COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5

COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 HIM PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY IN VITRO. Objednací údaje COBAS AMPLICOR HIM 48 Tests P/N: 21118390 123 HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 ART: 11 1839 0 US: 83369 Účel COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 US: 83314 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 (v1.5) je test založený na amplifikaci nukleové kyseliny in vitro pro stanovení RNA viru lidské imunodeficience typu 1 (HIV-1) v lidské plazmě na přístroji COBAS AMPLICOR Analyzer. Testem je možno HIV-1 RNA stanovit v rozmezí 50 750 000 kopií/ml použitím kombinace dvou postupů přípravy vzorku: postupu Standard a UltraSensitive. Test se používá ve spojení s klinickými údaji a dalšími laboratorními markery postupu nemoci k určování klinické terapie pacientů infikovaných virem HIV-1. Pomocí testu lze posuzovat pacientovu prognózu stanovením výchozí hladiny HIV-1 RNA nebo sledovat účinky antiretrovirové terapie stanovením změn koncentrací HIV-1 RNA v plazmě v průběhu terapie. Hladina HIV-1 RNA stanovená pomocí polymerázové řetězové reakce (Polymerase Chain Reaction, PCR) sloužila jako jeden z výchozích markerů při zrychleném procesu schvalování FDA v případě léčiv s inhibitory proteázy INVIRASE (saquinavir mesylát), CRIXIVAN (indinavir sulfát), NORVIR (ritonavir) a FORTOVASE (saquinavir); léčiv s inhibitory nenukleozidové reverzní transkriptázy VIRAMUNE (nevirapine), SUSTIVA (efavirenz) a ZIAGEN (abacavir) a léčiva s inhibitorem reverzní transkriptázy EPIVIR (lamivudin). COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 není určen plošnému vyšetřování krve či krevních derivátů na přítomnost HIV-1, ani jako diagnostický test k potvrzení infekce virem HIV-1. P/N: 04497813 190 2/2003, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 1/53

Souhrn a výklad testu Virus lidské imunodeficience (HIV) je etiologickým agens syndromu získané imunodeficience (AIDS) 1-3. Infekce virem HIV se může přenést pohlavním stykem, stykem s infikovanou krví či krevními deriváty nebo z infikované matky na plod 4. Do tří až šesti týdnů od expozice viru HIV se u infikované osoby obvykle objevují symptomy podobné chřipce, které jsou spojeny s vysokou hladinou viremie v periferní krvi 5-8. U nejvíce infikovaných osob následuje obvykle v době čtyř až šesti týdnů od prvních symptomů imunitní reakce specifická pro HIV a pokles viremie v plazmě 9,10. Po serokonverzi se u infikovaných osob obvykle dostavuje klinicky stabilní asymptomatická fáze, která může trvat i léta 11-13. Pro asymptomatické období je charakteristická přetrvávající nízká viremie v plazmě 14 a postupné spotřebovávání lymfocytů CD4 + T, což vede k závažné imunodeficienci, četným oportunním infekcím, malignancím a úmrtí 15. Koncentrace virů v periferní krvi je sice během asymptomatické fáze infekce nízká, ovšem replikace a clearance viru jsou dynamické procesy, kde je vysoká hodnota produkce viru a infekce buněk CD4 + vyvážena stejně vysokými hodnotami virové clearance, odumírání infikovaných buněk a doplňování buněk CD4 +, což vede k poměrně stálým hladinám jak plazmatické viremie, tak buněk CD4 +16-18. Kvantitativními měřeními viremie HIV bylo zjištěno, že je možno korelovat zvýšené hladiny viru se zvýšeným rizikem klinického postupu onemocnění virem HIV a že pokles hladiny viru v plazmě může být spojen se sníženým rizikem klinického postupu 19-21. Hladinu viru v periferní krvi je možno stanovit měřením HIV antigenu p24 v séru, kvantitativní kultivací HIV z plazmy nebo přímým měřením virové RNA plazmě použitím metod amplifikace nukleové kyseliny nebo amplifikace signálu 22-26. Antigen p24is je hlavní protein jádra HIV a v séru se vyskytuje buď volný, nebo vázaný na protilátku proti p24. Volný antigen p24 je možno měřit komerční soupravou pro enzymovou imunoanalýzu (EIA), ovšem jako marker virové zátěže má antigen p24 jen omezený význam, protože je zjistitelný jen u 20 % asymptomatických pacientů a u 40 50 % symptomatických pacientů. Citlivost testů na antigen p24 sice zvyšují postupy disociace komplexu antigen-protilátka, ale i tak zůstává tento virový protein u většiny asymptomatických pacientů nezjistitelný 22. Infekční HIV v plazmě se dá vypěstovat naočkováním do mononukleárních buněk aktivované krve (PBMC) od normálních dárců. Stanovuje se očkováním PBMC se sériovým ředěním vzorku plazmy. Pro sledování hladin viru u infikovaných osob má kvantitativní kultivace pouze omezený význam, protože jen malý podíl virových části je infekčních in vitro. U asymptomatických osob je infekční virus často nedetekovatelný 22. HIV RNA v plazmě je možno stanovit metodami amplifikace nukleové kyseliny, například využitím polymerázové řetězové reakce (PCR) 27-29. V testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 se PCR metody využívá k dosažení maximální citlivosti a dynamického rozmezí kvantitativní detekce HIV-1 RNA v plazmě s EDTA nebo ACD jako antikoagulačními činidly 24. 2/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 2/2003, Revision 4.0

HIV-1 MONITOR Princip metody COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 zahrnuje pět základních procesů: přípravu vzorku, reverzní transkripci terčové RNA za tvorby komplementární DNA (cdna) 30, PCR amplifikaci 30 terčové cdna za použití HIV-1-specifických komplementárních primerů, hybridizaci amplifikovaných produktů na oligonukleotidové sondy specifické pro daný terč/terče a detekci amplifikovaných produktů navázaných na sondu kolorimetrickým stanovením. COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 umožňuje současnou reverzní transkripci a PCR amplifikaci RNA HIV-1 a kvantifikačního standardu (QS) HIV-1. Činidlo Master Mix obsahuje primerový pár specifický jak pro HIV-1 RNA, tak pro kvantifikační standard HIV-1 RNA; bylo vyvinuto tak, aby umožňovalo ekvivalentní stanovení subtypů HIV-1 skupiny M. Se vzorky skupiny O funkční charakteristiky testu zjišťovány nebyly. Stanovení virové HIV-1 RNA se provádí pomocí kvantifikačního standardu HIV-1, což je neinfekční RNA transkript, který obsahuje stejná místa pro vazbu primeru jako terčová HIV-1 RNA a jedinečnou oblast pro vázání sondy, díky které se dá amplikon tohoto standardu odlišit od amplikonu HIV-1. Kvantifikační standard HIV-1 se zabudovává do každého jednotlivého vzorku ve známém počtu kopií a prochází společně s terčovým HIV-1 všemi stupni postupu od přípravy vzorku přes reverzní transkripci, PCR amplifikaci, hybridizaci až po detekci a je společně s ním amplifikován. COBAS AMPLICOR Analyzer vypočítává koncentraci HIV-1 RNA v testovaných vzorcích tak, že u každého vzorku porovnává signál HIV-1 se signálem kvantifikačního standardu. Kvantifikačním standardem se kompenzují inhibiční efekty a kontroluje se amplifikační proces tak, aby bylo možno v každém vzorku přesně stanovit HIV-1 RNA. Příprava vzorku Pro COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 se používá jeden ze dvou postupů přípravy vzorku: Standard nebo UltraSensitive. Při postupu Standard se HIV-1 RNA izoluje přímo z plazmy lýzou virových částic pomocí chaotropního činidla s následným vysrážením RNA alkoholem. Při postupu UltraSensitive se virové částice HIV-1 v plazmě nejprve koncentrují vysokorychlostní centrifugací, po které teprve následuje lýza virových částic pomocí chaotropního činidla a vysrážení HIV-1 RNA alkoholem. Do každého vzorku se společně s činidlem pro lýzu zavádí známý počet molekul RNA kvantifikačního standardu. Kvantifikační standard HIV-1 prochází stadii přípravy vzorku, reverzní transkripce, amplifikace a detekce a slouží ke stanovení HIV-1 RNA ve zkušebním vzorku. 2/2003, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 3/53

