ANALÝZA STEROIDŮ ZE SKUPINY ANDROGENŮ A GLUKOKORTIKOIDŮ POMOCÍ UHPSFC-MS/MS

UNIVERZITA KARLOVA FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE ANALÝZA STEROIDŮ ZE SKUPINY ANDROGENŮ A GLUKOKORTIKOIDŮ POMOCÍ UHPSFC-MS/MS Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: prof. PharmDr. Lucie Nováková, Ph.D. Hradec Králové 2020 Taťána Gazárková

ABSTRAKT Univerzita Karlova, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie Kandidát: Taťána Gazárková Školitel: prof. PharmDr. Lucie Nováková, Ph.D. Název diplomové práce: Analýza steroidů ze skupiny androgenů a glukokortikoidů pomocí UHPSFC-MS/MS Cílem této práce bylo vyvinout a optimalizovat metodu pro separaci směsi 37 steroidů pomocí ultra-vysokoúčinné superkritické fluidní chromatografie s hmotnostní detekcí (UHPSFC MS/MS). Analýzy probíhaly s využitím systému Acquity UPC 2 s hmotnostním detektorem typu trojitého kvadrupólu Xevo TQ-XS firmy Waters. V prvním kroku byla nezbytná důsledná charakterizace prekurzorů jednotlivých analyzovaných látek s následným provedením Skenu produktových iontů a výběru vhodných SRM přechodů. Steroidy jsou izomerní a vzájemně izobarické látky poskytující často stejné prekurzorové ionty ([M+H] +, [M+H-H 2O] +, případně [M+H-2H 2O] + ) nebo obdobná fragmentační spektra. To je komplikováno skutečností, že ne vždy je nejintenzivnějším iontem spektra právě [M+H] +, ale třeba i [M+H-H 2O] + iont, který je zároveň izobarickou m/z pro úplně jinou látku. Po pečlivém výběru SRM přechodů byla dále provedena optimalizace podmínek iontového zdroje pro pozitivní i negativní mód. V dalším kroku byl proveden screening 18 stacionárních fází. Gradientová eluce využívala CO 2 (složka A) s 5 40 % MeOH + 0,1% NH 4OH (složka B) v průběhu 5 minut s následným izokratickým krokem při 40 % složky B po dobu 1 minuty. Podmínky separace byly nastaveny následovně: teplota 40 C, průtok 1,5 ml/min, tlak 150 bar. V rámci screeningu bylo nejlepší separace dosaženo na kolonách Torus 1-AA a GreenSep Naphthyl HC, jejichž podmínky separace byly dále optimalizovány. Bylo testováno 5 mobilních fází s odlišnou eluční sílou (MeOH, MeOH:ACN 1:1, EtOH, IPA, IPA:ACN 1:1) za různých podmínek gradientové eluce s variovanou délkou analýzy. Dále byla optimalizována teplota kolony v rozmezí 22 50 C a testován vliv gradientových křivek 2, 4, 6, 8 a 10. Nejlepší selektivity separace bylo dosaženo na koloně Torus 1-AA (100 x 3,0 mm, 1,7 µm) při použití MeOH (složka B) v lineárním gradientu 1 až 20 % složky B, v délce analýzy 13 minut a následnou 2minutovou ekvilibrací kolony, při teplotě 22 C. Klíčová slova: androgeny; glukokortikoidy; steroidy; UHPSFC-MS/MS; vývoj metody; optimalizace Poděkování: Tato práce vznikla za podpory projektu STARSS reg. č.: CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000465 spolufinancovaného z EFRR. 2

ABSTRACT Charles University, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Analytical Chemistry Candidate: Taťána Gazárková Supervisor: prof. PharmDr. Lucie Nováková, Ph.D. Title of Diploma Thesis: Analysis of steroids from the group of androgens and glucocorticoids using UHPSFC-MS/MS The goal of this study was to develop and optimize an analytical method for the separation of 37 steroids mixture by the ultra high performance supercritical fluid chromatography hyphenated to mass spectrometry (UHPSFC MS/MS). Analysis was carried out using Waters Acquity UPC 2 system coupled to Xevo TQ-XS mass spectrometer. In the first step it was necessary to consistently characterize the precursor ions of each analyte. Then, the Product ion scan was carried out and proper SRM transitions were chosen. Steroids are isomeric and isobaric substances that often provide the same precursor ions ([M+H] +, [M+H-H 2O] +, eventually [M+H-2H 2O] + ), or similar fragmentation spectra. This is complicated by the fact that most intense ion of the spectrum is not always [M+H] +, but also [M+H-H 2O] + ion which is simultanously isobaric m/z for a completely differnt compoud. After careful selection of SRM transitions, the conditions of the ion source were optimized for both positive and negative modes. In the next step, the screening of 18 stationary phases was carried out. The gradient elution involved CO 2 (solvent A) and 5 40 % MeOH + 0.1% NH 4OH (solvent B) in 5 minutes with isocratic step hold for 1 minute at 40 % of solvent B. The chromatographic conditions were set as follows: temperature 40 C, flow-rate 1.5 ml/min and ABPR pressure 150 bar. The most successful separation was obtained with Torus 1-AA and GreenSep Naphthyl HC columns, that become subject of following optimization. According to different elution strength, the 5 mobile phases (MeOH, MeOH:ACN 1:1, EtOH, IPA, IPA:ACN 1:1) were tested in several gradient conditions, with various time of analysis. Further, the temperature optimization was carried out in the range 22 50 C and the effect of gradient curves 2, 4, 6, 8 and 10 was measured. The best selectivity of separation was achieved using the Torus 1-AA (100 x 3.0 mm, 1.7 µm) with CO 2 and MeOH (solvent B) in the linear gradient elution from 1 to 20 % of solvent B in 13 minutes, and 2 minutes of equilibration in combination with the temperature of analysis 22 C. Keywords: androgens; glucocorticoids; steroids; UHPSFC-MS/MS; method development; optimization Acknowledgements: This work was supported by the STARSS project (Reg. No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000465) co-funded by ERDF. 3

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpal(a), jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V Hradci Králové dne 15.05.2020 Taťána Gazárková 4

Mé největší poděkování patří prof. PharmDr. Lucii Novákové, Ph.D. za její odborné a obětavé vedení, trpělivost a cenné rady poskytnuté při zpracování diplomové práce. Děkuji také pracovníkům Katedry analytické chemie za pomoc a vstřícné jednání, stejně tak jako své rodině a přátelům za podporu během celého studia. 5

