajektorie zvířete (přehled viz Stuchlík, 2003). Aréna se může rovněž otáčet společně se sektorem v naprosté temnotě, potom zvíře může používat k vymezení zakázaného sektoru pouze substrátovou idiotezi, eventuálně podporovanou místními alotetickými značkami (např. výkaly). V každé z uvedených modifikací této úlohy se však jedná o konflikt dvou motivací: apetitivní (sbírání potravy) a averzivní (elektrické šoky). Aktivní a pasivní vyhýbání se místu bez potravově motivované lokomoce
V tomto případě je zvíře umístěno na stabilní, popřípadě rotující arénu, na které je zakázaný sektor definován v souřadnicovém systému místnosti. Pokud je aréna stabilní, je úloha velice podobná prostému pasivnímu vyhýbání, avšak toto místo není nijak přímo perceptibilní, na rozdíl od klasické verze. Pokud se aréna otáčí, zvíře musí neustále monitorovat svoji vzdálenost od zakázané oblasti tím, že sleduje okolní alotetické orientační body a vytváří si tzv. kognitivní mapu prostředí, ve které jsou zaneseny prostorové vztahy mezi aktuální pozicí zvířete, orientačními body a polohou zakázané oblasti. V těchto případech nemusí být zvířata potravově deprivována, určující je zde motivace averzivní. Experimentální aréna Schéma pokusného uspořádání je znázorněno na obrázku 1. Experimentální aréna byla umístěna v místnosti o velikosti 4 3 metry, která obsahovala nejrůznější objekty a povrchy jako orientační body (dveře, zaslepené okno, police atd.). Kruhovitá aréna (80 cm v průměru) vyrobená z hliníkového plechu byla vyvýšena 60 cm nad podlahou. Pod arénou byl umístěn motor, který mohl arénou otáčet rychlostí 1 otáčky za minutu. Okolo arény byla umístěna průhledná plastiková stěna vysoká 40 cm. Podlážka arény byla uzemněna. Monitorovací systém a systém elektrických šoků Infračervená televizní kamera umístěná na stropě místnosti nad arénou a připojená k obslužnému počítačovému systému sledovala pohyb dvou infračervených světlo emitujících diod (LEDs), jedné umístěné na zvířeti a druhé na periferii arény. Indikace otáčení arény pomocí diody umístěné na aréně umožňovala vypočítat trajektorii zvířete v souřadnicovém systému místnosti, ale také rotující arény, jak by ji spatřovala fiktivní virtuální kamera rotující společně s arénou. Souřadnice zvířete byly odečítány s frekvencí 10 Hz a zapisovány do počítačových souborů. Elektrické šoky (střídavý proud, 50 Hz, délka trvání pulzu 0,5 s, intenzita» 0,5mA) byly dodávány přes smyčku z nízkoimpedančního drátku, implantovanou v podkoží mezi lopatkami zvířete. Protože nejvyšší napěťový spád je v místech, kde se zrohovatělá kůže končetin dotýká uzemněné podložky, potkan zde cítí elektrický šok s nejvyšší intenzitou. Pokud zvíře po prvním šoku neopustilo zakázanou oblast, byl šok opakován ve dvousekundových intervalech.
Výběr hodnocených parametrů Celková lokomoční aktivita zvířat během experimentálního sezení byla měřena pomocí celkové vzdálenosti ušlé během jednoho sezení. Ta reflektuje aktivní lokomoci, která je u pasivního vyhýbání se místu nezbytným kritériem pro přijetí do hodnocení výsledků. Pokud se zvíře pohybuje po rotující aréně, je třeba odečíst od celkové lokomoce komponentu způsobenou pasivní rotací arény. Pokud zvíře není lokomočně aktivní, nemají výsledky žádnou vypovídající hodnotu o jeho schopnosti orientovat se vzhledem k zakázané oblasti. Zpravidla je stanoveno minimální kritérium ušlé vzdálenosti (např. 40 m) pro přijetí do analýzy výsledků. Dalším parametrem, který již hodnotí schopnost prostorové orientace v této úloze, je počet chyb, tj. vstupů do zakázané oblasti. Ten zpravidla pozitivně koreluje s celkovou lokomoční aktivitou a je možno jej normalizovat vydělením celkové délky trajektorie počtem vstupů do zakázané oblasti, čímž obdržíme průměrnou vzdálenost ušlou mezi dvěma vstupy. Dalším důležitým parametrem je počet šoků navíc, tedy těch, které byly aplikovány, pokud potkan neopustil okamžitě po prvním šoku zakázanou oblast. Zvýšený počet těchto šoků naznačuje neschopnost zvířete vybavit únikovou reakci (escape reaction). Dále je možno vyhodnocovat časovou latenci první chyby, dráhu do první chyby, maximální dobu úspěšného vyhýbání a další parametry, jimiž se z úsporných důvodů zde nebudeme zabývat. Typická ukázka trajektorie potkana ve 30minutovém sezení při aktivním alotetickém vyhýbání se místu je znázorněna na obrázku 2.