Reverzní transkripce a PCR amplifikace Volba terče Volba terčové RNA sekvence pro HIV-1 je dána identifikací oblastí v genomu HIV-1, kde se sekvence v maximální míře zachovává. V této souvislosti má pro schopnost detekovat genotyp HIV-1 zásadní význam vhodná volba primerů a sondy. V soupravě COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 se používají primery SK145 a SKCC1B, kterými se definuje sekvence 155 nukleotidů ve vysoce konzervované oblasti HIV-1 gag genu 31. Oblast gag kóduje skupinově specifické antigeny nebo jádrové strukturní proteiny virionu. Gag geny HIV-1 mají obvykle délku 1 500 nukleotidů a v genomu HIV se nacházejí přibližně v polohách 789-2 290. Nukleotidová sekvence primerů je optimalizována tak, aby poskytovala ekvivalentní amplifikaci subtypů HIV-1 skupiny M. Reverzní transkripce Reverzní transkripce a PCR amplifikace se provádí pomocí DNA polymerázy tepelně stálého rekombinantního enzymu Thermus thermophilus (rtth pol). Za přítomnosti manganu a za vhodných pufrovacích podmínek vykazuje rtth pol aktivitu jak reverzní transkriptázy, tak DNA polymerázy 30. Díky tomu může reverzní transkripce a PCR amplifikace probíhat v téže reakční směsi. Zpracované vzorky se přidávají do amplifikační směsi v amplifikačních zkumavkách (A-zkumavkách), kde probíhá jak reverzní transkripce, tak PCR amplifikace. Downstream čili antisense primer (SKCC1B) i upstream neboli sense primer (SK145) jsou na 5'-koncích biotynylovány. Reakční směs se zahřívá, aby se downstream primer napojil na terčovou RNA HIV-1 a na kvantifikační standard RNA HIV-1. Za přítomnosti Mn 2+ a nadbytku deoxynukleosid-trifosfátů (dntps), včetně trifosfátu deoxyadenosinu, deoxyguanosinu, deoxycytidinu, deoxyuridinu a deoxythymidinu, prodlužuje rtth pol napojený primer a vytváří řetězec DNA (cdna) komplementární k terčové RNA. Amplifikace terče Po reverzní transkripci terčové RNA HIV-1 a RNA kvantifikačního standardu RNA HIV-1 se reakční směs zahřívá, aby se RNA:cDNA hybrid denaturoval a odhalily se terčové sekvence primeru. Během ochlazování směsi se upstream primer (SK145) napojuje specificky na řetězec cdna, rtth pol primer prodlužuje a syntetizuje se druhý řetězec DNA. Tím se uzavírá první cyklus PCR, poskytující dvouřetězcovou DNA kopii terčové oblasti RNA HIV-1 a kvantifikačního standardu RNA HIV-1. Reakční směs se opět zahřeje k oddělení výsledné dvouřetězcové DNA a exponování sekvencí primerového terče. Během chlazení směsi se primery SK145 a SKCC1B napojují na terčovou DNA. rtth pol za přítomnosti Mn 2+ a nadbytku dntps prodlužuje napojené primery podél terčových templátů a vytváří dvouřetězcovou molekulu DNA se 155 páry bází, která se nazývá amplikon. COBAS AMPLICOR Analyzer tento postup automaticky opakuje ve stanoveném počtu cyklů, přičemž v každém cyklu se množství amplikonové DNA efektivně zdvojnásobuje. Amplifikace probíhá pouze v oblasti genomu HIV-1 mezi primery; celý genom HIV-1 amplifikován není. 4/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 2/2003, Revision 4.0

HIV-1 MONITOR Selektivní amplifikace Selektivní amplifikace terčové nukleové kyseliny z klinického vzorku se u soupravy COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 dosahuje použitím AmpErase (uracil-n-glykosylázy) a deoxyuridin-trifosfátu (dutp). AmpErase pozná a katalyzuje rozklad řetězců DNA obsahujících deoxyuridin 32, nikoli však DNA obsahujících deoxythymidin. Deoxyuridin se v přirozené DNA nevyskytuje, je však vždy přítomen v amplikonu díky použití deoxyuridin-trifosfátu jako jednoho z dntps v činidle Master Mix, takže deoxyuridin obsahuje pouze amplikon. Deoxyuridin činí kontaminující amplikon citlivým vůči rozkladu látkou AmpErase před amplifikací terčové DNA. AmpErase, jenž je součástí činidla Master Mix, katalyzuje štěpení DNA obsahující deoxyuridin na deoxyuridinových zbytcích otevřením deoxyribózového řetězce v poloze C1. Během zahřívání v prvním tepelném cyklu při alkalickém ph činidla Master Mix se DNA řetězec amplikonu štěpí v poloze deoxyuridinu, čímž se tato DNA stává neamplifikovatelnou. Při teplotách nad 55 C, tedy během tepelného cyklování, je AmpErase inaktivní, a proto terčový amplikon nerozkládá. Po amplifikaci se případný zbytkový enzym denaturuje přídavkem denaturačního roztoku, čímž se předchází degradaci terčového amplikonu. Bylo zjištěno, že AmpErase v soupravě COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 inaktivuje minimálně 10 3 kopií deoxyuridin-obsahujícího HIV-1 amplikonu na jednu PCR. Hybridizační reakce Detekční reakce Po PCR amplifikaci přidává COBAS AMPLICOR Analyzer automaticky do A-zkumavek denaturační roztok k chemické denaturaci amplikonu HIV-1 a kvantifikačního standardu HIV-1 a k tvorbě jednořetězcové DNA. K dosažení kvantitativních výsledků v širokém dynamickém rozmezí ředí COBAS AMPLICOR Analyzer denaturovaný amplikon sériově v detekčních kelímcích (D- kelímcích). Ke každému ze čtyř zředěných roztoků amplikonu HIV-1 resp. ze dvou zředěných roztoků kvantifikačního standardu HIV-1 se přidá suspenze magnetických částic potažených oligonukleotidovou sondou specifickou pro daný amplikon, tj. SK102 pro amplikon HIV-1 nebo CP35 pro kvantifikační standard HIV-1. Biotinem značený amplikon je hybridizován k terčově specifické oligonukleotidové sondě vázané na magnetické částice. Pro každé kvantitativní stanovení je zapotřebí čtyř nezávislých měření absorbance činidla za použití suspenze sondy HIV-1 a dvou měření absorbance za použití suspenze sondy pro kvantifikační standard HIV-1. Po hybridizační reakci opláchne COBAS AMPLICOR Analyzer v D-kelímku magnetické částice, aby z nich odstranil nenavázanou látku, a přidá konjugát Avidinu s křenovou peroxidázou. Tento konjugát se naváže na biotinem značený amplikon hybridizovaný k terčově specifickým oligonukleotidovým sondám navázaným na magnetické částice. Opláchnutím magnetických částic odstraní přístroj COBAS AMPLICOR Analyzer nenavázaný konjugát, načež přidá do všech D-kelímků roztok substrátu obsahující peroxid vodíku a 3,3',5,5' tetramethylbenzidin (TMB). Za přítomnost peroxidu vodíku katalyzuje navázaná křenová peroxidáza oxidaci TMB na barevný komplex, jehož absorbanci přístroj COBAS AMPLICOR Analyzer proměřuje při 660 nm. 2/2003, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 5/53

