ABSORPČNÍ A LUMINISCENČNÍ SPEKTROMETRIE V UV/Vis OBLASTI SPEKTRA -2014 ABSORPČNÍ SPEKTROMETRIE ACH/IM 1
Absorpce záření ve Vis oblasti Při dopadu bílého světla na vzorek může být záření zcela odraženo látku vidíme jako bílou; nebo zcela pohlceno látku vidíme jako černou. Pokud vzorek část záření pohltí a část odrazí barva látky viditelná pro lidské oko odpovídá barvě odraženého záření (tzv. doplňková barva). (nm) Pohlcená barva Doplňková barva 400-435 fialová žlutozelená 435-480 modrá žlutá 500-560 zelená červeno-purpurová 560-580 žlutozelená fialová 580-595 žlutá zelená 595-610 oranžová zelenomodrá 620-760 červená modrozelená Molekulové orbitaly (MO) MO LCAO (Molecular Orbital Linear Combination of Atomic Orbitals) popisuje vznik MO pomocí lineární kombinace atomových orbitalů (AO). K tomu dojde prostorovým překryvem AO atomů. Ze dvou AO se vytvoří 2 MO: vazebný a protivazebný: 2 typy vazebných orbitalů (σ, π) 2 typy protivazebných orbitalů (σ*, π*) 1 nevazebný orbital (n); n* neexistuje, protože n orbitaly se nepodílí na vazbě! HOMO a LUMO: nejvyšší obsazený molekulový orbital (Highest Occupied Molecular Orbital) a nejnižší neobsazený molekulový orbital (Lowest Unoccupied Molecular Orbital). Energetický rozdíl mezi těmito orbitaly charakterizuje schopnost excitace molekuly, čím je nižší, tím je jednodušší molekulu excitovat. ACH/IM 2
Teoretický základ Za normálních podmínek se molekula nachází v základním elektronovém stavu E 0 =E e +E v +E r. Pohlcením fotonu záření z UV/Vis oblasti se změní elektronová konfigurace nebo spin e - a molekula přejde do excitovaného stavu. Zde setrvá cca 10-15 s a přechází do základního stavu deaktivačními procesy. ΔE = E 1 -E 0 = hν = ΔE e + ΔE v + ΔE r. ΔE e ~ 150-600 kj.mol -1, ΔE v ~ 2-60 kj.mol -1, ΔE r ~ 3 kj.mol -1 E Teoretický základ Povolené přechody Symetricky zakázané přechody ACH/IM 3
Teoretický základ Intenzita pásů (dle kvantové mechaniky): 1. Přechody dovolené ze základní singletové do excitované singletové hladiny; max 10 4 10 5 l.mol -1.cm -1 2. Přechody spinově zakázané málo pravděpodobné přechody ze základní singletové do excitované tripletové hladiny; max 10 0 l.mol -1.cm -1 3. Přechody symetricky zakázané max 10 2 l.mol -1.cm -1 ; vibrace jader molekuly vede k diferenci v rozdělení e - a tím ke změně dipólového momentu molekuly a přechodu e -. Elektronové přechody v organických molekulách: Elektronové přechody v organických molekulách n uvedeme společně, chemické skupiny často obsahují jak takne -, oba typy přechodů přispívají k tvorbě absorpčních pásů. Přechody jsou relativně nezávislé na atomech spojených s dvojnou vazbou, jsou dovolené a intenzivní: 10 3-10 5 l.mol -1.cm -1. Přechody n jsou symetricky zakázané a nejsou příliš intenzivní ( 10-10 2 l.mol -1.cm -1 ), jejich absorpční maximum je silně závislé na druhu atomu (poloha n e - je silně závislá ne elektronegativitě heteroatomu). vytvářejí jednoduché vazby alifatické uhlovodíky. Prakticky nepoužívané vzhledem ke krátkým (nutno pracovat ve vakuu). n poskytují substituenty s nevazebnými e - nasycené sloučeniny se S, N, Br, I, které absorbují do 200 nm a O a Cl, které absorbují nad 200 nm. ACH/IM 4
