EUCAST disková difuzní metoda

Vyšetření citlivosti k antibiotikům EUCAST disková difuzní metoda Verze 4.0 Červen 2014 Změny proti verzi 3.0 jsou označeny červeně.

Obsah Strana Dodatky k dokumentům Zkratky a terminologie 1 Úvod 4 2 Příprava a skladování půd 5 3 Příprava inokula 7 4 Inokulace agarových ploten 9 5 Aplikace disků s antibiotiky 10 6 Inkubace ploten 11 7 Prohlížení ploten po inkubaci 12 8 Měření zón a interpretace citlivosti 13 9 Kontrola kvality 15 Příloha A 18 2

Dodatky k dokumentu Verze Dodatek Datum 4.0 Sekce 2.7: Nová sekce o skladování a zacházení s agarovými půdami MH-F. Červen 2014 4.0 Tabulka 1 a 3: Přidáno Corynebacterium spp. Červen 2014 4.0. Sekce 5.3.1: Revize umístění disků pro detekci indukované rezistence streptokoků ke klindamycinu. Červen 2014 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 Sekce 2.1 a 2.4: Vysvětlení ohledně přípravy a skladování půd. Tabulky 1 a 3: Přidány Pasteurella multocida, Campylobacter jejuni a coli. Sekce 3.2.2: Vysvětlení ohledně použití standardních zákalů. Sekce 4.1: Vysvětlení ohledně použití suspenze inokula. Sekce 5.3: Vysvětlení ohledně počtu antibiotických disků na plotně. Duben 2013 Duben 2013 Duben 2013 Duben 2013 Duben 2013 3.0 3.0 Sekce 5.3.1: Nová sekce. Umístění disků pro detekci indukované rezistence ke klindamycinu. Duben 2013 Sekce 8.8.2: Specifická informace ohledně zón trimethoprim sulfamethoxazolu u Stenotrophomonas maltophilia Duben 2013 3.0 Tabulka 4: Přidán Campylobacter jejuni ATCC 33560. Duben 2013 3.0 Tabulka 5: Přidána čísla sbírek DSM a CCUG pro E. faecalis ATCC 51299. Duben 2013 3.0 Příloha A: Nová sekce. Metoda EUCAST pro diskový difuzní test u Campylobacter jejuni a coli. Duben 2013 2.1 Sekce 8: Revize číslování. Nové/revidované sekce: 8.1 a 8.4. Únor 2012 2.0 2.0 2.0 Sekce 2.2: Vysvětlení ohledně výšky agaru. Leden 2012 Tabulky 1 & 3: Nová terminologie (Viridující streptokoky). Přidána Listeria monocytogenes. Leden 2012 Sekce 8: Revize číslování. Nové/revidované sekce: 8.1, 8.7, 8.7.3, 8.7.4, 8.7.6,8.7.9 a 8.7.10. Leden 2012 2.0 2.0 Tabulka 5: Přidána K. pneumoniae ATCC 700603 a E. faecalis ATCC 51299. Tabulky 4 & 5 a Zkratky: Přidána Španělská sbírka kultur. Leden 2012 Leden 2012 1.0 První vydání Prosinec 2009 3

Zkratky a terminologie ATCC BLNAR CCUG CECT CIP CNCTC DSM ESBL EUCAST MH American Type Culture Collection http://www.atcc.org ß-laktamáza negativní, ampicilin rezistentní Culture Collection University of Göteborg http://www.ccug.se Colección Española de Cultivos Tipo. http://www.cect.org Collection de Institut Pasteur http://www.cabri.org/cabri/srs-doc/cip_bact.info.html Czech National Collection of Type Cultures http://apps.szu.cz/cnctc/ Bacterial cultures from Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen http://www.dsmz.de/index.htm širokospektrá β- laktamáza European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing http:// Mueller-Hinton agar MH-F Mueller-Hinton agar -náročné bakterie (MH obohacený 5% defibrinovanou koňskou krví a 20 mg/l β-nad) MRSA NCTC ß-NAD Fyziologický roztok Methicilin rezistentní Staphylococcus aureus (s geny meca nebo mecc) National Collection of Type Cultures http://www.hpacultures.org.uk ß-nikotinamid adenin dinukleotid Roztok 0,85% NaCl ve vodě 3