Stanovení HIV-1 RNA [ ] COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 stanovuje RNA viru HIV-1 pomocí druhé terčové sekvence (kvantifikační standard HIV-1), který je do testovaného vzorku přidán ve známé koncentraci. Kvantifikační standard HIV-1 je neinfekční molekula RNA transkribovaná 233 nukleotidy in vitro s oblastmi vazby primeru stejnými jako v terčové sekvenci HIV-1. Kvantifikační standard HIV-1 obsahuje vazebná místa pro primer SK145 a SKCC1B a vytváří amplifikační produkt téže délky (155 bází) a složení bází jako v terčové RNA HIV-1. Oblast vázající sondu v amplikonu kvantifikačního standardu HIV-1 je modifikována tak, aby se tento amplikon odlišil od terčového amplikonu HIV-1. V lineární oblasti testu je absorbance u 660 nm (A 660 ) D-kelímku úměrná množství amplikonu HIV-1 resp. amplikonu kvantifikačního standardu HIV-1 v něm. Přístroj COBAS AMPLICOR Analyzer nejprve vypočítá absorbanci celkového HIV-1 a kvantifikačního standardu HIV-1 vynásobením absorbance D-kelímku faktorem zředění amplikonu v daném D-kelímku a potom vybere D-kelímek o nejvyšší celkové absorbanci. Vypočtená celková absorbance je úměrná množství RNA HIV-1 nebo RNA kvantifikačního standardu HIV-1 v dané reakci reverzní transkripce/pcr amplifikace. Množství HIV-1 RNA ve vzorku se pak vypočte z poměru celkové absorbance HIV-1 k celkové absorbanci kvantifikačního standardu HIV-1 a vstupního počtu molekul RNA kvantifikačního standardu HIV-1 podle rovnice: Celková A HIV-1 AF x Vstupních HIV-1 QS kopií/pcr x faktor objemu vzorku = HIV-1 RNA kopií/ml Celková A QS Kde: Celková A HIV-1 = vypočtená celková absorbance amplikonu HIV-1 Celková A QS = vypočtená celková absorbance amplikonu kvantifikačního standardu Vstupních kopií QS HIV-1/PCR = počet kopií kvantifikačního standardu v každé reakci; toto číslo je specifické pro danou šarži Objemový faktor vzorku = přepočítávací faktor pro převod z kopí/pcr na kopií/ml AF = adjustační faktor pro standardizaci výsledků testu COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR v1.5 na výsledky testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR v1.5 (adjustační faktor = 1,11). Objemový faktor vzorku = 40 pro postup přípravy vzorku Standard Objemový faktor vzorku = 4 pro postup přípravy vzorku UltraSensitive 6/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 2/2003, Revision 4.0

HIV-1 MONITOR Činidla COBAS AMPLICOR HIM 48 testů P/N: 21118390 123 HIV-1 MONITOR Test, ART: 11 1839 0 version 1.5 US: 83369 Specimen Preparation Reagents Příprava vzorků Činidla HIM PREP HIV-1 LYS (Činidlo pro lýzu HIV-1 MONITOR) Pufr Tris-HCl 68% Guanidinthiokanát 3% Dithiothreitol < 1% Glykogen + Xn 68% hm. guanidinthiokyanát 4 x 9,0 ml Zdraví škodlivý HIV-1 QS, v1.5 (Kvantifikační standard HIV-1 MONITOR, verze 1.5) < 0,001% neinfekční RNA transkribovaná in vitro (mikrobiální) obsahující sekvence vázající HIV-1 primer a jedinečnou oblast vázající sondu < 0,005% poly ra RNA (syntetická) EDTA 0,05% azid sodný HIV-1 DIL (Redidlo na vzorky HIV-1 MONITOR) Pufr Tris-HCl < 0,005% poly ra RNA (syntetická) EDTA 0,05% azid sodný 4 x 0,1 ml 4 x 4,8 ml Control Reagents Kontrolní činidla HIM CTL NHP 4 x 1,6 ml [Negativní plazma (lidská)] Lidská plazma, nereaktivní v US FDA-licencovaných testech na protilátky proti HCV, protilátky proti HIV-1/2, antigen HIV p24 a HBsAg; metodou PCR nebyla ve spojených dárcovských jednotkách zjištěna žádná HIV-1 RNA, HCV RNA ani HBV DNA a testem licencovaným FDA. 0,1% ProClin 300 HIV-1 ( ) C [Kontrola HIV-1 ( )] < 0,005% poly ra RNA (syntetická) EDTA 0,05% azid sodný 4 x 0,05 ml 2/2003, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 7/53

HIV-1 L(+)C [Nízká (+) kontrola HIV-1 MONITOR] < 0,001% neinfekční RNA transkribovaná in vitro (mikrobiální) obsahující sekvence HIV-1 < 0,005% poly ra RNA (syntetická) EDTA 0,05% azid sodný HIV-1 H(+)C [Vysoká (+) kontrola HIV-1 MONITOR] < 0,001% neinfekční RNA transkribovaná in vitro (mikrobiální) obsahující sekvence HIV-1 < 0,005% poly ra RNA (syntetická) EDTA 0,05% azid sodný 4 x 0,05 ml 4 x 0,05 ml Amplification Reagents Amplifikační činidla HIM AMP HIV-1 MMX, v1.5 (Master Mix HIV-1 MONITOR, verze 1.5) Bicinový pufr Glycerol < 0,01% rtth DNA polymeráza (rtth pol, mikrobiální) Octan draselný < 0,07% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,001% primery SKCC1B a SK145, biotinylované < 0,01% AmpErase uracil-n-glykosyláza (mikrobiální) 0,05% azid sodný HIV-1 Mn 2+, v1.5 (Manganatý roztok HIV-1 MONITOR, verze 1.5) < 2% Mangan Kyselina octová Amarantové barvivo 0,05% azid sodný 4 x 0,7 ml 4 x 0,1 ml Specific Detection Reagents Specifická detekční činidla HIM DK AD3 (Cinidlo pro ředění amplikonu) EDTA 0,8% hydroxid sodný + Xi 0,8% hm. hydroxid sodný 2 x 75 testů Dráždivý IM PS1, v1.5 (Suspenze sondy HIV-1 MONITOR 1, verze 1.5) MES pufr < 0,01% suspenze částic Dynabeads (paramagnetické částice) potažených HIV-1-specifickou oligonukleotidovou záchytovou sondou SK102 0,09% azid sodný 2 x 100 testů 8/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 2/2003, Revision 4.0

HIV-1 MONITOR IM4, v1.5 (Suspenze sondy HIV-1 MONITOR 2, verze 1.5) Pufr s fosforečnanem sodným < 0,2% detergent 24,9% thiokyanát sodný 2 x 100 testů IQ PS1, v1.5 1 x 100 testů (Suspenze sondy pro kvantifikační standard HIV-1 MONITOR č. 1, verze 1.5) MES pufr < 0,01% suspenze Dynabeads (paramagnetické částice) potažených oligonukleotidovou záchytovou sondou CP35 specifickou pro kvantifikační standard HIV-1 0,09% azid sodný IQ4, v1.5 (Suspenze sondy pro kvantifikační standard HIV-1 MONITOR č. 2, verze 1.5) Pufr s fosforečnanem sodným < 0,2% detergent 24,9% thiokyanát sodný 1 x 100 testů Generic Detection Reagents Generická detekční činidla DK DN4 (Denaturační roztok) 1,6% hydroxid sodný EDTA Thymolová modř + Xi 1,6% hm. hydroxid sodný 1 x 100 testů Dráždivý CN4 (Konjugát avidinu s křenovou peroxidázou) Pufr Tris-HCl < 0,001% konjugát avidinu s křenovou peroxidázou Bovinní serumalbumin (savčí) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% ProClin 150 SB3 (Substrát A) Citrátový roztok 0,01% peroxid vodíku 0,1% ProClin 150 3 x 100 testů 5 x 75 testů 2/2003, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 9/53