Elektronové přechody v organických molekulách Chromofor funkční skupina v molekule odpovědná za absorpci záření v UV a Vis oblasti. Obecně lze říci, že skupiny s e - jsou chromofory pro UV a Vis oblast a skupiny se e - pro dalekou UV oblast. Auxochrom funkční skupina, která není chromoforem, ale zvyšuje (mění) účinek chromoforů. působuje posun absorpčních maxim chromoforů a zvyšují intenzitu pásů, př.: OH, NH 2, halogenidy. Bathochromní (červený) posun k delším. Hypsochromní (modrý) posun ke kratším Hyperchromický efekt zvýšení intenzity absorpce. Hypochromní efekt snížení intenzity absorpce. Vliv prostředí na absorpční spektrum Vliv rozpouštědla při rozpouštění se může měnit elektronová struktura rozpouštěné látky, což se projeví posunem λ max nebo ε. Podstatný je vliv polarity rozpouštědla a tvorba vodíkových vazeb. Polarita minimálně ovlivňuje absorpci chromoforů C CaC C. Polarita výrazně ovlivňuje λ max upřechodů n π* an σ* (polární chromofory C O, -NO 2, -COOH, -NH 2 ). Měřením spekter vzorku v různých rozpouštědlech lze rozlišit pásy n π* an σ* odπ π*, protože v polárnějším rozpouštědle se posouvají maxima prvních dvou ke kratší vlnové délce. Nepolární rozpouštědla spektra s ostrými maximy. Vliv ph posun λ max se projeví, když se se změnou ph mění charakter chromoforu, např. -NH 2, -COOH, -OH. Může docházet i ke změně intenzity pásu. ACH/IM 5
UV-Vis spektrometrie koordinačních sloučenin a anorganických iontů Přenos náboje: dvojice anorganických látek, či organické + anorganické látky, kde jedna se chová jako donor a druhá jako akceptor elektronů. Vzájemně reagují s výměnou elektronů a vzniku komplexu D-A. Absorpce záření komplexem D-A se projeví novým absorpčním pásem (,n ) D-A + h D + -A - Intenzivní přechody v UV: 10 3-10 4 l.mol -1.cm -1 Př: Fe 3+ s fenantrolinem, Fe 3+ Fe(SCN) 2+, komplexy fenolů scu 2+ čife 3+. Spektrum Fe 3+ s o-fenantrolinem UV-Vis spektrometrie koordinačních sloučenin přechodných kovů Přenos v ligandovém poli: Méně intenzivní přechody zejména ve Vis oblasti 10-1 -10 2 l.mol -1.cm -1. Volný ion přechodového kovu = všechny d orbitaly mají stejnou E (jsou degenrovány); působením ligandu dochází k rozštěpení na 2 nebo více hladin s rozdílnou E, což umožňuje absorpci fotonu. Rozdíl vzniklých energetických hladin závisí na síle elektrostatického pole ligandu. Př.:[Cu(H 2 O) 6 ] 2+ absorbuje při 790 nm, či [Fe(CN) 6 ] 3-. ACH/IM 6
INSTRUMENTACE KOLORIMETR(ie) vizuální porovnávání intenzity zbarvení vzorku a standardu nebo řady standardů. FOTOMETR(ie) objektivní měření prošlého toku záření: FOTOMETR barevný filtr k vymezení. SPEKTROFOTOMETR obsahuje monochromátor. INSTRUMENTACE Zdroje záření: D 2 výbojka s W žárovkou; Xe vysokotlaká výbojka Detektory: fotonásobič, CCD Materiál kyvet: sklo, křemen, plast ACH/IM 7
Aplikace UV-Vis spektrometrie Kvalitativní analýza Kvantitativní analýza: Analýza anorganických solí např. kyanidy, amonné ionty, fluoridy. Př.: fosforečnany reakce s (NH 4 ) 2 MoO 4 a SnCl 2 vzniká molybdenová modř aměří se absorbance při 690 nm. Analýza nízkých koncentrací kovů Cu, Hg, Al, Zn, Př.: stanovení Fe po reakci s o-fenanthrolinem v kyselém prostředí. Stanovení organických látek př. fenoly. Aplikace v klinické analýze: cholesterol v séru, kyselina močová, glukóza, celkové proteiny v séru, Průmyslové aplikace: farmaceutický, potravinářský, sklářský, výroba barev. Další vybrané aplikace: stanovení látek ve směsi, titrace, studium komplexů. Stanovení 2 látek ve směsi Je možné provést díky aditivním vlastnostem Lambert- Beerova zákona. Proměřením čistých látek získáme jejich ε při dvou zvolených vlnových délkách. Proměříme směsný vzorek, př: stanovení Fe 3+ acu 2+ ve směsi po reakci s Ru(CN 6 ) 4- Pavel Šiman, FAF UK ACH/IM 8