OBSAH ABSTRAKT... 2 OBSAH... 6 SEZNAM ZKRATEK... 8 1 ÚVOD... 10 2 CÍL A ZADÁNÍ PRÁCE... 11 3 TEORETICKÁ ČÁST... 12 3.1 Superkritická fluidní chromatografie... 12 3.1.1 Ultra-vysokoúčinná superkritická fluidní chromatografie... 12 3.1.2 Instrumentace v SFC... 13 3.1.3 Stacionární fáze v SFC... 14 3.1.4 Mobilní fáze v SFC... 18 3.1.5 Detektory v SFC... 19 3.2 Spojení SFC s MS... 19 3.2.1 Iontové zdroje... 20 3.2.2 Hmotnostní analyzátor... 20 3.2.3 Rozhraní pro spojení UHPSFC MS... 21 3.3 Steroidy... 22 3.3.1 Struktura a klasifikace steroidů... 23 3.3.2 Biosyntéza steroidů, metabolismus a degradace... 24 3.3.3 Inaktivace aktivních metabolitů a katabolismus... 26 3.3.4 Syntetické steroidy... 26 3.3.5 Fyzikálně-chemické vlastnosti analyzovaných steroidů a jejich struktury... 26 3.3.6 Publikované metody zabývající se analýzou steroidů... 30 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 34 4.1 Přístrojové vybavení a materiál... 34 4.2 Stacionární fáze... 34 4.3 Použitá rozpouštědla a aditiva... 35 4.4 Standardy analyzovaných steroidů... 35 4.5 Pracovní postup... 35 6

4.5.1 Příprava zásobních roztoků standardů... 35 4.5.2 Příprava pracovních roztoků a směsí standardů... 35 4.5.3 Příprava mobilních fází a oplachových kapalin... 36 4.6 Vývoj UHPSFC MS/MS metody... 37 4.6.1 Výchozí chromatografické podmínky... 37 4.6.2 Optimalizace podmínek iontového zdroje... 38 4.6.3 Screening stacionárních fází... 38 4.6.4 Screening mobilních fází... 39 5 VÝSLEDKY A DISKUZE... 40 5.1 Optimalizace MS metody... 40 5.1.1 MS Sken a výběr prekurzorových iontů... 40 5.1.2 Výběr produktových iontů... 44 5.1.3 Optimalizace parametrů iontového zdroje... 47 5.1.4 Optimalizace kolizní energie, tvorba SRM přechodů... 48 5.2 Optimalizace chromatografické separace... 49 5.2.1 Screening stacionárních fází... 49 5.2.2 Optimalizace chromatografických podmínek na koloně CSH PFP... 65 5.2.3 Optimalizace chromatografických podmínek na koloně GreenSep Naphthyl... 67 5.2.4 Optimalizace chromatografických podmínek na koloně Torus 1-AA... 72 5.3 Výsledné podmínky UHPSFC chromatografické separace... 85 6 ZÁVĚR... 90 7 CITOVANÉ LITERÁRNÍ ZDROJE... 91 8 PŘÍLOHY... 99 7

SEZNAM ZKRATEK 1-AA 2-EP 2-PIC ACN AmF APCI API AR BEH BPR CAD CAH CCM CE CEC CI CoA CSH DEA DMEM ELSD ESI EtOH F5 FA GC HMG-CoA HSS IPA LC LLE LSER MEKC MeOH MF MS N/A NH 4F 1-aminoantracen 2-ethylpyridin 2-pikolylamin Acetonitril Mravenčan amonný Chemická ionizace za atmosférického tlaku Ionizace za atmosférického tlaku Aromatický substrát fenyl Hybridní sorbent s ethylenovými můstky Regulátor zpětného tlaku Detektor nabitého aerosolu Kongenitální adrenální hyperplazie Konvergenční manažer (odpovídá BPR) Kapilární elektroforéza Kapilární elektrochromatografie Chemická ionizace Koenzym A Hybridní povrchově nabitá částice Diethylamin Dulbeccovo modifikované médium Odpařovací detektor rozptylu světla Ionizace elektrosprejem Ethanol Pentafluorofenyl Kyselina mravenčí Plynová chromatografie Hydroxy-methyl-glutaryl koenzym A reduktáza Vysoce odolný silikagel Isopropanol, 2-propanol Kapalinová chromatografie Extrakce kapalina-kapalina Model vztahu lineární solvatační energie (Linear solvation energy relationship) Micelární elektrokinetická chromatografie Methanol Mobilní fáze Hmotnostní spektrometrie Nedostupné (not available) Fluorid amonný 8

NH 4OH NP-LC PDA PFP PP Q QqQ RP18 RP-LC SFC SFE SIM SLE SPE SRM TOF t R UHPLC UHPSFC UV/VIS Hydroxid amonný Kapalinová chromatografie v systému normálních fází Detektor diodového pole Pentafluorofenyl Proteinová precipitace Kvadrupól Trojitý kvadrupól Reverzní fáze s C18 řetězcem Kapalinová chromatografie v systému reverzních fází Superkritická fluidní chromatografie Superkritická fluidní extrakce Selektivní záznam jednoho, nebo více iontů LLE s využitím inertního nosiče (supported liquid extraction) Extrakce na tuhé fázi Monitorování vybrané reakce Analyzátor doby letu Retenční čas Ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie Ultra-vysokoúčinná superkritická fluidní chromatografie Ultrafialovo-viditelná oblast 9

1 ÚVOD Steroidy jsou spíše lipofilní, strukturní nebo signální organické molekuly s metabolickou aktivitou. Sehrávají svou roli v reakci na stresové situace, regulují metabolismus sacharidů a tuků, ovlivňují metabolismus minerálních látek a distribuci vody, kontrolují a umožňují sexuální diferenciaci a reprodukci, nebo naopak potlačují některé funkce imunitního systému a tiší zánětlivé stavy. Společný prekurzor jejich syntézy tvoří cholesterol, jehož struktura vychází ze steranového jádra (cyklopentanoperhydrofenantren) a jednotlivé látky se liší pouze drobnými strukturními obměnami. Analyty jsou často izomerní a vzájemně izobarické sdílejí tak stejný sumární vzorec a molekulovou hmotnost, což z analýzy steroidů činí opravdovou výzvu. S ohledem na strukturu poskytují často jednotlivé analyty stejné prekurzorové ionty [M+H] + nebo [M+H-H 2O] + a obdobná fragmentační spektra. To je navíc komplikováno skutečností, že ne vždy je nejintenzivnějším iontem spektra právě [M+H] +, ale třeba i [M+H-H 2O] + iont, který je zároveň izobarickou m/z pro úplně jinou látku. Například ztráta hydroxy skupiny jednoho analytu tak může vést ke křížovým interferencím s jiným analytem s odlišným strukturním vzorcem, který je zároveň izobarem fragmentovaného steroidu. Tato skutečnost zdůrazňuje nezbytnost účinné chromatografické separace. Analytickou výzvou je stejně tak i citlivost detekce, jak vyplývá ze struktury látek. Za zlatý standard analýzy steroidů jsou dnes považovány metody kapalinové a plynové chromatografie s hmotnostní detekcí, které představují dostatečně citlivou a selektivní analytickou techniku. Superkritická fluidní chromatografie kombinuje výhody výše zmíněných chromatografických technik a díky použití nadkritické oxidu uhličitého přináší nové možnosti separačních mechanismů. Aplikace této metody se nabízí také díky fyzikálně-chemickým vlastnostem analyzovaných steroidů a povaze mobilní fáze, jejíž polarita je ovlivňována zvoleným organickým modifikátorem. Tato diplomová práce se zabývá vývojem a optimalizací metody ultra-vysokoúčinné superkritické fluidní chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní detekcí pro skupinu biogenních i syntetických steroidů. 10