Některé zajímavé nálezy získané použitím úloh aktivního a pasivního vyhýbání se místu Fylogeneticky stará část mozku zvaná hipokampus je klíčovým centrem pro ukládání a vybavování prostorových informací. V této struktuře se pravděpodobně vytváří tzv. kognitivní mapa prostředí, tedy registr informací o prostorových vztazích mezi jednotlivými orientačními body v prostoru a o aktuální poloze zvířete (O Keefe a Nadel, 1978). Permanentní léze či funkční vyřazování dorzálního hipokampu (např. pomocí mikroinjekce tetrodotoxinu) patří k metodám, jak zabránit funkční manifestaci alotetické orientace např. v Morrisově vodním bludišti (Morris et al., 1982). Zde je namístě vysvětlit, že Morrisovo vodní bludiště je kruhovitý bazén naplněný vodou zakalenou mléčnou barvou, ve kterém plovoucí potkan, vypouštěný v opakovaných plavbách z periferie bazénu, hledá za použití své kognitivní mapy ostrůvek ukrytý pod hladinou vody na některém místě bazénu. Polohu ostrůvku si zvíře může pamatovat jen pomocí jeho prostorových vztahů k orientačním bodům umístěným vně bazénu (přehled viz Stuchlík, 2003). Nedávno bylo prokázáno, že oboustranná inaktivace hipokampu tetrodotoxinem vede k signifikantnímu deficitu navigace v alotetickém pasivním vyhýbání se místu (Ježek et al., 2002; Cimadevilla et al., 2000a). To je v souladu s předpokládanou pozicí hipokampu jako struktury esenciální pro úspěšnou prostorovou orientaci. Překvapujícím nálezem však bylo zjištění, že i jednostranná inaktivace dorzálního hipokampu poškodila orientaci v alotetickém vyhýbání se místu, a to jak ve fázi iniciálního učení, tak ve fázi vybavení již intaktně naučené paměťové stopy (Cimadevilla et al., 2001b). Tento nález je v určitém rozporu s výsledky studie Mosera a Moserové (1998), které ukázaly, že zvířata, která měla zachováno pouze 60 % objemu hipokampu bilaterálně, byla schopna se naučit novou polohu ostrůvku v Morrisově vodním bludišti. V této studii bylo zároveň ukázáno, že pokud bylo zachováno více než 70 % dorzálního hipokampu, zvířata byla stále schopna vybavit si polohu ostrůvku naučenou před hipokampální lézí. Je možné, že neschopnost vykonávat efektivně úlohu alotetického aktivního vyhýbání se místu pouze s jedním funkčním hipokampem souvisí s neschopností rozlišovat mezi souřadnicovými rámci prostorové navigace, jmenovitě mezi alotetickým (určeným prostorovými vztahy mezi okolními orientačními body) a substrátově idiotetickým (definovaným pomocí vnitřních proprioreceptivních a vestibulárních podnětů zvířete; přehled viz Stuchlík, 2003), přičemž oba tyto rámce jsou v úloze aktivního alotetického vyhýbání
se místu funkční, ale produkují informace, které jsou v nesouladu. Dalším zajímavým nálezem, získaným v naší laboratoři za pomoci techniky aktivního a pasivního vyhýbání se místu, bylo zjištění, že transgenní myši, kterým byl experimentálně vpraven gen pro humánní beta-amyloid prekurzor protein1 (A/beta; který se normálně vyskytuje v mozku pacientů s Alzheimerovou chorobou, kde formuje tzv. senilní plaky) vykazují výrazný deficit v alotetické verzi Morrisova vodního bludiště, ale méně výrazný deficit jak v aktivním, tak v pasivním vyhýbání se místu, který se u nich objevuje později v průběhu stárnutí (Koistinaho et al., 2001). Tento nález podporuje současnou představu o důležitosti role A/beta v expresi demence u Alzheimerovských pacientů. V nedávné studii jsme také zjistili, že učení se aktivnímu alotetickému vyhýbání se místu je kriticky