1 Úvod Disková difuze je jedním z nejstarších způsobů vyšetřování antibiotické citlivosti a zůstává jednou z nejpoužívanějších metod v rutinních klinických laboratořích. Je vhodná k vyšetřování většiny bakteriálních patogenů včetně těch náročnějších, vyhovuje pro vyšetřování téměř všech antibiotik a nevyžaduje žádné zvláštní vybavení. Metoda EUCAST, podobně jako další diskové metody, je standardizovaná metoda založená na principech definovaných mezinárodní skupinou expertů v roce 1972 v publikaci International Collaborative Study of Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpointy průměrů inhibičních zón v metodě EUCAST jsou kalibrovány na harmonizované evropské breakpointy, které EUCAST bezplatně zveřejňuje na své webové stránce (http://). Jako u jiných metod, je k dosažení reprodukovatelných výsledků nutno popsanou metodu dodržovat bez jakékoli modifikace. 4

2 Příprava a skladování půd 2.1 MH agar se připraví podle pokynů výrobce, a pro náročné bakterie se obohatí podle tabulky 1. Příprava a přidání suplementů je popsáno podrobně na http://. 2.2 Výška půdy by měla být 4 mm ± 0.5 mm (přibližně 25 ml na kruhovou plotnu 90 mm, 31 ml na kruhovou plotnu 100 mm, 71 ml na kruhovou plotnu 150 mm, 40 ml na čtvercovou plotnu 100 mm). 2.3 Před použitím by měl být povrch ploten suchý. Zda je nutno plotnu sušit a délka sušení závisí na stavu ploten a podmínkách skladování. Plotny nesmí být přesušené. 2.4 Při vlastní přípravě jsou plotny skladovány při 8-10 C. Plotny skladované při 4-8 C více než 7 dnů je zapotřebí umístit do plastových sáčků. 2.5 Při vlastní přípravě ploten by měly být podmínky pro sušení a skladování uvedeny v laboratorním programu zajištění jakosti. 2.6 Komerční půdy se skladují podle pokynů výrobce do data expirace. 2.7 Agarové půdy MH-F 1 (získané od výrobce nebo vlastní přípravou), skladované v plastikových sáčcích nebo uzavřených konteinerech, může být nezbytné před použitím usušit. Tím se odstraní přebytečná vlhkost, která může být příčinou neostrých okrajů zón a/nebo povlaku uvnitř zón. 1 MH + 5% mechanicky defibrinované koňské krve +20 mg/l β-nad. 5

Tabulka 1 Bakterie Půdy pro vyšetřování citlivosti k antibiotikům Půda Enterobacteriaceae MH agar Pseudomonas spp. MH agar Stenotrophomonas maltophilia MH agar Acinetobacter spp. MH agar Staphylococcus spp. MH agar Enterococcus spp. MH agar Streptokoky sk. A, B, C a G MH-F agar 1 Streptococcus pneumoniae MH-F agar 1 Viridující streptokoky MH-F agar 1 Haemophilus spp. MH-F agar 1 Moraxella catarrhalis MH-F agar 1 Listeria monocytogenes MH-F agar 1 Pasteurella multocida MH-F agar 1 Campylobacter jejuni a coli MH-F agar 1 (viz Příloha A) Corynebacterium spp. MH-F agar 1 Ostatní náročné bakterie V přípravě 1 MH + 5% mechanicky defibrinované koňské krve +20 mg/l β-nad. 6