SB (Substrát B) 0,1% 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin (TMB) 40% dimethylformamid (DMF) T 40% hm. dimethylformamid (DMF) 5 x 5 ml Toxický R: 61-20/21-36 Může poškodit plod. Při vdechování a styku s pokožkou je zdraví škodlivý. Dráždí oči. S: 53-45 Vyhněte se expozici před použitím si vyžádejte speciální pokyny. V případě nehody nebo cítíte-li se nedobře, vyhledejte okamžitě lékařskou pomoc (pokud možno ukažte štítek). COBAS AMPLICOR WB 500 testů P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 Promývací pufr COBAS AMPLICOR US: 83314 WB (10X-promývací koncentrát) < 2% fosfátový pufr < 9% chlorid sodný EDTA < 2% detergent 0,5% ProClin 300 2 x 250 testů Upozornění a bezpečnostní pokyny Pro diagnostické použití in vitro. Tento test se používá pouze s lidskou plazmou odebranou v antikoagulantech EDTA nebo ACD. Heparin inhibuje PCR a při tomto postupu je jeho použití zakázáno. Nepipetovat ústy. V pracovních laboratorních prostorách nejezte, nepijte a nekuřte. Při manipulaci se vzorky a reagenciemi ze soupravy noste ochranné rukavice na jedno použití, laboratorní plášť a prostředek ochrany očí. Po práci se vzorky a zkušebními činidly si důkladně umyjte ruce. Při odebírání alikvotních podílů z lahviček s činidly dbejte, aby nedošlo k mikrobiální nebo ribonukleázové kontaminaci. Doporučuje se používat sterilní pipety na jedno použití a špičky na pipety prosté RNázy. Nesměšujte dohromady činidlo z různých šarží, ani z různých lahviček téže šarže. Nespotřebovaná činidla a odpad likvidujte v souladu s celostátními a místními předpisy. 10/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 2/2003, Revision 4.0

HIV-1 MONITOR Po vypršení lhůty použitelnosti již soupravu nepoužívejte. Materiálové bezpečnostní listy si lze vyžádat u místního zastoupení firmy Roche. Pracovní tok musí v laboratoři probíhat jednosměrně, od předamplifikačního prostoru směrem k poamplifikačnímu prostoru (amplifikace/detekce). Předamplifikační činnosti začínají přípravou činidel a postupují k přípravě vzorků. Látky a vybavení se musí přiřadit jednotlivým předamplifikačním činnostem a nesmějí se používat k jiným činnostem, ani přenášet mezi jednotlivými vyhrazenými prostory. Ve všech prostorech je třeba nosit rukavice, které se před opuštěním prostoru vymění. Vybavení a materiály pro přípravu činidla se nesmějí používat k přípravě vzorků, ani pro pipetování nebo zpracování amplifikované DNA či jiných zdrojů terčové DNA. Poamplifikační materiály a vybavení musí vždy zůstat v poamplifikačním prostoru. Se vzorky je třeba zacházet jako s infekčními a používat odpovídající laboratorní postupy, například jak jsou uvedeny v publikaci Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 33 nebo v dokumentu NCCLS M29-A 34. Všechny plochy důkladně očistěte a vydezinfikujte čerstvě připraveným 0,5% roztokem chlornanu sodného v deionizované nebo destilované vodě. Poznámka Běžné bělicí prostředky pro domácnost obvykle obsahují chlornan sodný v koncentraci 5,25 %. Roztok o koncentraci 0,5 % tak dostanete zředěním bělidla pro domácnost v poměru 1:10. POZOR: Souprava obsahuje složku (NHP) odvozenou z lidské krve. Zdrojový materiál byl analyzován pomocí testů schválených US FDA a byl shledán nereaktivním vůči protilátkám proti HCV, protilátkám proti HIV-1/2, antigenu HIV p24 a povrchovému antigenu hepatitidy B (HBsAg). Mimoto byly testovány spojené dárcovské jednotky; metodou PCR nebyla zjištěna žádná HIV-1 RNA, HCV RNA ani HBV DNA a testem licencovaným FDA nebyla zjištěna žádná HBV core protilátka. Ovšem žádná známá testovací metoda nepředstavuje dokonalou záruku, že se s deriváty z lidské krve nepřenesou nějaké infekční látky. Proto je třeba považovat všechen materiál lidského původu za potenciálně infekční. S NHP je třeba zacházet jako s infekčním a při práci s ním je nutno uplatňovat bezpečné laboratorní postupy, například ty, které jsou uvedeny v publikaci Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 33 nebo v dokumentu NCCLS M29-A 34. Všechny plochy důkladně očistěte a vydezinfikujte čerstvě připraveným 0,5% roztokem chlornanu sodného v deionizované nebo destilované vodě. HIV-1 QS, v1.5; HIV-1 DIL; HIV-1 MMX, v1.5; HIV-1 Mn 2+, v1.5; HIV-1 ( ) C; HIV-1 L(+)C; HIV-1 H(+)C; IM PS1, v1.5 a IQ PS1, v1.5 obsahují azid sodný. Ten může reagovat s kovovým olovem nebo mědí instalačních trubek za tvorby vysoce výbušných kovových azidů. Budete-li tedy vylévat roztoky obsahující azid do laboratorní výlevky, spláchněte je velkým objemem vody, aby se azid nemohl nikde usadit. Při práci s HIV-1 LYS, HIV-1 MMX v1.5, DN4, AD3, IM4 v1.5, IQ4 v1.5, CN4, SB3, SB a pracovním substrátem (směs činidel SB3 a SB) noste prostředek ochrany očí, pracovní plášť a rukavice na jedno použití. Dbejte, aby se tyto materiály nedostaly do styku s pokožkou, očima nebo sliznicemi. Pokud ke styku dojde, okamžitě postiženou oblast omyjte velkým množstvím vody. Pokud byste tuto péči zanedbali, mohly by se vyvinout popáleniny. Jestliže se některé činidlo rozlije nebo rozsype, před vytřením dosucha je zřeďte vodou. 2/2003, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 11/53

Dbejte, aby se SB ani pracovní substrát nedostal do styku s pokožkou nebo sliznicemi. Pokud se některá z těchto látek do styku s pokožkou dostane, omyjte ji okamžitě velkým množstvím vody. SB a pracovní substrát obsahují dimethylformamid, který je ve vysokých orálních dávkách toxický a může poškodit plod. Je třeba dbát, aby nedošlo k jejich styku s pokožkou, vdechování výparů ani požití. Pokud ke styku s pokožkou dojde, omyjte ji důkladně vodou a mýdlem a vyhledejte okamžitě lékařskou pomoc. Dbejte, aby se HIV-1 LYS, který obsahuje guanidinthiokyanát, ani IM4 v1.5 nebo IQ4 v1.5, které obsahují thiokyanát sodný, nemohly dostat do styku s roztokem chlornanu sodného (bělidlo). Ze směsi by se mohl uvolňovat vysoce toxický plyn. Vzorek i kontrolní preparát se musí uchovávat ve zkumavkách se šroubovacím uzávěrem, aby nemohl vystříknout a aby nemohlo dojít ke vzájemné (křížové) kontaminaci vzorků. Zkumavky s nasazovacím uzávěrem nepoužívejte. Požadavky na skladování a manipulaci Reagencie nezmrazujte. HIV-1 LYS, HIV-1 QS v1.5 a HIV-1 DIL uchovávejte při teplotě 2 8 C. Dokud jsou neotevřená, jsou tato činidla stálá do vyznačeného data použitelnosti. Po otevření je třeba nespotřebovanou část zlikvidovat. V HIV-1 LYS se během skladování při teplotě 2 8 C tvoří sraženina. Tu před použitím rozpusťte zahřátím HIV-1 LYS na teplotu 25 37 C. Kapalinu zahřívejte nejdéle 30 minut a potom jí důkladně míchejte tak dlouho, dokud se všechny krystalky nerozpustí. Před použitím si každou lahvičkou HIV-1 LYS prohlédněte proti bílému podkladu a sledujte, jestli nezpozorujete žluté zabarvení nebo známky netěsnosti. Pokud žlutou barvu nebo známky netěsnosti zjistíte, lahvičku k testování nepoužijte a vyžádejte si od místního zastoupení firmy Roche náhradu. Po otevření je třeba nespotřebovanou část zlikvidovat. Pracovní činidlo pro lýzu, připravené tak, že se k HIV-1 LYS přidal HIV-1 QS, v1.5, se uchovává za pokojové teploty a musí se spotřebovat do 4 hodin od přípravy. HIV-1 MMX, v1.5 a HIV-1 Mn 2+, v1.5 se uchovává za teplot 2 8 C. Činidla jsou stálá do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Po otevření je třeba nespotřebovanou část zlikvidovat. Pracovní Master Mix, připravený tak, že se k HIV-1 MMX, v1.5 přidal HIV-1 Mn 2+, v1.5, se uchovává za teploty 2 8 C, kdy je stálý po dobu 4 hodin. NHP, HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C a HIV-1 H(+)C uchovávejte při teplotě 2 8 C. Činidla jsou stálá do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Po otevření je třeba nespotřebovanou část zlikvidovat. AD3 uchovávejte za teplot 2 25 C. Po vložení do přístroje COBAS AMPLICOR Analyzer je AD3 při teplotě 2 8 C stálý 30 dní nebo do vypršení doby použitelnosti, podle toho, která doba je kratší. AD3 se dá použít maximálně na čtyři 24-hodinové přístrojové cykly a mezi cykly se musí uchovávat při teplotě 2 8 C. 12/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 2/2003, Revision 4.0