Studium komplexů Jobova metoda (metoda kontinuálních variací) Slouží k určení stechiometrického složení a podmíněné konstanty stability komplexu: M + yl ML y Měří se série roztoku s konstantním n tot a proměnným n M a n L (ekvimolární roztoky): n tot = n M + (n L ) i (n L) i (X L ) i n tot X 1 (X ) M L i Maximum Abs je dosaženo pro stechiometrické složení komplexu. Je-li to možné měříme při, kde absorbuje pouze komplex. X X L L y X M 1 X L X L = 0,75 y = 3 ML 3 X L = 0,5 y = 1 ML X L = 0,67 y = 2 ML 2 Spektrofotometrické titrace Určování BE na základě změny absorbance s přídavkem titračního činidla. Tento způsob titrace je experimentálně jednoduchý a má uspokojivou přesnost. Titrační křivky: A. Absorbuje pouze titrační činidlo (titrace s uvolňováním Br 2,I 2 ). B. Absorbuje produkt titrační reakce. C. Absorbuje pouze titrovaná látka (stanovení Pb titrací chelatonem uvolňování xylenové oranže z komplexu s Pb). ACH/IM 9
(FOTO)LUMINISCENČNÍ SPEKTROMETRIE (Emisní spektrometrie) Teorie fotoluminiscence Jde o emisi záření látkou, které bylo před tím absorbováno. Dělení: FLUORESCENCE, FOSFORESCENCE. Návrat látky z excitovaného (doba života excitovaného stavu 10-5 10-9 s) do základního stavu relaxace: Vibrační (nezářivá) deaktivace nadbytek E uvolněn ve formě tepla Emise nadbytek E uvolněn jako foton (zářivá deaktivace) Relaxace pomocí fotochemické reakce: A * X + Y Elektronové stavy organických molekul se dělí na: singletový základní i excitovaný, opačné spiny obou e -, tripletový pouze excitovaný, stejné spiny dvou e -, dubletový lichý e - u volného radikálu, který může zaujmout 2 orientace. ACH/IM 10
Teorie fotoluminiscence FLUORESCENCE: emise fotonu při přechodu z S 1 (ojediněle z S 2 ) do základního stavu S 0. Doba života excitovaného stavu (za jakou dobu dojde k emisi) závisí na při absorpci záření: pro 10 4 10 5 l.mol -1.cm -1 je doba 10-7 10-9 s, pro 10 1 10 2 l.mol -1.cm -1 je doba 10-5 10-6 s. Fluorescence odeznívá velmi rychle po ukončení excitace (vypnutí zdroje excitačního záření). FOSFORESCENCE: emise fotonu při přechodu z T 1 na S 0. Doba života excitovaného T stavu je 10-4 10 2 s fosforescenční záření sledujeme delší dobu po ukončení excitace. Elektron po absorpci záření nejprve přejde z S 1 na T 1 (přechod z S 0 na T 1 je zakázaný)! Teorie fotoluminiscence Schéma zářivých a nezářivých přechodů fotoluminiscentní molekuly (Jablonského diagram) VR vibrační relaxace (vibrational relaxation) IC vnitřní konverze (internal conversion) ISC mezisystémový přechod (intersystem crossing) ACH/IM 11
Deaktivační procesy v molekulách Preferovaný přechod do základního stavu je ten, který minimalizuje dobu života excitovaného stavu! Nezářivá deaktivace Vibrační relaxace rychlý proces (10-12 s), molekula ve vyšším vibračním stavu snižuje svou E přechodem na nejnižší vibrační podhladinu excitovaného (i základního) stavu. Vnitřní konverze molekula na nejnižší vibrační podhladině excitovaného stavu přechází do vyšší vibrační podhladiny nižšího energetického stavu. Kombinací těchto dvou přechodů může molekula přejít z excitovaného do základního stavu bez emise fotonu! Vnější konverze nadbytek E je předán rozpouštědlu či jiné složce matrice. Mezisystémový přechod molekula na nejnižší vibrační podhladině excitovaného stavu přechází na vysokou energetickou podhladinu stavu s nižší E a jiným spinem. Zářivé deaktivace: fluorescence a fosforescence Frank-Condonův princip Elektronové přechody jsou velmi rychlé (10-15 s). Frank- Condonův princip umožňuje pochopit podstatu elektronových přechodů. Hmotnost atomových jader je několik řádů větší než hmotnost elektronu a vzájemný pohyb jader atomů v molekule (vibrace molekuly) je pomalejší (10-12 s). Přechody elektronů z jednoho stavu do druhého jsou rychlejší než rychlost změny délky vazby mezi atomy absorbující molekuly. Tzn., že vzdálenost jader atomů je konstantní po dobu excitace elektronu. Vzhledem k tomu, že molekuly stále vibrují a nacházejí se v různých vibračních stavech, výsledné spektrum bude superpozicí všech přechodů a bude mít pásový charakter. ACH/IM 12