2 CÍL A ZADÁNÍ PRÁCE Cílem této diplomové práce je ověřit vhodnost ultra-vysokoúčinné superkritické fluidní chromatografie (UHPSFC) ve spojení s tandemovou hmotnostní detekcí jako separační techniky pro analýzu směsi 37 strukturně podobných analytů ze skupin C21, C19 a syntetických steroidů. V úvodu bylo nezbytné získání informací o analyzovaných látkách, konkrétně informace o jejich struktuře a fyzikálně chemické vlastnosti, jako molekulová hmotnost, log P, pk a či donory a akceptory protonů. Dalším krokem byl vývoj a optimalizace MS metody. V prvním kroku byly vybrány vhodné prekurzorové ionty, pro které jsou v případě steroidů charakteristické také ztráty 1 nebo 2 hydroxy skupin. Následovala optimalizace parametrů iontového zdroje s využitím metody SIM a následně optimalizace kolizní energie v módu SRM, vytvořeném na základě skenu produktových iontů. Největší výzva spočívala v optimalizaci UHPSFC separační metody, ve které byl nejprve za podmínek generického gradientu proveden screening následujících stacionárních fází: BEH, CORTECS HILIC, GreenSep Diol, Torus DIOL, Torus DEA, BEH Amide, BEH 2-EP, Torus 2-PIC, CSH PFP, Ascentis Express F5, Kinetex Biphenyl, GreenSep Naphthyl, Torus 1-AA, HSS C18 SB, ACE C18, BEH Shield RP18, ACE C18-AR a ACE C18-PFP. Pro stacionární fáze s nejlepší selektivitou separace (Torus 1-AA a GreenSep Naphthyl) byl proveden screening 5 mobilních fází (MeOH, MeOH:ACN 1:1, EtOH, IPA, IPA:ACN 1:1) a optimalizace nastavení gradientové eluce, která zahrnovala změnu procentuálního zastoupení na počátku (1, 3, 5, 10 a 15 %) a konci gradientového programu (40, 30, 25 a 20 %), volbu gradientové křivky (2, 4, 6, 8 a 10) a změnu délky analýzy. Kromě výše zmíněných parametrů byl také testován vliv teploty v rozmezí 20 50 C. 11

3 TEORETICKÁ ČÁST 3.1 Superkritická fluidní chromatografie 3.1.1 Ultra-vysokoúčinná superkritická fluidní chromatografie Superkritická fluidní chromatografie (SFC) je separační technika kombinující vlastnosti plynové i kapalinové chromatografie, využívající superkritickou tekutinu jako mobilní fázi (MF). Vysoká difuzivita a nízká viskozita jsou vlastnosti podobné plynu, umožňující dosažení vyšší účinnosti separace při vyšším průtoku MF a zachování nízkého tlaku. Z kapaliny vycházejí vlastnosti jako hustota a solvatační schopnost [1]. V počátcích byl jako MF využíván čistý a nadkritický oxid uhličitý (CO 2, složka A), který se svou polaritou přibližuje k hexanu nebo heptanu, což umožňovalo analyzovat pouze nepolární až mírně polární látky. K rozšíření spektra možných aplikací směrem k polárním analytům došlo díky změně polarity mobilní fáze pomocí organických modifikátorů a aditiv [2 4]. Problémy s robustností dřívější instrumentace vyřešila inovace regulátoru zpětného tlaku (BPR) spolu s novými designy čerpadel a dalšími úpravami. Instrumentace dnešních SFC systémů vychází z instrumentace ultra-vysokoúčinné kapalinové chromatografie, což umožňuje dosažení vyššího tlakového limitu (415 bar) a přináší také snížení mimokolonových objemů. To umožňuje použití moderních stacionárních fází s velikostí plně porézních částic menší než 2 µm a povrchově porézních částic menších než 3 µm. Lze tak hovořit o ultra-vysokoúčinné superkritické fluidní chromatografii (UHPSF). Kombinací široké škály organických modifikátorů a aditiv je umožněno pokrýt obdobné spektrum aplikací, jaké nabízí kapalinová chromatografie v různých separačních módech, čímž se metoda UHPSFC stává zajímavou alternativou [5]. Dnešní obliba této techniky také roste díky nízké spotřebě organických rozpouštědel, schopnosti separovat izomerní analyty i ekologičnosti CO 2, která může být určena například jeho nízkou toxicitou a skutečností, že využíván je oxid uhličitý vzniklý jako vedlejší produkt například v potravinářském průmyslu. SFC je dnes využívanou technikou v oblastech farmaceutické analýzy, bioanalýzy, analýzy přírodních a chirálních látek, lipidomiky, nebo analýzy potravin, olejů a agrochemikálií [2,6,7]. UHPSFC metoda je také testována pro své možnosti v oblasti forenzní a dopingové analýzy či metabolomiky [8,9]. 12