HIV-1 MONITOR Dodané materiály IM PS1, v1.5 a IM4, v1.5 uchovávejte při teplotě 2 8 C. Činidla jsou stálá do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Po smísení IM PS1, v1.5 s IM4, v1.5 je pracovní činidlo při teplotě 2 8 C stálé 14 dní. Dá se použít nanejvýš na dva 24-hodinové přístrojové cykly a mezi cykly se musí uchovávat při teplotě 2 8 C. IQ PS1, v1.5 a IQ4, v1.5 uchovávejte při teplotě 2-8 C. Činidla jsou stálá do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Po smísení IQ PS1, v1.5 s IQ4, v1.5 je pracovní činidlo při teplotě 2 8 C stálé 30 dní. Dá se použít nanejvýš na čtyři 24-hodinové přístrojové cykly a mezi cykly se musí uchovávat při teplotě 2 8 C. DN4 uchovávejte za teplot 2 25 C. Činidlo je stálé do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Po otevření je při teplotě 2 8 C stálé 30 dní nebo do vypršení doby použitelnosti, podle toho, která doba je kratší. Dá se použít maximálně na čtyři 24-hodinové přístrojové cykly a mezi cykly se musí uchovávat při teplotě 2 8 C. CN4 uchovávejte při teplotě 2 8 C. Činidlo je stálé do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Po otevření je při teplotě 2 8 C stálé 30 dní nebo do vypršení doby použitelnosti, podle toho, která doba je kratší. Dá použít maximálně na čtyři 24-hodinové přístrojové cykly a mezi cykly se musí uchovávat při teplotě 2 8 C. SB3 a SB uchovávejte při teplotě 2 8 C. Neotevřená jsou tato činidla stálá do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Pracovní substrát se připravuje smísením SB3 s SB denně. Pracovní substrát je v přístroji COBAS AMPLICOR Analyzer stálý 16 hodin. SB3, SB ani pracovní substrát nesmí přijít do styku s kovy ani s oxidačními činidly a nesmí se vystavovat přímému světlu. WB uchovávejte za teplot 2 25 C. Činidlo je stálé do vypršení vyznačené doby použitelnosti. Před zředěním WB prohlédněte a zpozorujete-li sraženinu, kapalinu zahřejte na 30 37 C, aby se sraženina rozpustila. Pracovní promývací pufr (1X), připravený zředěním činidla WB destilovanou nebo deionizovanou vodou v poměru 1:10, se v rezervoáru promývacího pufru přístroje COBAS AMPLICOR uchovává za teplot 2 25 C, kdy je stálý 2 týdny ode dne přípravy. Částečně spotřebovaná detekční činidla uchovávejte mezi jednotlivými měřeními při teplotě 2 8 C. Před vložením do přístroje COBAS AMPLICOR Analyzer zkontrolujte, zda otevřeným nebo pracovním činidlům neuplynula doba použitelnosti. COBAS AMPLICOR HIM P/N: 21118390 123 HIV-1 MONITOR Test, ART: 11 1839 0 version 1.5 US: 83369 Specimen Preparation Reagents Příprava vzorkučinidla HIM PREP HIV-1 LYS (Činidlo pro lýzu HIV-1 MONITOR) HIV-1 QS, v1.5 (Kvantifikační standard HIV-1 MONITOR, verze 1.5) HIV-1 DIL (Redidlo na vzorky HIV-1 MONITOR) 2/2003, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 13/53

Control Reagents Kontrolní činidla HIM CTL NHP [Negativní plazma (lidská)] HIV-1 ( ) C [Kontrola HIV-1 ( )] HIV-1 L(+)C [Nízká (+) kontrola HIV-1 MONITOR] HIV-1 H(+)C [Vysoká (+) kontrola HIV-1 MONITOR] Amplification Reagents Amplifikační činidla HIM AMP HIV-1 MMX, v1.5 (Master Mix HIV-1 MONITOR, verze 1.5) HIV-1 Mn 2+, v1.5 (Manganatý roztok HIV-1 MONITOR, verze 1.5) Specific Detection Reagents Specifická detekční činidla HIM DK AD3 (Cinidlo pro ředění amplikonu) IM PS1, v1.5 (Suspenze sondy HIV-1 1, verze 1.5) IM4, v1.5 (Suspenze sondy HIV-1 2, verze 1.5) IQ PS1, v1.5 (Suspenze sondy pro kvantifikační standard HIV-1 č. 1, verze 1.5) IQ4, v1.5 (Suspenze sondy pro kvantifikační standard HIV-1 č. 2, verze 1.5) Generic Detection Reagents Generická detekční činidla DK DN4 (Denaturační roztok) CN4 (Konjugát avidinu s křenovou peroxidázou) SB3 (Substrát A) SB (Substrát B) COBAS AMPLICOR WB P/N: 20759899 123 Wash Buffer ART: 07 5989 9 COBAS AMPLICOR Promývací pufr US: 83314 WB (10X-promývací koncentrát) 14/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 2/2003, Revision 4.0

HIV-1 MONITOR Potřebné materiály, jež nejsou součástí dodávky Předamplifikace prostor pro přípravu činidel COBAS AMPLICOR A-ring fitted with 12 A-tubes (ART: 10 4563 6) COBAS AMPLICOR A-ring holder Pipeta Eppendorf Multipette se dvanácti zásobníky Eppendorf Combitip Reservoir 1,25 ml (sterilní, jednotlivě balené) Pipetory (objem 50 µl a 100 µl)* s aerosolovou bariérou nebo RNázy prostými špičkami s pozitivním posuvem Rukavice na jedno použití bez prášku Předamplifikace prostor pro přípravu vzorku a kontroly Zkumavky 2,0 ml se šroubovacím uzávěrem, sterilní (Sarstedt 72.694.006 nebo ekvivalentní)** Zkumavky 1,5 ml se šroubovacím uzávěrem, sterilní (Sarstedt 72.692.105 nebo ekvivalentní)** Stojany na zkumavky (Sarstedt 93.1428 nebo ekvivalentní) 95% ethanol pro mikrobiologii nebo histologii (čerstvě zředěný na 70% destilovanou nebo deionizovanou vodou) Izopropylalkohol čistoty p.a. Sterilní transferové pipety s jemnou špičkou prosté RNázy Sterilní polystyrenové serologické pipety na jedno použití (5 ml, 10 ml a 25 ml) Pipetory (objem 12,5 µl, 25 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 500 µl, 600 µl, 800 µl a 1 000 µl)* s aerosolovou bariérou nebo špičkami s pozitivním posuvem prostými RNázy Mikrocentrifuga (max. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g) Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M nebo ekvivalentní Mražená ultracentrifuga s rotorem s pevným úhlem (45, kapacita minimálně 24 zkumavek po 1,5 ml) o RCF 23 600 x g (Heraeus 17RS s rotorem HFA 22.1, Biofuge 28RS nebo ekvivalentní) Vířivý mixér Rukavice na jedno použití bez prášku Poamplifikace prostor pro amplifikaci/detekci COBAS AMPLICOR Analyzer a tiskárna Příručka Operator s Manual k přístroji COBAS AMPLICOR Analyzer Metodická příručka (Method Manual) k soupravě COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 Racks of D-cups (ART: 10 4564 4) Destilovaná nebo deionizovaná voda Serologické pipety 5 ml Vířivý mixér Rukavice na jedno použití bez prášku * Pipetory musejí být přesné na 3 % jmenovitého objemu. Kde je tak uvedeno, musí být použita aerosolová bariéra nebo špičky s pozitivním posuvem prosté RNázy, aby se zabránilo vzájemné kontaminaci vzorku a amplikonu. ** Na vzorek a kontrolní preparát se používají zkumavky se šroubovacím uzávěrem, aby se předešlo možné vzájemné kontaminaci vzorků a kontrol. Zkumavky s nasazovacím uzávěrem nepoužívejte. 2/2003, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 15/53