3 Příprava inokula 3.1 Kolonie bakterií se rozetřou přímo ve fyziologickém roztoku tak, aby zákal odpovídal stupni 0,5 McFarlandova zákalového standardu (tabulka 2), tj. přibližně 1-2 x10 8 CFU/ml u Escherichia coli. Přímý roztěr kolonií vyhovuje pro všechny bakterie, včetně náročných bakterií, jakou jsou Haemophilus spp., Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, β -hemolytické a ostatní streptokoky. 3.1.1 Suspenze se připraví z kolonií vyrostlých přes noc na selektivní půdě. K vyloučení atypických variant se odebere sterilní kličkou nebo bavlněným tamponem několik morfologicky podobných kolonií, které se rozetřou ve fyziologickém roztoku. 3.2 Suspenze inokula se standardizuje podle stupně 0,5 McFarlandova zákalového standardu. Hustší inokulum vytváří malé zóny inhibice, řídké inokulum má opačný účinek. 3.2.1 K úpravě vhodného zákalu lze doporučit fotometr. Fotometr musí být kalibrován podle pokynů výrobce na stupeň 0,5 McFarlandova zákalového standardu. 3.2.2 Alternativně se hustota inokula podle stupně 0,5 McFarlandova standardu upravuje vizuálně. Zákalový standard se před použitím energicky protřepe na vortexu (je zapotřebí postupovat podle pokynů výrobce, např. komerční standardy v gelové formě se nepromíchávají). Zákal bakterií se standardem lze snadněji porovnávat na bílém pozadí s černými linkami. 3.2.3 U Streptococcus pneumoniae se upřednostňuje příprava inokula z kultury narostlé na krevním agaru v zákalu 0,5 dle McFarlandova standardu. Pokud se připravuje inokulum Streptococcus pneumoniae z čokoládového agaru, musí být ekvivalentní zákalovému stupni 1,0 McFarlandova standardu. 3.2.4 Hustotu inokula lze upravit přidáním bakterií nebo fyziologického roztoku tak, aby odpovídala zákalu 0,5 McFarlandova standardu. 3.3 Suspenze inokula se očkuje na plotny, nejlépe do 15 minut od přípravy, a nejpozději do 60 minut.. 7

Tabulka 2 Příprava zákalového standardu 0,5 dle McFarlanda 1 K 99,5 ml 0,18 mol/l (0,36 N) H 2 S0 4 (1% v/v) se přidá 0,5 ml 0,048 mol/l BaCl 2 (1,175% w/v BaCl 2 2H 2 0) a směs se promíchá. 2 Zákal suspenze se změří na spektrofotometru v kyvetě s optickou dráhou 1 cm. Absorbance při 625 nm by měla být v rozmezí od 0,08 do 0,13. 3 Suspenze se rozplní do stejných zkumavek jako pro přípravu inokula. Zkumavky se uzavřou. 4 Uzavřené zkumavky se standardem se skladují při pokojové teplotě v temnu. 5 Bezprostředně před použitím se standard důkladně promíchá na vortexu. 6 Po 6 měsících skladování se standard připraví znovu, nebo se zkontroluje absorbance. 7 U hotových standardů z komerčních zdrojů se zkontroluje, zda absorbance je v přípustném rozmezí.. 8

4 Inokulace agarových půd 4.1 Inokulum je nejlépe použít do 15 min od přípravy, a nejdéle do 60 minut od přípravy. 4.2 Bavlněný tampon se ponoří do suspenze a přebytečná tekutina se odstraní jeho rotací po vnitřní stěně zkumavky. Je nezbytné odstranit přebytek tekutiny z tamponu, aby se předešlo nežádoucímu nadbytku inokula na plotnách, zejména u gramnegativních bakterií. 4.3 Inokulum se roztírá tamponem ve třech směrech nebo rotátorem tak, aby byl naočkován celý povrch plotny. 4.4 Disky se kladou do 15 min od inokulace ploten. Pokud jsou inokulované plotny ponechány při pokojové teplotě před aplikací disků delší dobu, bakterie mohou zahájit růst a výsledkem jsou chybné, menší zóny inhibice. Disky je tudíž nutno klást na povrch agaru do 15 min po inokulaci. 9