3.1.2 Instrumentace v SFC Současná UHPSFC instrumentace nejčastěji vychází z uspořádání UHPLC systémů. Hlavní odlišností je systém čerpadel a regulátor zpětného tlaku. Schéma základní SFC instrumentace znázorňuje Obrázek 1. Zahrnuje zásobní ocelovou lahev s CO 2, zásobní lahve s organickými modifikátory, binární čerpadlo, regulátor zpětného tlaku (BPR), kolonový termostat, automatický dávkovač a detektor. V případě spojení s hmotnostním detektorem bývá součástí systému rovněž další pomocné čerpadlo (make-up pumpa) přivádějící přídavnou kapalinu a dělič toku [3]. Obrázek 1: Instrumentace v SFC, upraveno dle [3]. V rámci této diplomové práce byl použit celostí systém pro SFC ACQUITY UltraPerformance Convergence Chromatography (UPC 2 ) uvedený na trh firmou Waters v roce 2012 [10]. Binární čerpadlo je v tomto systému tvořeno čerpadlem A, přivádějící kapalný CO 2 a čerpadlem B, které díky spojení se čtyřcestným ventilem umožňuje přívod a volbu modifikátorů mobilní fáze. Pro zachování kapalného skupenství CO 2 je čerpadlo A aktivně chlazeno Peltierovým článkem. Konvergenční modul (CCM) zodpovídá za vstup CO 2, odtlakování dávkovací smyčky před nástřikem vzorku a je rovněž aktivním regulátorem zpětného tlaku. Tento modul tvoří statická a dynamická část ABPR (automatic back pressure regulator). Statická část odpovídá za konstantní hodnotu zpětného tlaku, zatímco dynamická část zajišťuje jeho jemnější kontrolu [5,11]. Vlivem BPR dochází k udržení konstantního tlaku mobilní fáze v chromatografickém systému v průběhu analýzy, nebo mezi jednotlivými měřeními. To znamená udržení požadované hustoty mobilní fáze, stejně jako její solvatační schopnosti a zamezení posunu retenčních časů [9,11]. Nestálost tlaku v systému se rovněž projeví v případě spektrofotometrické detekce, a to kolísáním indexu lomu a šumu pozadí [5]. Kromě celostního typu uspořádání se lze na trhu setkat i s hybridními SFC systémy. Jedním z nich je 1260 Infinity Hybrid SFC/UHPLC představený v roce 2012 firmou Agilent Technologies, 13

umožňující díky systému 2 oddělených čerpadel přepínat mezi UHPLC a SFC konfigurací [5]. Výjimkou není ani spojení se systémem superkritické fluidní extrakce (SFE). Komerčně je tento systém dodáván firmou Shimadzu pod názvem Nexera UC (Unified Chromatography) [12]. Firma JASCO ve svém hybridním modelu Hybrid SFC kombinuje preparativní a analytickou techniku SFC [13]. 3.1.3 Stacionární fáze v SFC SFC umožňuje analýzu chirálních i achirálních látek. Selektivita separace je ovlivněna volbou stacionární fáze v kombinaci s mobilní fází, tvořenou CO 2 a vybraným organickým modifikátorem. Oproti kapalinové chromatografii tak není nutná volba chromatografického módu. V případě srovnání těchto 2 systémů by použití polární stacionární fáze odpovídalo módu kapalinové chromatografie v systému normálních fází (NP-LC), v případě nepolární stacionární fáze pak módu kapalinové chromatografie v systému reverzních fází (RP-LC). Dříve bylo v SFC využíváno zejména LC kolon. V současnosti se však rozrůstá spektrum výrobců s kolonami přímo určenými pro SFC. Základem stacionární fáze je obvykle silikagel modifikovaný navázanou chemickou skupinou (diol, diethylamin, 2-ethylpyridin apod.) [6,14]. Na trhu jsou k dostání například SFC dedikované kolony z řady Torus, Viridis a Trefoil firmy Waters, YMC Triart a YMC Pack od firmy YMC, řada kolon GreenSep firmy ES Industries, kolony Cosmosil SFC firmy Nacalai tesque [15 18], či kolony z řady Shimpack UC-X firmy [19]. Chirální stacionární fáze určené pro SFC nabízí například firma DAICEL (řady CHIRALPAK a CHIRALCEL) nebo YMC (řada CHIRAL ART) [18,20]. Klasifikace stacionárních fází vychází z modelu LSER (linear solvation energy relationship) tedy interakčního vztahu mezi analytem a chromatografickým systémem, který je popsán rovnicí s konstantami chromatografického systému a parametry analytu. Konstanty souvisejí se 7 interakčními schopnostmi, jimiž jsou přenos náboje, disperze, interakce dipól-dipól, tvorba vodíkových vazeb jako donor či akceptor a elektrostatické interakce ionizovaných analytů kladný náboj kationtů a záporný náboj aniontů a obojetných iontů. Klasifikací stacionárních fází se v současnosti nejvíce zabývá výzkumná skupina Caroline West [21]. Paprskový diagram (Obrázek 2) tvoří právě těchto 7 deskriptorů. Nepolární stacionární fáze leží vlevo, polární vpravo a jsou tedy umístěny na opačných stranách diagramu. V případě stacionárních fází se smíšeným chováním jsou aromatické fáze umístěny nahoře, nepolární fáze s včleněnou skupinou dole [21]. V rámci screeningu stacionárních fází při vývoji metody je obvyklým postupem výběr analytických kolon z různých oblastí diagramu tedy s odlišnou polaritou a mechanismem retence [5]. 14

Obrázek 2: Paprskový diagram se 7 deskriptory vyjadřujícími rozdílnou selektivitu stacionárních fází používaných v SFC [21]. V rámci této diplomové práce byl proveden screening celkem 18 stacionárních fází. Stacionární fáze byly tvořeny buď plně porézními částicemi s velikostí částic menší než 2 µm, nebo povrchově porézními částicemi o velikosti menší než 3 µm. Výjimku tvořila analytická kolona GreenSep Naphthyl (3 µm) důsledkem nedostupnosti kolony s menší velikostí plně porézních částic. Vlastnosti stacionárních fází použitých v rámci diplomové práce a seřazených dle polarity shrnuje Tabulka 1. Analytické kolony byly tvořeny několika druhy sorbentů a typů částic. Řada CORTECS vychází z povrchově porézních částic na bázi silikagelu. BEH jsou částice tvořené hybridním silikagelem zesíťovaným ethylenovými můstky. Jedná se plně porézní částice, lišící se navázaným ligandem (př. amid, 2-EP). Kolony z řady Torus používají dvěma stupni modifikované BEH částice. Vlastní selektivita těchto kolon vychází z navázaného ligandu (DIOL, DEA, 2-PIC, 1-AA.). Stacionární fáze založené na CSH sorbentu využívají pozitivního náboje povrchově nabitých částic a navázaný ligand pentafluorofenyl. Z pohledu separace se uplatňují 2 mechanismy retence a chromatografii lze s využitím této stacionární fáze označit za vícemodální. Sorbent HSS je tvořen vysoce odolným silikagelem a spolu s CSH patří do komerční řady Viridis, kam lze řadit rovněž sorbenty BEH [22]. Obrázek 3 zobrazuje schéma stacionárních fází se zaměřením na typ částic a navázané chemické skupiny. 15