Odběr, přeprava a skladování vzorků Poznámka Odběr vzorků Se všemi vzorky je třeba zacházet jako s infekčními. COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 je určen pouze pro práci se vzorky plazmy. Krev se odebírá do sterilních zkumavek za použití EDTA (vršek levandulové barvy) nebo ACD (vršek žluté barvy) jako antikoagulantu. Vzorky antikoagulované heparinem jsou pro tento test nevhodné. Celou krev uchovávejte při teplotě 2 25 C maximálně 6 hodin. Při použití vzorků s ACD jako antikoagulantem jsou výsledky testu zhruba o 15 % nižší než při použití EDTA jako antikoagulantu; to je důsledkem zředění krve při odběru objemem 1,5 ml ACD. Vliv antikoagulantů ACD a EDTA na výsledky stanovení HIV-1 RNA ve vzorcích plazmy ukazuje obr. 1. Obr. 1 Porovnání antikoagulantů ACD a EDTA* Vzorky s ACD Průměrný výsledek testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR (HIV RNA kopií/ml plazmy, n = 2) 10 5 10 4 10 3 AMPLICOR HIV-1 MONITOR Výsledky u vzorků s EDTA a ACD y = 1,4381 * x^(0,93286) R= 0,90097 EDTA = ACD 10 3 10 4 10 5 Vzorky s EDTA Pruměrný výsledek testu AMPLICOR HIV-1 MONITOR (HIV RNA kopií/ml plazmy, n = 2) * Hodnoty v obr. 1 byly testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test získány při použití postupu přípravy vzorku Standard. Sérum nebo plazmu z krve separujte do 6 hodin od odběru, a to odstřeďováním za pokojové teploty po dobu 20 minut při 800 1600 x g. Plazmu převeďte do sterilní polypropylenové zkumavky. Přeprava vzorků Skladování vzorků Při přepravě celé krve, séra nebo plazmy je třeba dodržovat celostátní resp. místní předpisy o dopravě etiologických látek 35. Celá krev se přepravuje za teplot 2 25 C a musí se zpracovat do 6 hodin od odběru. Plazma se může přepravovat při teplotě 2 8 C nebo ve zmrazeném stavu při teplotách 20 C až 80 C. Vzorky plazmy je možno uchovávat při pokojové teplotě 1 den, při teplotě 2 8 C do 5 dnů nebo ve zmrazeném stavu při teplotách 20 C až 80 C. Doporučuje se uchovávat vzorky v alikvotních podílech po 600 700 µl ve sterilních polypropylenových zkumavkách o objemu 2,0 ml se šroubovacím uzávěrem (např. 72.694.006). Vzorky plazmy je možno zmrazit a rozmrazit maximálně třikrát. Údaje ze studií zabývajících se cykly zmrazení-rozmrazení ukazuje obr. 2. 16/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 2/2003, Revision 4.0

HIV-1 MONITOR Obr. 2 Průměrné výsledky pro HIV-1 ze tří spojených vzorků HIV-1-pozitivní plazmy po 2, 3 a 4 cyklech zmrazení-rozmrazení* 2,0 HIV-1 RNA kopií/ml Normalizováno na 1. rozmrazení 1,5 1,0 0,5 0,0 1 2 3 4 Počet rozmrazení Návod k použití * Hodnoty v obr. 2 byly testem AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test získány při použití postupu přípravy vzorku Standard. Poznámka Poznámka Poznámka Poznámka Množství pro jedno měření Podrobný provozní návod viz v příručce Operator s Manual k přístroji COBAS AMPLICOR Analyzer. Všechna činidla musejí mít před použitím teplotu okolí. Před započetím testu se vizuálně přesvědčte, že je objem činidel dostatečný. Vzorky plazmy musejí mít před použitím teplotu okolí. Kde je tak uvedeno, používejte pipetory s aerosolovou bariérou nebo se špičkami s pozitivním posuvem. Dávejte obzvláštní pozor, abyste zajistili selektivní amplifikaci. Vzorek i kontrolní preparát se musí uchovávat ve zkumavkách se šroubovacím uzávěrem, aby nemohl vystříknout a aby nemohlo dojít ke vzájemné (křížové) kontaminaci vzorků. Zkumavky s nasazovacím uzávěrem nepoužívejte. Každá souprava obsahuje dostatečné množství činidla na čtyři 12-testová měření, která mohou probíhat zvlášť nebo současně. Každé měření musí zahrnovat minimálně po jednom replikátu AMPLICOR HIV-1 ( ) Control, AMPLICOR HIV-1 MONITOR Low (+) Control a AMPLICOR HIV-1 MONITOR High (+) Control (viz část Kontrola jakosti ). Činidla pro přípravu vzorku a amplifikaci jsou balena v 12-testových lahvičkách na jedno použití. Pro co nejefektivnější využití je vhodné zpracovávat činidla, vzorky i kontroly v dávkách, jež jsou násobky dvanácti. Pracovní tok COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 se dá provést během jednoho nebo dvou dnů. Pokud se má test provést během jednoho pracovního dne, postupuje se podle pokynů v částech Příprava činidel a kontrol a Reverzní transkripce, amplifikace a detekce v tomto pořadí. Test lze také provést v průběhu dvou dnů. V takovém případě se první den provede Příprava vzorků a kontrol a příští den se pokračuje postupy Příprava činidel, Reverzní transkripce a Amplifikace a detekce. 2/2003, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 17/53