5 Aplikace disků s antibiotiky 5.1 Požadované obsahy disků jsou v tabulkách Breakpoint a Quality Control na http://. 5.2 Disky se aplikují pevně na povrch inokulované a suché agarové plotny. Celá plocha disku musí být v kontaktu s povrchem plotny. Po aplikaci se disk nesmí přesunovat, neboť difuze antibiotika z disku je velmi rychlá. 5.3 Počet disků na plotně je nutno omezit, aby se předešlo překrývání inhibičních zón a interferenci mezi antibiotiky. Tím lze dosáhnout spolehlivé měření průměrů zón. Počet disků na plotně závisí na vyšetřovaném druhu bakterie a na výběru disků. Nejvyšší počet disků je obvykle 6 na 90 mm a 12 na 150 mm kruhové plotně. 5.3.1 Pro detekci indukované rezistence ke klindamycinu u stafylokoků a streptokoků se disky s erytromycinem a klindamycinem umístí ve vzdálenosti 12-20 mm od okrajů disků pro stafylokoky a 12-16 mm od okrajů disků pro streptokoky. 5.4 Obvyklým zdrojem chyb je ztráta aktivity antibiotik v discích, která se projeví jako zmenšení inhibiční zóny. Je nezbytné postupovat takto: 5.4.1 Skladovat disky, včetně těch v dispenzorech, v uzavřených kontejnerech s vysoušečem a chráněné proti světlu (některé z nich, jako metronidazol, chloramfenikol a fluorochinolony, inaktivuje delší expozice světlu). 5.4.2 Skladovat zásobní disky při -20, pokud výrobce neudává jinak. Není li to možné, pak skladovat disky při <8 C. 5.4.3 Skladovat pracovní disky při <8 C. 5.4.4 Před otevřením je nutno kontejner s disky umístit do pokojové teploty, aby se zabránilo kondenzaci vody. 5.4.5 Po datu expirace je nutno disky vyhodit. 10

6 Inkubace ploten 6.1 Do 15 min od aplikace disků se plotny obrátí víčkem dolů a dají se inkubovat. Pokud jsou plotny po aplikaci disků ponechány při pokojové teplotě, vytváří se nežádoucí velké zóny v důsledku predifuze. 6.2 Stohování ploten v inkubátoru ve sloupcích je příčinou nerovnoměrné teploty ploten. Výkonnost inkubátorů je odlišná a proto je zapotřebí v rámci programu laboratorní kontroly kvality kontrolovat podmínky inkubace, včetně přiměřeného počtu ploten ve sloupcích. 6.3 Plotny je třeba inkubovat podle podmínek uvedených v tabulce 3. 6.4 Při vyšetřování glykopeptidů jsou u některých kmenů Enterococcus spp. rezistentní kolonie viditelné až po inkubaci trvající plných 24h. Po 16-20h sice lze plotny odečíst a hlásit případnou rezistenci, ale izoláty, které se po této době jeví jako citlivé, musí být inkubovány plných 24h. Tabulka 3 Bakterie Podmínky inkubace ploten pro vyšetřování citlivosti k antibiotikům Podmínky inkubace Enterobacteriaceae 35±1 C na vzduchu po 16-20h Pseudomonas spp. 35±1 C na vzduchu po 16-20h Stenotrophomonas 35±1 C na vzduchu po 16-20h Acinetobacter spp. 35±1 C na vzduchu po 16-20h Staphylococcus 35±1 C na vzduchu po 16-20h Enterococcus spp. 35±1 C na vzduchu po 16-20h (po 24h pro glykopeptidy) Streptokoky sk. A, 35±1 C v 4-6% CO2 na vzduchu po 16-20h Streptococcus 35±1 C v 4-6% CO2 na vzduchu po 16-20h Viridující 35±1 C v 4-6% CO2 na vzduchu po 16-20h Haemophilus spp. 35±1 C v 4-6% CO2 na vzduchu po 16-20h Moraxella 35±1 C v 4-6% CO2 na vzduchu po 16-20h Listeria 35±1 C v 4-6% CO2 na vzduchu po 16-20h Pasteurella 35±1 C v 4-6% CO2 na vzduchu po 16-20h Campylobacter Corynebacterium spp. Ostatní náročné bakterie Viz Příloha A 35±1 C v 4-6% CO2 na vzduchu po 16-20 h. Nedostatečně vyrostlé izoláty jsou ihned reinkubovány a inhibiční zóny se odečítají po celkové době inkubace 40-48 h. V přípravě 11