Tabulka 1: Souhrn vlastností stacionárních fází použitých v této diplomové práci. Růžové podbarvení znázorňuje povrchově porézní částice. Kolona BEH CORTECS HILIC Torus DIOL GreenSep DIOL Torus DEA BEH Amide Velikost a typ částic 1,7 µm, plně por. 2,7 µm, povrchově p. 1,7 µm, plně por. 1,8 µm, plně por. 1,7 µm, plně por. 1,7 µm, plně por. Velikost pórů, spec. povrch 130 Å, 185 m 2 /g 90 Å, 100 m 2 /g 130 Å, 185 m 2 /g 120 Å, N/A 130 Å, 185 m 2 /g 130 Å, 185 m 2 /g Pokrytí uhlíkem N/A N/A N/A N/A N/A 12 % Ligand - - Diol (OH) Diol Diethylamin Amid Endcaping N/A - - N/A - - Limitní tlak 415 bar 1240 bar 415 bar N/A 415 bar 1 240 bar Limitní teplota 60 C 45 C 60 C N/A 60 C 90 C Výrobce a reference Waters [22] Waters [22] Waters [22] ES Industries [23] Waters [22] Waters [22] Kolona Torus 2-PIC BEH 2-EP CSH PFP Ascentis Express F5 Kinetex Biphenyl Torus 1-AA Velikost a typ částic 1,7 µm, plně por. 1,7 µm, plně por. 1,7 µm, plně por. 2,7 µm, povrchově p. 2,6 µm, povrchově p. 1,7 µm, plně por. Velikost pórů, spec. povrch 130 Å, 185 m 2 /g 130 Å, 185 m 2 /g 130 Å, 185 m 2 /g 90 Å, 135 m 2 /g 100 Å, 200 m 2 /g 130 Å, 185 m 2 /g Pokrytí uhlíkem N/A 9 % 10 % 5,5 % 11 % N/A Ligand 2-pikolylamin 2-ethylpyridin Fluorofenyl Fluorofenyl Bifenyl 1-aminoantracen Endcaping - - - TMS TMS - Limitní tlak 415 bar 415 bar 415 bar 600 bar 600 bar 415 bar Limitní teplota 60 C 60 C 60 C 60 C 60 C 60 C Výrobce a reference Waters [22] Waters [22] Waters [22] Sigma-Aldrich [24,25] Phenomenex [26,27] Waters [22] Kolona GreenSep Naphthyl ACE C18-AR ACE C18-PFP BEH Shield RP18 HSS C18 SB ACE C18 Velikost a typ částic 3,0 µm, plně por. 1,7 µm, plně por. 1,7 µm, plně por. 1,7 µm, plně por. 1,8 µm, plně por. 1,7 µm, plně por. Velikost pórů, spec. povchr 120 Å, N/A 100 Å, 300 m 2 /g 100 Å, 300 m 2 /g 130 Å, 185 m 2 /g 100 Å, 230 m 2 /g 100 Å, 300 m 2 /g Pokrytí uhlíkem N/A 15,5 % 14,3 % 17 % 8,5 % 15,5 % Ligand Naftalen C18 s navázaným fenylem C18 s navázaným fluorofenylem Polární skupina s navázaným C18 Endcaping N/A N/A N/A TMS - N/A Limitní tlak N/A N/A N/A 1 240 bar 415 bar N/A Limitní teplota N/A N/A N/A 50 C 60 C N/A Výrobce a reference ES Industries [23] ACE [28,29] ACE [28,29] Waters [22] Waters [22] ACE [28,29] C18 C18 16

Obrázek 3: Chemie testovaných stacionárních fází [15,16,27,29,30]. Šedý středový bod označuje povrchově porézní částice. V případě CSH PFP i Ascentis Express F5 je vázaná stejná pentafluorofenylová skupina. 17

Kromě výběru chemie stacionární fáze je dále nutno klást důraz na rozměry zvolené analytické kolony. V souvislosti s omezením rozšiřování chromatografických zón vlivem vyšších mimokolonových objemů UHPSFC systémů ve srovnání se systémy UHPLC se při použití kolon s částicemi menšími než 2 µm jako nejefektivnější jeví používat analytické kolony s rozměry 3 x 100 mm. Tím je dosaženo nejmenší ztráty účinnosti současně s nejnižší spotřebou rozpouštědel [5]. 3.1.4 Mobilní fáze v SFC Mobilní fáze je v SFC tvořena superkritickou tekutinou, což je fyzikálně chemický stav látky, dosažený při překročení kritického tlaku a teploty. Nadkritická tekutina vykazuje známky kapaliny (hustota a solvatační schopnost) i plynu (viskozita a difuzivita) [3,31,32]. V minulosti byl testován potenciál superkritické tekutiny například na oxidu dusném, argonu, xenonu, diethyletheru, propanolu, methanolu nebo vodě. V současnosti je jako mobilní fáze (složka A) téměř výhradně volen inertní, netoxický a nepolární oxid uhličitý, který dosahuje nadkritických podmínek při teplotě nad 31 C a tlaku 74 barů (1074 psi). V případě využití samotného CO 2 je aplikační rozmezí SFC úzké a také z toho důvodu je dnes mobilní fáze tvořená oxidem uhličitým spolu s organickým modifikátorem [7,33]. Organický modifikátor, který je k mobilní fázi přidávám s cílem snížit lipofilitu a zvýšit polaritu CO 2, může posunout nadkritický stav zpět do subkritické oblasti. Volba organického modifikátoru může rovněž ovlivnit selektivitu separace a tvar píku. Mezi nejběžněji využívané organické modifikátory patří methanol, ethanol, isopropanol a acetonitril, případně acetonitril v kombinaci s methanolem či isopropanolem [2,6]. V případě gradientové eluce bývá počátkem 2 5 % modifikátoru, který se v čase zvyšuje přibližně ke 40 50 %. Analýza tak může začínat v superkritické a končit v subkritické oblasti [5,34]. Efekt organického modifikátoru na tvar a symetrii píku, stejně jako na eluci analytu, nemusí být sám o sobě dostatečný. V tomto případě je obvykle zapotřebí přídavek aditiva, který může fungovat například na principu obsazení aktivních míst stacionární fáze. Tento přídavek činí 0,1 2 % objemu organického modifikátoru (složky B) [35]. Eluci kyselých látek pozitivně ovlivňuje přídavek kyseliny mravenčí, octové nebo trifluoroctové, bazické látky jsou ovlivněny přídavkem dietylaminu, trietylaminu nebo isopropylaminu [6]. Z pohledu kompatibility MS detekce je výhodné použití amonných solí, nebo těkavých kyselin či bazí, například amoniaku. V některých případech může být jako aditivum volena rovněž voda, která je mísitelná díky přítomnosti organického modifikátoru [9]. Na citlivost detekce a tvar píku má rovněž vliv objem nástřiku vzorku, který by měl dle doporučení v SFC činit přibližně 0,1 0,5 % objemu kolony. Efekt teploty a tlaku na eluční sílu mobilní fáze je v případě přítomnosti organického modifikátoru malý; jedná se tak o sekundární parametry jemného ladění separace. 18