Chceme-li první den provést přípravu vzorků a kontrol a druhý den reverzní transkripci, amplifikaci a detekci, provedeme buď Přípravu vzorků a kontrol postupem Standard (kroky A.1 až A.14) nebo Přípravu vzorků a kontrol postupem UltraSensitive (kroky B.1 až B.19) a zpracované vzorky uskladníme podle bodu A.14 resp. B.19. Druhého dne začneme Přípravou činidel, potom zpracované vzorky a kontroly rozmrazíme na pokojovou teplotu a pokračujeme postupy Příprava vzorků a kontrol postupem Standard, krok A.15, resp. Příprava vzorků a kontrol postupem UltraSensitive, krok B.20, a dále Reverzní transkripce, Amplifikace a Detekce. Příprava činidel Provádí se: Předamplifikce prostor pro přípravu činidel 1. Stanovte potřebný počet A-kruhů pro testování pacientova vzorku a kontroly. Uložte A-kruh(y) do držáku(ů). 2. Připravte pracovní Master Mix odměřením 100 µl HIV-1 Mn 2+, v1.5 do jedné lékovky HIV-1 MMX, v1.5. Objem Master Mix není třeba měřit. Odměřte 100 µl HIV-1 Mn 2+, v1.5 do celé lékovky HIV-1 MMX, v1.5. Zkumavku opět uzavřete a dobře promíchejte tak, že ji 10 15-krát obrátíte dnem vzhůru. Víření k promísení pracovního Master Mix nepoužívejte. Růžové barvivo v HIV-1 Mn 2+, v1.5 slouží k vizuálnímu ověření, že byl HIV-1 Mn 2+, v1.5 k Master Mix skutečně přidán. Zbývající HIV-1 Mn 2+, v1.5 zlikvidujte Pracovní Master Mix se uchovává při teplotě 2 8 C a musí se spotřebovat do 4 hodin od přípravy. 3. Do každé A-zkumavky odměřte 50 µl pracovního Master Mix za použití opakovacího pipetoru nebo pipetoru s aerosolovou bariérou nebo se špičkou s pozitivním posuvem. Tentokrát čepičky A-zkumavek nezavírejte. Nespotřebovaný pracovní Master Mix zlikvidujte. 4. A-kruh(y) s pracovním Master Mix vložte do těsně uzavíratelného plastového vaku a vak bezpečně těsně uzavřete. Přemístěte A-kruh(y) do prostoru Předamplifikace příprava vzorku a kontroly. Uložte A-kruh(y) obsahující pracovní Master Mix do prostoru Předamplifikace příprava vzorku a kontroly při teplotě 2 8 C do doby, než bude příprava vzorku a kontroly hotova. Pracovní Master Mix v A-zkumavkách zatavených v plastovém vaku je při teplotě 2 8 C stálý čtyři hodiny. Vzorek a kontrola Příprava Poznámka Poznámka Poznámka Provádí se v: Předamplifikace prostor pro přípravu vzorku a kontroly K amplifikaci zpracovaných vzorků a kontrol proveďte nejprve kroky uvedené v části Příprava činidel. Zpracované vzorky a kontroly rozmrazte na pokojovou teplotu a pokračujte Přípravou vzorků a kontrol postupem Standard, krok A.15, resp. Přípravou vzorků a kontrol postupem UltraSensitive, krok B.20. V HIV-1 LYS se během uchovávání při teplotě 2 8 C vytváří sraženina. Před použitím kapalinu zahřejte na teplotu 25 37 C a důkladně promíchávejte, aby se veškerý vysrážený materiál rozpustil. Před použitím si každou lahvičkou HIV-1 LYS prohlédněte proti bílému podkladu a sledujte, jestli nezpozorujete žluté zabarvení nebo známky netěsnosti. Pokud žlutou barvu nebo známky netěsnosti zjistíte, lahvičku k testování nepoužijte a vyžádejte si od místního zastoupení firmy Roche náhradu. 18/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 2/2003, Revision 4.0

HIV-1 MONITOR Příprava vzorků a kontrol postupem Standard A.1. A.2. Připravte si 70% ethanol. Na 12 testů smíchejte 11,0 ml 95% ethanolu se 4,0 ml deionizované nebo destilované vody. Označte po jedné 2,0 ml zkumavce se šroubovacím uzávěrem pro každý vzorek od pacienta a další tři zkumavky označte HIV-1 ( )C, HIV-1 L(+)C a HIV-1 H(+)C. A.3. Připravte standardní pracovní Lysis Reagent. Před použitím HIV-1 QS, v1.5 vířením minimálně 10 sekund promíchávejte. Na každou dávku až 12 vzorků a kontrol odměřte do jedné lahvičky HIV-1 LYS objem 100 µl HIV-1 QS, v1.5. Objem HIV-1 LYS není třeba odměřit. Růžové barvivo v HIV-1 QS, v1.5 slouží k vizuální kontrole, že byl HIV-1 QS, v1.5 k HIV-1 LYS přidán Nespotřebovaný HIV-1 QS, v1.5 zlikvidujte. Standardní pracovní Lysis Reagent je při pokojové teplotě stálý 4 hodiny. Poznámka Používáte-li vzorky zmrazené, rozmrazte je při pokojové teplotě a vířením po dobu 3 5 sekund je promíchejte. Zkumavkou se vzorkem zakružte, abyste sebrali vzorek i ze dna zkumavky. Dejte pozor, abyste si při manipulaci se vzorky nezkontaminovali rukavice. A.4. A.5. Do každé označené zkumavky odměřte 600 µl pracovního Lysis Reagent a zkumavky uzavřete. Přesvědčte se, že je pracovní Lysis Reagent růžový, tedy že HIV-1 QS, v1.5 byl k HIV-1 LYS přidán. Kontroly si připravte tímto způsobem: NHP, HIV-1 ( )C, HIV-1 L(+)C a HIV-1 H(+)C vířením po dobu 3 5 sekund promíchejte. Do každé ze tří kontrolních zkumavek odměřte po 200 µl NHP. Zkumavky uzavřete a nechte 3 5 sekund vířit. Do zkumavky označené HIV-1 ( )C, obsahující standardní pracovní Lysis Reagent a NHP, odměřte 50 µl HIV-1 ( )C. Zkumavku uzavřete a nechte 3-5 sekund vířit. Do zkumavky označené HIV-1 L(+)C, obsahující standardní pracovní Lysis Reagent a NHP, odměřte 50 µl HIV-1 L(+)C. Zkumavku uzavřete a nechte 3-5 sekund vířit. Do zkumavky označené HIV-1 H(+)C, obsahující standardní pracovní Lysis Reagent a NHP, odměřte 50 µl HIV-1 H(+)C. Zkumavku uzavřete a nechte 3 5 sekund vířit. A.6. A.7. Do patřičně označených zkumavek obsahujících standardní pracovní Lysis Reagent přidejte po 200 µl jednotlivých vzorků od pacientů. Zkumavky uzavřete a nechte 3 5 sekund vířit. Zkumavky se vzorky a kontrolami inkubujte při pokojové teplotě po dobu 10 minut. 2/2003, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 19/53

A.8. Z každé zkumavky se vzorkem resp. kontrolou sejměte uzávěr, přidejte 800 µl 100% izopropylalkoholu (o pokojové teplotě), zkumavku opět uzavřete a intenzivním vířením 3 5 sekund míchejte. Najednou mějte otevřenu jenom jednu zkumavku. A.9. Na zkumavkách si udělejte orientační značky a vložte zkumavky do mikrocentrifugy orientační značkou ven, takže se pelety podle nich srovnají. Vzorky a kontroly odstřeďujte při pokojové teplotě po dobu 15 minut maximální rychlostí (12 500 16 000 x g). A.10. Pomocí nové transfer-pipety na jedno použití s jemnou špičkou opatrně z každé zkumavky stáhněte a zlikvidujte supernatant; při tom dávejte pozor, abyste neporušili peletu (nemusí být vidět!). Odstraňte tolik kapaliny, kolik je bez porušení pelety možné. Supernatant odebírejte pomalu, tak aby mohla kapalina ze stěn zkumavky kompletně stéci. Vakuové odsávání nepoužívejte. A.11. Do každé zkumavky odměřte 1,0 ml 70% ethanolu (o pokojové teplotě), zkumavky opět uzavřete a vířením po dobu 3 5 sekund promíchejte. A.12. Vložte zkumavky do mikrocentrifugy orientačními značkami ven a centrifugujte při pokojové teplotě po dobu 5 minut maximální rychlostí (12 500 16 000 x g). A.13. Pomocí nové transfer-pipety na jedno použití s jemnou špičkou opatrně z každé zkumavky stáhněte a zlikvidujte supernatant, aniž byste přitom porušili peletu; ta by měla být v tomto kroku dobře vidět. Supernatantu odstraňte co nejvíce. Zbytkový ethanol může amplifikaci inhibovat. A.14. Do každé zkumavky odměřte 400 µl HIV-1 DIL a zkumavku opět uzavřete. Intenzivním vířením po dobu 10 sekund důkladně promíchejte, aby se extrahovaná RNA resuspendovala. Může zbýt určité množství nerozpustné hmoty. Zpracované vzorky a kontroly amplifikujte do 2 hodin od přípravy. Pokud s amplifikací nelze do 2 hodin od přípravy začít, je možno vzorky uložit ve zmrazeném stavu při teplotě 20 C nebo nižší na dobu až jednoho týdne, přičemž zmrazit a rozmrazit se smějí jenom jednou. Kdyby se zmrazil a rozmrazil víckrát, mělo by to za následek úbytek počtu kopií. Poznámka Pokud byly zpracované vzorky a kontroly uchovávány před amplifikací ve zmrazeném stavu, rozmrazte je za pokojové teploty a před postoupením k bodu 15 je dejte na dobu 5 sekund vířit. A.15. Z každého zpracovaného vzorku od pacienta a kontroly odměřte 50 µl do příslušné A-zkumavky obsahující pracovní Master Mix; použijte k tomu pipetor s aerosolovou bariérou nebo se špičkou s pozitivním posuvem. Pro každý vzorek a kontrolu použijte novou špičku. Dejte pozor, abyste nepřenesli žádnou vysráženou látku, která se nemusela nepřevést zpět do roztoku. A-zkumavky uzavřete. A.16. Zaznamenejte pozice kontrol a vzorků v A-kruhu (kruzích). S amplifikací je třeba začít do 45 minut okamžiku, kdy byly zpracované vzorky a kontroly odměřeny do A-zkumavek obsahujících pracovní Master Mix. Připravené vzorky a kontroly v A-kruzích přemístěte do prostoru Amplifikace/detekce. Nespotřebovaný zpracovaný vzorek je možno na dobu jednoho týdne uložit ve zmrazeném stavu při teplotě 20 C nebo nižší, přičemž zmrazit a rozmrazit se smí jenom jednou. Kdyby se zmrazil a rozmrazil víckrát, mělo by to za následek úbytek počtu kopií. 20/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 2/2003, Revision 4.0