7 Prohlížení ploten po inkubaci 7.1 Správné inokulum, dobře rozetřené na plotny, poskytuje splývavý nárůst. 7.2 Nárůst by měl být rovnoměrně rozprostřený na plotně, aby zóny inhibice byly ostré, s nevykousanými okraji. 7.3 Málo koncentrované inokulum vytváří izolované kolonie a vyšetření je nutno opakovat. 7.4 Kontroluje se, zda inhibiční zóny kontrolních kmenů jsou v přípustném rozmezí. 12

8 Měření zón a interpretace citlivosti 8.1 Okraje zón se u všech antibiotik odečítají ve vzdálenosti 30 cm od oka, od bodu úplné inhibice viditelné pouhým okem. 8.2 Neobohacené plotny se odečítají ze spodní strany proti tmavému pozadí v odraženém světle. 8.3 Obohacené plotny se odečítají po odstranění víčka z horní strany v odraženém světle. 8.4 Plotny nelze odečítat v procházejícím světle (kdy je plotna umístěna proti zdroji světla) nebo pomocí lupy, pokud není stanoveno jinak (viz dále). 8.5 Průměry zón lze měřit na nejbližší milimetr pravítkem, posuvným měřítkem nebo automatickým odečítáním zón. 8.6 Průměry inhibičních zón se odečítají s odkazem na tabulky breakpointů, viz http://. 8.7 Pokud se plotny odečítají s pomocí šablon, je zapotřebí umístit plotnu na šablonu a zóny interpretovat podle vyznačených breakpointů EUCAST. Je zapotřebí se ujistit, že breakpointy na šabloně jsou podle poslední verze tabulky breakpointů EUCAST. Program pro vyrobení šablony je volně dostupný na http://bsac.org.uk/susceptibility/template-program. 8.8 Specifické pokyny pro odečítání: 8.8.1 Kolonie rostoucí uvnitř inhibiční zóny se subkultivují, reidentifikují a je-li zapotřebí, opakuje se vyšetření citlivosti. 8.8.2 Antagonisté v půdě mohou být příčinou jemného růstu v zóně kolem disku se sulfonamidem nebo trimethoprimem. Takový růst se přehlíží a průměr zóny se změří od jejího okraje. Stenotrophomonas maltophilia může masivně růst uvnitř zóny kolem trimethoprim-sulfametoxazolu. Takový růst se přehlíží, a pokud je jakýkoli náznak inhibiční zóny, změří se její průměr. Až pokud není přítomna žádná známka inhibice, hodnotí se výsledek jako žádná zóna. 8.8.3 Jemný růst uvnitř zóny ampicilinu u Enterobacteriaceae, který se může vyskytnout u některých šarží MH agaru, se přehlíží. 8.8.4 Izolované kolonie E. coli uvnitř inhibiční zóny kolem mecillinamu se přehlíží. 8.8.5 Plazivý růst Proteus spp. uvnitř inhibičních zón se přehlíží. 8.8.6 Zóna kolem benzylpenicillinu se u stafylokoků prohlíží v blízkosti procházejícího světla (proti zdroji světla). Izoláty, které mají průměr inhibiční zóny breakpoint pro citlivost, avšak s ostrými okraji zón, se označí jako rezistentní. 13