V rámci prevence tvorby fázového rozhraní je doporučováno vycházet v průběhu primárního screeningu z teploty přibližně 40 C při tlaku 120 150 bar. V případě nastavení tlaku nad jeho kritickou hodnotu je možné snížit teplotu pod její kritickou hodnotu [5]. 3.1.5 Detektory v SFC Současná SFC instrumentace využívá pro detekci zejména propojení s detektorem diodového pole (PDA) či hmotnostním spektrometrem (MS). Možností je také připojení ELSD (odpařovací detektor rozptylu světla) či CAD (detektor nabitého aerosolu) [5]. V případě spektrofotometrické detekce, ať už UV/VIS spektrofotometru nebo PDA detektoru, je regulátor zpětného tlaku umístěn až za detektorem, z čehož vyplývá důležitost odolných detekčních cel. Za výhodu CO 2 lze považovat UV absorpci v oblasti nízkých vlnových délek (205 nm) [5,6]. 3.2 Spojení SFC s MS Hmotnostní spektrometrie (MS) je citlivá a selektivní metoda analytické chemie poskytující strukturní informace o analyzované látce. Principem je převedení neutrálních molekul na ionty plynné fáze a jejich následné rozlišení podle poměru m/z (hmotnosti a náboje). K ionizaci molekul dochází v iontovém zdroji. Ionty jsou pak díky působení magnetického nebo elektrického pole, případně jejich kombinací, separovány dle poměru m/z a po dopadu na detektor jsou převedeny na elektrický signál s příslušnou relativní intenzitou. Hmotnostní spektrometr tvoří 3 nedílné součásti (Obrázek 4) iontový zdroj, hmotnostní analyzátor a detektor. Nezbytnou součástí je dále iontová optika, sloužící k rychlení a zaostření iontů a vakuový systém [36,37]. Obrázek 4: Základní schéma instrumentace hmotnostního spektrometru. Upraveno dle [38]. 19

3.2.1 Iontové zdroje SFC je v rámci současných trendů a možností nejčastěji spojována s měkkými ionizačními technikami (ionizace za atmosférického tlaku API), konkrétně s ionizací elektrosprejem (ESI) a chemickou ionizací za atmosférického tlaku (APCI) [33]. APCI je ionizační technika založená na ion-molekulárních reakcích v plynném stavu. Jedná se o techniku blízkou chemické ionizaci (CI), používané v metodách GC-MS. Rozdílné je zejména prostředí, jelikož v případě APCI probíhá ionizace za atmosférického tlaku. Z hlediska aplikace je vhodná pro ionizaci středně polárních až nepolárních látek a poskytuje jednou nabité ionty. Princip ionizace lze popsat následovně: analyt je spolu s mobilní fází přiváděn vstupní kapilárou a na jejím konci je zmlžen a rychle odpařen. Napětí (3 4 kv), vložené na výbojovou jehlu, způsobí koronový výboj. Ten nejprve ionizuje molekuly mobilní fáze, které jsou v nadbytku a následně je pomocí ion-molekulárních interakcí s reakčním plynem ionizován i samotný analyt [39]. Do roku 2010 byla APCI nejpoužívanější ionizační technikou ve spojení SFC-MS. Jedná o hmotnostně závislou ionizační techniku, umožňující průtok mobilní fáze až 2 ml/min, což jsou průtoky dosahované v SFC. Tato ionizační technika je vhodná spíše pro nepolární a mírně polární analyty, stejně jako mobilní fáze. Po roce 2010 začala být se vzrůstající oblibou využívaná ionizace elektrosprejem. Oproti APCI se jedná o koncentračně závislý typ, který vyžaduje snížení průtoku mobilní fáze pod 0,5 ml/min [39]. ESI je technika vhodná zejména pro ionizaci polárních a středně polárních látek, aplikovatelná v širokém rozsahu m/z. Analyt je do iontového zdroje přiváděn spolu s mobilní fází pomocí vstupní (sprejovací) kapiláry. Vložením napětí (obvykle 3 5 kv) dochází na konci sprejovací kapiláry za pomoci zmlžujícího plynu k tvorbě proudu nabitých kapek (spreje). Ty jsou dále vlivem odpařování a proudu sušícího plynu zmenšovány. Při dosažení hodnoty Rayleighova limitu, kritické hustoty povrchového náboje, dochází ke Coulombické explozi, jejíž vlivem se původní nabitá kapka rozpadá na menší kapičky s rozdělením původních nábojů. Stabilita spreje je mimo vlastností analytu dále ovlivněna vloženým napětím na vstupní kapiláře, složením mobilní fáze a vlastnostmi zmlžujícího plynu. Složení mobilní fáze je ovlivněno množstvím organického rozpouštědla a koncentrací aditiv. Vlastnostmi zmlžujícího plynu jsou zde míněny zejména typ plynu, jeho průtok a teplota, což jsou taktéž podmínky optimalizace iontového zdroje. Vliv na citlivost a přítomnost matricových efektů má rovněž geometrie iontového zdroje [40,41]. ESI je rovněž hodnocena jako nejšetrnější API ionizační technika [39]. 3.2.2 Hmotnostní analyzátor Hmotnostní analyzátor je umístěn za iontovým zdrojem. Za podmínek hlubokého vakua dochází k rozdělení iontů dle poměru m/z, spolu s jejich zrychlením a fokusací. Rozdělení iontů může probíhat na základě různých fyzikálních principů. Magnetický sektor využívá zakřivení dráhy letu iontů v magnetickém poli, frekvenci harmonických oscilací sleduje orbitální past (Orbitrap), dobu 20