závislé na NMDA receptorech. Pokud byla potkanům hodinu před experimentálním sezením systémově aplikována látka MK-801 (dizolcipin), nebyli schopni lokalizovat přesně polohu zakázané oblasti (což se projevilo zvýšeným počtem chyb) a navíc se u nich projevila hyperlokomoce (manifestovaná prodloužením celkové dráhy ušlé za jedno sezení; Stuchlík, nepublikované výsledky). Závěr Nově navržené úlohy aktivního a pasivního vyhýbání se místu představují slibné nástroje pro studium mechanizmů prostorové orientace, včetně možností jejího ovlivnění farmakologickými zásahy, mozkovými lézemi či inaktivacemi, genovými manipulacemi apod. Oproti klasickému Morrisovu vodnímu bludišti tyto úlohy lze poměrně snadno kombinovat s elektrofyziologickým zaznamenáváním mozkové aktivity a zároveň studovat jednotlivé referenční koordinátové rámce orientace a interakce mezi nimi. Zvláště neprobádanou a zájem vzbuzující oblastí výzkumu v tomto směru zůstává substrátově idiotetické vyhýbání se místu a jeho nervové mechanizmy. Tato práce byla podpořena grantem GAČR 309/03/P126 a výzkumným záměrem AVOZ 5011922. Za kritické pročtení rukopisu a cenné připomínky velmi děkuji MUDr. Janu Burešovi, DrSc. RNDr. Aleš Stuchlík PhD. Oddělení neurofyziologie paměti Fyziologický ústav Akademie věd České Republiky Vídeňská 1083 142 20 Praha 4 Krč do redakce došlo: 5. června 2003 přijato k publikaci: 26. ledna 2004 LITERATURA Cimadevilla JM, Fenton AA, Bures J. Functional inactivation of dorsal hippocampus impairs active place avoidance in rats. Neurosci Lett 2000a;285(1):53 56. Cimadevilla JM, Fenton AA, Bures J. New spatial cognition tests for mice: passive place avoidance on stable and active place avoidance on rotating arenas. Brain Res Bull 2001b;54(5):559 563. Cimadevilla JM, Kaminsky Y, Fenton A, Bures J. Passive and active place avoidance as a tool of spatial memory research in rats. J Neurosci Methods 2000a;102(2):155 164.
Cimadevilla JM, Wesierska M, Fenton AA, Bures J. Inactivating one hippocampus impairs avoidance of a stable room-defined place during dissociation of arena cues from room cues by rotation of the arena. Proc Natl Acad Sci USA 2001b;98(6):3531 3536. Jezek K, Wesierska M, Fenton AA. Hippocampus-dependent retrieval and hippocampus-independent extinction of place avoidance navigation, and stress-induced out-of-context activation of a memory revealed by reversible lesion experiments in rats. Physiol Res 2002;51:35 47. Koistinaho M, Ort M, Cimadevilla JM, Vondrous R, Cordell B, Koistinaho J, Bures J, Higgins LS. Specific spatial learning deficits become severe with age in beta -amyloid precursor protein transgenic mice that harbor diffuse beta-amyloid deposits but do not form plaques. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:14675 14680. Morris RGM, Garrud P, Rawlins J. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesions. Learn Motiv 1981;297:681 683. Moser MB, Moser E. Distributed encoding and retrieval of spatial memory in the hippocampus. J Neurosci 1998; 18:7535 7542. Muller RU, Kubie JL. The effects of changes in the environment on the spatial firing of hippocampal complex-spike cells. J Neurosci 1987; 7:1951 1968. O Keefe J, Nadel L. The hippocampus as a cognitive map. Oxford: Clarendon Press, 1978. Stuchlík A. Prostor a prostorová orientace. Čes Fyziol 2003;52:22 33. Taube JS. Head direction cells and the neurophysiological basis for a sense of direction. Progr Neurobiol 1998;55:225 256.