8.8.7 Při detekci methicilinové rezistence pomocí disku s cefoxitinem se změří zřetelný průměr zóny, která se pak při dobrém osvětlení pečlivě prohlíží a pátrá se po koloniích uvnitř zóny. Tyto kolonie mohou být kontaminace, nebo jsou známkou heterogenní rezistence k methicilinu. 8.8.8 Zóna kolem linezolidu se u stafylokoků prohlíží v procházejícím světle (proti zdroji světla). 8.8.9 Zóna kolem vankomycinu se u enterokoků prohlíží v blízkosti procházejícího světla (proti zdroji světla). Neostré okraje a kolonie uvnitř zóny jsou známkou rezistence a měly by být dále vyšetřeny. 8.8.10 U hemolytických streptokoků na půdě MH-F se odečítá inhibice růstu, nikoli hemolýzy. β-hemolýza je obvykle prostá růstu, zatímco α-hemolýza a růst se obvykle překrývají. 14

9 Kontrola kvality 9.1 Ke sledování kvality vyšetření se používají specifické kontrolní kmeny (tabulka 4). Doporučené základní kontrolní kmeny jsou typické citlivé kmeny. Pro ověření metod k detekci rezistence, zprostředkované známými mechanizmy rezistence, by se měly používat také rezistentní kmeny (tabulka 5). Tyto kmeny mohou být zakoupeny z komerčních zdrojů. 9.2 Kontrolní kmeny se uchovávají v podmínkách, které udržují životaschopnost a vlastnosti kmenů. Vyhovující je skladování kmenů na skleněných korálcích při -70 C v glycerolovém bujonu. Nenáročné bakterie mohou být uchovávány při -20 C. Každý kmen by měl být uchováván ve dvou lahvičkách, v jedné pro použití a ve druhé v archivu jako případná náhrada lahvičky pro použití. 9.3 Každý týden se korálek z lahvičky pro použití subkultivuje na příslušnou neselektivní půdu a ověří se čistota kultury. Z této čisté kultury se každý den týdne připraví jedna subkultura. Náročné bakterie obvykle přežívají na plotně po dobu pěti až šesti dnů a proto se subkultivace provádí nejvýše jeden týden. 9.4 Přípustná rozmezí inhibičních zón kontrolních kmenů jsou na http://. 9.5 Ke sledování kvality vyšetření se používají doporučené kmeny pro kontrolu kvality. Kontrolní testy by měly být prováděny a vyhodnocovány denně, zejména s antibiotiky, které jsou v rutinní sestavě. V každý den, kdy se vyšetření provede, se prohlédnou výsledky posledních 20 konsekutivních testů. Prozkoumají se výsledky trendů a zón, které opakovaně spadají nad nebo pod přípustné rozmezí. Pokud dva nebo více z 20 testů jsou mimo přípustné rozmezí, je zapotřebí vyšetřit příčinu. 9.6 Kontrolní kmeny by měly být vyšetřovány denně až do doby, kdy je provádění testu vyhovující (nejvýše 1 z 20 testů je mimo přípustné rozmezí), poté lze stanovit frekvenci testů na jednou týdně. Pokud se nedaří dosáhnout standardní kvality vyšetření, je třeba zjistit příčinu. 9.7 Kromě rutinní kontroly kvality je zapotřebí vyšetřit každou novou šarži Mueller- Hinton agaru k ověření, zda poskytuje výsledky všech inhibičních zón v přípustném rozmezí. Disky s aminoglykosidy mohou odhalit nepřípustné odchylky v obsahu dvojmocných kationů v půdě, tigecyklin může odhalit odchylky v obsahu hořčíku, trimethoprim - sulfamethoxazol může ukázat problémy s obsahem thyminu a erythromycin může odhalit nepřípustné ph půdy. 15