letu iontů zaznamenává analyzátor doby letu (TOF) [41]. Kvadrupól tvoří 4 kovové tyče kruhového nebo hyperbolického průřezu, na které je vkládáno stejnosměrné (U) a vysokofrekvenční střídavé napětí (V). Následkem vloženého napětí dochází k oscilaci iontů ve středu kvadrupólu. Pro určitý poměr U/V poskytují stabilní oscilace jen ionty s určitou hodnotou m/z. Právě tyto ionty procházejí kvadrupólem až k detektoru [40,41]. Volba hmotnostního analyzátoru ve spojení s SFC závisí na vybrané aplikaci. Nejčastěji jsou využívány jednoduchý kvadrupól (Q), trojitý kvadrupól (QqQ) a analyzátor doby letu [6]. Analyzátor typu trojitého kvadrupólu poskytuje široký rozsah hmot, umožňuje rychlý sběr dat a vysokou citlivost s nízkým rozlišením. Bývá považován za standard pro kvantitativní analýzu. Trojitý kvadrupól tvoří tři kvadrupóly seřazené v jedné linii (Obrázek 4). Druhý (prostřední) z těchto analyzátorů zastupuje kolizní celu, ve které dochází díky přítomnosti kolizního plynu k fragmentaci analyzovaných iontů. Kombinací nastavení jednotlivých kvadrupólů je možno získat několik typů záznamů sken produktových iontů, sken prekurzorových iontů, sken neutrálních ztrát a monitorování vybrané reakce (SRM). V případě MS skenu a SIM (selektivní záznam jednoho či více iontů) měří pouze první analyzátor; kolizní cela a druhý kvadrupól slouží jako iontová optika [40]. Měření těchto dvou záznamů je možné provádět i na jednoduchém kvadrupólu. V rámci této diplomové práce byl použit trojitý kvadrupól od firmy Waters Xevo TQ XS. 3.2.3 Rozhraní pro spojení UHPSFC MS Spojení SFC s hmotnostním spektrometrem se na první pohled díky dobré těkavosti CO 2 může zdát jednodušší, než reálně je. Problém v tomto spojení totiž představuje stlačitelnost mobilní fáze. Tu ovlivňuje skutečnost, že přicházející mobilní fáze již není při vstupu do MS pod vlivem regulátoru zpětného tlaku, což se projevuje snížením její hustoty. Snížená solvatační schopnost se může projevovat srážením molekul analytu a následným ulpíváním na stěně kapilár. Pro spojení SFC MS existuje vícero přístupů [3,33,39]. V případě přímého propojení SFC s MS proudí do hmotnostního spektrometru veškerá přiváděná mobilní fáze. Regulace tlaku je zajištěna pomocí pasivního BPR regulátoru, obvykle v podobě jednoduchého restriktoru. V tomto případě je ionizace silně ovlivněna složením mobilní fáze a rychlostí jejího průtoku. Stejně jako ionizace podléhá změnám také hmotnostní detekce, a tento typ spojení je proto doporučován spíše pro kvalitativní analýzu. Druhým možným spojením je pre-uv-bpr-split, jehož součástí je dělič toku tvořený T spojením s nulovým mrtvým objemem. Tok mobilní fáze je rozdělen mezi hmotnostní spektrometr a UV detektor, za kterým je umístěn BPR. Jako další alternativa bylo vyvinuto spojení využívající pomocnou kapalinu ke kontrole tlaku. Přitékající kapalina se mísí s mobilní fází pomocí T konektoru s nulovým mrtvým objemem a je spolu s mobilní fází unášena do iontového zdroje. Vlivem přítomnosti další kapaliny je vyžadováno zapojení přídavného čerpadla. Rozměry konektoru také ovlivňují možný průtok mobilní fáze [39]. 21

V rámci SFC systému použitého v této diplomové práci tvoří spojení s MS rozhraní s pomocným čerpadlem a děličem toku, umístěným před BPR (Obrázek 5). Dělič toku tvoří 2 vzájemně propojené T konektory s nulovým mrtvým objemem, umístěné mezi UV a MS detektory. Horní kapilára umožňuje přívod pomocné kapaliny z pomocného čerpadla, jejíž význam spočívá v podpoře ionizace (zdroj protonů v iontovém zdroji) a eliminaci jevů spojených se snížením rozpustnosti analytu. K potlačení ionizace dochází zejména při použití mobilních fází s nízkým obsahem organického modifikátoru; CO 2 je totiž aprotické rozpouštědlo. Spodní spojení kapilár slouží jako dělič toku, který směřuje mobilní fázi mez BPR a MS. Díky vysoké citlivosti, linearitě a robustnosti je toto rozhraní doporučováno jak pro kvalitativní, tak pro kvantitativní analýzu [3,33,39]. Obrázek 5: Schéma děliče toku (splitteru) použitého v rámci této diplomové práce. Upraveno dle [6]. 3.3 Steroidy Steroidy jsou skupina lipofilních strukturních nebo signálních organických molekul, hrající centrální roli v metabolických procesech, jako je regulace pohlavního vývoje a sexuální diferenciace, regulace krevního tlaku, metabolismus minerálních látek, reakce na stres, anebo protizánětlivé působení. Díky komplexnosti svého metabolismu a četnému množství působících enzymů je se steroidy rovněž asociováno mnoho metabolických poruch. Za zmínku stojí například kongenitální adrenální hyperplazie (CAH), charakterizovaná jako skupina autosomálně recesivně dědičných poruch syntézy steroidních hormonů důsledkem chybění některého z pěti nezbytných enzymů: 11β-hydroxyláza, 17α-hydroxyláza, 21-hydroxyláza, 3β-hydroxysteroid dehydrogenáza či p450 oxidoreduktáza. Tento enzymatický blok následně vyústí v nadměrnou syntézu jiné skupiny steroidních hormonů vlivem nadprodukce ACTH při uvolnění zpětné vazby. Nejčastěji je tímto deficitním enzymem 21-hydroxyláza, který v 75 % případů vyústí v nedostatek hormonu Aldosteronu, což se následně projevuje syndromem ztráty solí, hyponatrémií a hyperkalémií, dehydratací a hypotenzí. Vlivem neléčené adrenální poruchy může dojít až k selhání oběhu. Z klinického hlediska je tak analýza steroidů klíčová pro počáteční diagnostický, ale i prenatální screening. Z pohledu vědy je spolehlivá analýza steroidů základem pro porozumění a objasnění nových mechanismů působení steroidních hormonů [42 44]. Ve spolupráci s Akademií věd České republiky byla v rámci tohoto projektu vyvíjena metoda pro analýzu vybraných steroidů. 22