Frank-Condonův princip Potenciálové jámy s vibračními podstavy. Minimum křivky potenciální energie odpovídá rovnovážné vzdálenosti mezi oběma atomy. Vysvětlení vibronických přechodů z hlediska kvantové chemie, nejpravděpodobnější na ten vibrační podstav, kde je největší překryv se základním.. Fluorescence Lze ji pozorovat pouze pokud je účinnějším prostředkem deaktivace než nezářivé přechody. Intenzita fluorescence I F : ( F = N F /N flourescenční výtěžek) IF k F(P0 PT ) IF 2,303k FP0 bc Z Lambertova Beerova zákona I F roste s F, P 0, a koncentrací. Vliv teploty a viskozity rozpouštědla na F. Fluorescenční přechod může skončit na různých vibračních podhladinách S 0 pásové spektrum. Ke fluorescenci dochází z nejnižší podhladiny S 1, nezáleží na tom, zda byla molekula excitována do S 1 nebo do vyšších singletových hladin (např.s 2 ). P bc T P0 10 ACH/IM 13
Excitační a emisní spektra VLIV STRUKTURY NA LUMINISCENCI 1. Luminiscenci neposkytují nasycené uhlovodíky a zřídka nenasycené alifatické uhlovodíky. 2. Intenzivní F: aromatické uhlovodíky s nízkoležícími S stavy *. 3. P vykazují aromatické sloučeniny s C=O nebo heteroatomy. 4. Vliv substituce aromatického jádra na F: -NO 2, -OH, 5. Aromáty s halogen substituenty zvyšují P asnižují F. 6. Luminiskují zejména velké a pevné rovinné molekuly s rigidní strukturou. Souvislost absorpčních a emisních spekter Luminiscence začíná na nejnižší vibrační podhladině S 1 (T 1 ) E emit je menší než E abs. Luminiscence se objevuje u vyšších než absorpce. Luminiscenční spektrum bývá zrcadlovým obrazem absorpčního. Mohou se protínat v 0. 0 odpovídá nejmenší E pro absorpci a je v absorpčním spektru nejintenzivnější. ACH/IM 14
Instrumentace - fluorescence 2 typy fluorescenčních spekter: 1. Excitační: I F v závislosti na budícího záření při konstantní emitovaného záření slouží k určení účinné pro vyvolání fluorescence. 2. Emisní: I F vzávislostina emitovaného záření při konstantní excitačního záření. Fluorimetr: k vymezení slouží filtry; zdroj: Hg výbojka. Spektrofluorimetr: mřížkové monochromátory; zdroj nejčastěji Xe vysokotlaká výbojka (spojité spektrum). Optická dráha mezi zdrojem a detektorem svírá 90. Kyvety: 1 cm, křemen Rozpouštědla: nesmí fluoreskovat. Instrumentace - fosforescence Nutné rozlišit fluorescenci a fosforescenci! PŘÍPRAVA VZORKŮ Kapalné: zmrazení v kapalném N 2 vytvoří opticky čistou pevnou látku (vzorek v rozpouštědle). Pevné: nanesení vzorku na pevný substrát (desky tenkovrstvé chromatografie) možno měřit za laboratorní teploty. ACH/IM 15
Analytické využití KVALITATIVNÍ ANALÝZA: menší využití zejména pro polycyklické aromáty; molekuly s jemnými strukturními rozdíly mají velmi podobná spektra. KVANTITATIVNÍ ANALÝZA: Přímé stanovení polyaromatických uhlovodíků, vitamínůči steroidů. Stanovení aniontů na principu zhášení fluosrescence. Stanovení kovů vytvoření komplexu, př. Al s alizarinovou červení. Fluorescenční detektor pro HPLC. Analytické využití Chemiluminiscence: chemická reakce produkuje molekuly v excitovaném stavu, které emitují fotony. [A] + [B] [excitovaný meziprodukt] [produkty] + h Př.: reakce luminolu s peroxidem vodíku luminol + H 2 O 2 3-aminoftalát* 3-aminoftalát + h Bioluminiscence: k reakcím produkujícím molekuly v excitovaném stavu dochází v biologických systémech, např.světlušky, meduzy, některé ryby. Základní princip je oxidace luciferinu (biologický pigment), při níž se 96 % energie emituje ve formě záření a4%veformě tepla. luciferin + O 2 oxyluciferin + h luminol ACH/IM 16