Tabulka 4 Kmeny pro rutinní kontrolu kvality Bakterie Kmen Vlastnosti Escherichia coli ATCC 25922 Citlivý, divoký typ NCTC 12241 CIP 7624 DSM 1103 CCUG 17620 CECT 434 CNCTC 5276 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Citlivý, divoký typ NCTC 12934 CIP 76110 DSM 1117 CCUG 17619 CECT 108 CNCTC 5482 Staphylococcus aureus ATCC 29213 Slabý producent β-laktamázy NCTC 12973 CIP 103429 DSM 2569 CCUG 15915 CECT 794 CNCTC 5480 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Citlivý, divoký typ NCTC 12697 CIP 103214 DSM 2570 CCUG 9997 CECT 795 CNCTC 5483 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Chromozomálně řízený nízký stupeň NCTC 12977 rezistence k penicilinu CIP 104340 DSM 11967 CCUG 33638 CNCTC 5043 Haemophilus influenzae NCTC 8468 Citlivý, divoký typ CIP 5494 CCUG 23946 CNCTC 7425 Campylobacter jejuni ATCC 33560 Citlivý, divoký typ NCTC 11351 Podmínky vyšetření, viz Příloha A CIP 702 DSM 4688 CCUG 11284 CNCTC 7365 16

Tabulka 5 Další kmeny pro kontrolu k detekci specifických mechanizmů rezistence Bakterie Kmen Vlastnosti Escherichia coli ATCC 35218 Producent TEM-1 β-laktamázy, rezistentní k NCTC 11954 ampicilinu CIP 102181 DSM 5564/5923 CCUG 30600 CECT 943 CNCTC 5321 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Producent ESBL (SHV-18) NCTC 13368 CCUG 45421 CECT 7787 Staphylococcus aureus NCTC 12493 Heterorezistentní MRSA, meca pozitivní Enterococcus faecalis ATCC 51299 Rezistentní k vysoké koncentraci NCTC 13379 aminoglykosidů (HLAR) a k vankomycinu CIP 104676 (vanb pozitivní) DSM 12956 CCUG 34289 CNCTC 5530 Haemophilus influenzae ATCC 49247 ß-laktamáza negativní, ampicilin rezistentní NCTC 12699 (BLNAR) CIP 104604 DSM 9999 CCUG 26214 CNCTC 5063 17

Příloha A Disková difuzní metoda pro Campylobacter jejuni a coli Při vyšetřování citlivosti diskovou difuzní metodou EUCAST u Campylobacter jejuni a coli musí být dodržen následující postup (Tabulka A1) Tabulka A1 Disková difuzní metoda pro Campylobacter jejuni a coli Půda Mueller-Hinton agar s 5% defibrinované koňské krve a 20 mg/l β-nad (MH-F). Plazivému růstu lze předejít sušením ploten MH-F před inokulací (při 20-25 C přes noc, nebo s odstraněným víčkem při 35 C po dobu 15 min). Inokulum McFarland 0,5 Mikroaerobní prostředí 41±1 C 24 hodin Inkubace Růst po inkubaci by měl být splývavý. Některé izoláty C. coli po 24 hodinách dostatečně nerostou. Ihned po odečtení jsou dále inkubovány a zóny se odečítají po 40-48 hodinách. Inkubační teplota 41±1 C zajišťuje optimální podmínky pro růst Campylobacter spp. Odečítání Kontrola kvality Standardní postup odečítání podle EUCAST zahrnuje: Odečítání MH-F ploten se provádí zepředu po odstranění víčka v odraženém světle. Odečítá se na plotně vzdálené zhruba 30 cm od prostého oka, v místě úplné inhibice růstu na okraji inhibiční zóny. Inhibiční zóny u Campylobacter jejuni ATCC 33560 musí být v definovaném rozmezí (http://). 18

X EUCAST EUROPEAN COMMITTEE ON ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY TESTING European Society of Clinical Microbiology a Infectious Diseases