HIV-1 MONITOR Příprava vzorků a kontrol postupem UltraSensitive B1. Ultracentrifugu a rotor předem podle návodu k ultracentrifuze ochlaďte na teplotu 2 8 C. B2. Připravte si 70% ethanol. Na 12 testů smíchejte 11,0 ml 95% ethanolu se 4,0 ml deionizované nebo destilované vody. B3. Označte po jedné 1,5 ml zkumavce se šroubovacím uzávěrem pro každý vzorek od pacienta a další tři zkumavky označte HIV-1 ( )C, HIV-1 L(+)C a HIV-1 H(+)C. B4. Připravte pracovní UltraSensitive Lysis Reagent. Před použitím HIV-1 QS, v1.5 vířením minimálně 10 sekund promíchávejte. Na každou dávku až 12 vzorků a kontrol odměřte do jedné lahvičky HIV-1 LYS objem 25 µl HIV-1 QS, v1.5. Objem HIV-1 LYS není třeba odměřit. Růžové barvivo v HIV-1 QS, v1.5 slouží k vizuální kontrole, že byl HIV-1 QS, v1.5 k HIV-1 LYS přidán Nespotřebovaný HIV-1 QS, v1.5 zlikvidujte. Pracovní UltraSensitive Lysis Reagent je při pokojové teplotě stálý 4 hodiny. Poznámka Používáte-li vzorky zmrazené, rozmrazte je při pokojové teplotě a vířením po dobu 3 5 sekund je promíchejte. Zkumavkou se vzorkem zakružte, abyste sebrali vzorek i ze dna zkumavky. Dejte pozor, abyste si při manipulaci se vzorky nezkontaminovali rukavice. B5. Do patřičně označených zkumavek přidejte po 500 µl jednotlivých vzorků od pacientů. B6. Do jednotlivých patřičně označených zkumavek odměřte po 500 µl NHP. B7. Na zkumavkách si udělejte orientační značky a vložte zkumavky do ultracentrifugy orientační značkou ven, takže se pelety podle nich srovnají. Vzorky a kontroly odstřeďujte při teplotě 2 8 C po dobu 60 minut rychlostí 23 600 x g. B.8. Pomocí nové transfer-pipety na jedno použití s jemnou špičkou opatrně z každé zkumavky stáhněte a zlikvidujte supernatant; přitom dávejte pozor, abyste neporušili peletu (nemusí být vidět!). Odstraňte tolik kapaliny, kolik je bez porušení pelety možné. Supernatant odebírejte pomalu, tak aby mohla kapalina ze stěn zkumavky kompletně stéci. Vakuové odsávání nepoužívejte. Poznámka Virové pelety získané v rámci kroku B.8 přípravy vzorku postupem UltraSensitive jsou při pokojové teplotě stálé 6 hodin a při teplotě 20 C nebo nižší minimálně 14 dnů. B9. Do každé označené zkumavky odměřte 600 µl pracovního Lysis Reagent a zkumavky uzavřete. Přesvědčte se, že je pracovní Lysis Reagent růžový, tedy že HIV-1 QS, v1.5 byl k HIV-1 LYS přidán. Zkumavku vířením po dobu 3 5 sekund promíchejte, aby se peleta resuspendovala. 2/2003, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 21/53

B10. Připravte si ultracitlivé kontroly tímto způsobem: HIV-1 ( )C, HIV-1 L(+)C a HIV-1 H(+)C vířením po dobu 3 5 sekund promíchejte. Do zkumavky označené HIV-1 ( )C, obsahující pracovní UltraSensitive Lysis Reagent, odměřte 12,5 µl HIV-1 ( )C. Zkumavku uzavřete a nechte 3 5 sekund vířit. Do zkumavky označené HIV-1 L(+)C, obsahující pracovní UltraSensitive Lysis Reagent odměřte 12,5 µl HIV-1 L(+)C. Zkumavku uzavřete a nechte 3 5 sekund vířit. Do zkumavky označené HIV-1 H(+)C, obsahující pracovní UltraSensitive Lysis Reagent odměřte 12,5 µl HIV-1 H(+)C. Zkumavku uzavřete a nechte 3 5 sekund vířit. B11. Zkumavky se vzorky a kontrolami nechte při pokojové teplotě po dobu 10 minut inkubovat. B12. Ze zkumavek se vzorky a kontrolami sejměte uzávěr, přidejte po 600 µl 100% izopropylalkoholu (o pokojové teplotě), zkumavky opět uzavřete a intenzivním vířením po dobu 3 5 sekund důkladně promíchejte. Najednou mějte otevřenu jenom jednu zkumavku. B13. Na zkumavkách si udělejte orientační značky a vložte zkumavky do mikrocentrifugy orientační značkou ven, takže se pelety podle nich srovnají. Vzorky a kontroly odstřeďujte při pokojové teplotě po dobu 15 minut maximální rychlostí (12 500 16 000 x g). B14. Pomocí nové transfer-pipety na jedno použití s jemnou špičkou opatrně z každé zkumavky stáhněte a zlikvidujte supernatant; přitom dávejte pozor, abyste neporušili peletu (nemusí být vidět!). Odstraňte tolik kapaliny, kolik je bez porušení pelety možné. Supernatant odebírejte pomalu, tak aby mohla kapalina ze stěn zkumavky kompletně stéci. Vakuové odsávání nepoužívejte. B15. Do každé zkumavky odměřte 1,0 ml 70% ethanolu (o pokojové teplotě), zkumavky opět uzavřete a vířením po dobu 3 5 sekund promíchejte. B16. Vložte zkumavky do mikrocentrifugy orientačními značkami ven a odstřeďujte při pokojové teplotě po dobu 5 minut maximální rychlostí (12 500 16 000 x g). B17. Pomocí nové transfer-pipety na jedno použití s jemnou špičkou opatrně z každé zkumavky stáhněte a zlikvidujte supernatant, aniž byste přitom porušili peletu; ta by měla být v tomto kroku dobře vidět. Supernatantu odstraňte co nejvíce. Zbytkový ethanol může amplifikaci inhibovat. B18. Krok B.17 opakujte, abyste odstranili co nejvíce zbylého supernatantu. Zbytkový ethanol může amplifikaci inhibovat. B19. Do každé zkumavky odměřte 100 µl HIV-1 DIL a zkumavku opět uzavřete. Intenzivním vířením po dobu 10 sekund důkladně promíchejte, aby se extrahovaná RNA resuspendovala. Může zbýt určité množství nerozpustné hmoty. Zpracované vzorky a kontroly amplifikujte do 2 hodin od přípravy. Pokud s amplifikací nelze do 2 hodin od přípravy začít, je možno vzorky uložit ve zmrazeném stavu při teplotě 20 C nebo nižší na dobu až jednoho týdne, přičemž zmrazit a rozmrazit se smějí jenom jednou. Kdyby se zmrazil a rozmrazil víckrát, mělo by to za následek úbytek počtu kopií. 22/53 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 2/2003, Revision 4.0