3.3.1 Struktura a klasifikace steroidů Všechny steroidy jsou deriváty 27 uhlíkatého prekurzoru cholesterolu. V průběhu syntézy zůstává zachováno základní 17 uhlíkaté jádro, označované jako cyklopentanoperhydrofenantren, častěji známé jako steran [45]. To je tvořeno 3 cyklohexanovými jádry, značenými písmeny A C, spolu s 1 cyklopentanovým jádrem označovaným písmenem D. Číslování uhlíkatých atomů je znázorněno na struktuře cholesterolu (Obrázek 6) [46,47]. Obrázek 6: Struktura steranu (cyklopentanoperhydrofenantren) a cholesterolu. Vlastní struktury. Strukturně lze steroidy klasifikovat na základě počtu uhlíků do 6 skupin: C18 (estrany), C19 (androstany), C21 (pregnany), C24 (cholany, formující žlučové kyseliny), C27 (cholestany, vedoucí k tvorbě sterolů), C27 sekosteroidy (vedoucí k tvorbě vitaminu D a jeho metabolitů) [46]. Z klinického hlediska mají význam zejména první 3 zmíněné kategorie. Obrázek 7 zachycuje základní skelet C19 a C21 steroidů, které jsou obsahem této diplomové práce. Obrázek 7: Struktura steroidů C19 (androstany) a C21 (pregnany), upraveno dle [48]. 23

3.3.2 Biosyntéza steroidů, metabolismus a degradace Steroidogeneze androgenů, mineralokortikoidů a glukokortikoidů probíhá především v kůře nadledvin (zona gromerulosa, zona fasciculata a zona reticularis). Folikulární a théca buňky ovarií produkují zejména estrogeny a progestiny, zatímco Leydigovy buňky varlat syntetizují androgeny. Steroidy jsou rovněž produkovány syncytiotrofoblastem placenty [46,49]. Syntéza 27 uhlíkatého skeletu cholesterolu vychází z molekuly acetyl-coa. Nejprve dochází ke kondenzaci 3 molekul acetyl-coa za vzniku HMG-CoA, který je následně nevratně redukován pomocí enzymu HMG-CoA reduktázy na mevalonát. Ten dále podléhá konverzi na isopentenyl pyrofosfát, jež je dále převeden na skvalen, podléhající v dalším kroku cyklizaci molekuly na lanosterol a dále je konvertován na cholesterol [50,51]. Samotná steroidogeneze začíná zkrácením 27 uhlíkatého řetězce cholesterolu o 6 atomů uhlíků na 21 uhlíkatý řetězec pregnenolonu, ze kterého se následně syntetizují všechny steroidní hormony. Tento kritický krok je katalyzován mitochondriálním enzymem cytochrom P-450 postranní řetězec odštěpující enzym (P-450scc), někdy nazýván jako 20,22-desmoláza nebo 20,22-lyáza [49]. Syntéza androgenních a estrogenních hormonů (C19 a C18 steroidů) vychází z prekurzoru 17α-hydroxypregnenolonu. V kůře nadledvin je syntéza omezena na vznik dehydroepiandrosteronu a androstendionu v důsledku nepřítomnosti enzymu 17β-hydroxysteroid dehydrogenázy (17-HSD), který dále konverzuje androstendion v testosteron. Tento enzym je produkován Leydigovými buňkami varlat. Tvorba estrogenů je podmíněna přítomností dalšího mitochondriálního enzymu cytochrom-p-450-aromatáza (P-450Arom). Substrát se liší v závislosti na produkovaném druhu estrogenu. V případě produkce estronu je substrátem androstendion, v případě estradiolu pak testosteron. Aromatázovou aktivitu vykazují buňky ovarií a placenty [49,52]. Glukokortikoidy a mineralokortikoidy (C21 steroidy) jsou syntetizovány konverzí pregnenolonu v progesteron a 17α-hydroxyprogesteron. Hydroxylace progesteronu vede ke vzniku 11-deoxykortikosteronu a kortikosteronu, který je dále hydroxylován a oxidoredukován na aldosteron. Syntéza kortizolu vychází z prekurzoru 17α-hydroxyprogesteronu, přes meziprodukty jako 11-deoxykortizol nebo kortizon [49,52]. Zjednodušené schéma syntézy C21 a C19 steroidů, včetně meziproduktů, zahrnutých v této diplomové práci, znázorňuje Obrázek 8 a Obrázek 9. Číselně byly jednotlivé standardy označeny dle pořadí v dodaném seznamu steroidů ze strany Akademie věd ČR. 24

Obrázek 8: Ilustrativní schéma syntézy C21 steroidů, zahrnující rovněž produkty sekundárního metabolismu nebo alternativní cesty syntézy steroidů. Upraveno dle [52 56]. Názvosloví steroidů popisuje Příloha 1. Barvy čísel odpovídají barvám jednotlivých steroidů v grafech dalších částí této práce. Obrázek 9: Ilustrativní schéma syntézy C19 steroidů, zahrnující rovněž produkty sekundárního metabolismu nebo alternativní cesty syntézy steroidů. Upraveno dle [52,57,58]. Názvosloví steroidů popisuje Příloha 2. Barvy čísel odpovídají barvám jednotlivých steroidů v grafech dalších částí této práce. Enzymy katalyzující biosyntetické reakce steroidů lze rozdělit do 4 hlavních skupin. Jedná se o 1) desmolázy enzymy katalyzující odstranění postranního řetězce cholesterolu, 2) hydroxylázy membránově vázané enzymy, 3) hydroxysteroid dehydrogenázy (oxidoreduktázy) enzymy katalyzující vratné reakce (např.: androstendion testosteron) a 4) aromatázy enzymy konvertující A-jádro do fenolické struktury, přítomné zejména v buňkách ovarií, placenty a mozku [46,49]. 25

3.3.3 Inaktivace aktivních metabolitů a katabolismus Jako inaktivace může být označován proces metabolické konverze biologicky aktivní látky v neaktivní. Inaktivace může probíhat na dvou úrovních, a to buď periferně (například jaterními enzymy) nebo tkáňově specificky. Za periferní inaktivaci a katabolismus jsou odpovědné z velké části játra, ale jistou katabolickou aktivitu vykazují rovněž ledviny. Inaktivní hormony jsou nejčastěji vylučovány ve své konjugované formě močí. Eliminace tak vyžaduje konverzi v hydrofilní molekulu a v závislosti na struktuře steroidu může zahrnovat některé z procesů jako redukce dvojné vazby na C-4 uhlíku, redukce oxo(keto) skupiny na C-3 uhlíku, oxidaci 17β-hydroxylové skupiny, konjugaci apod. Nejdůležitější z možností eliminace je právě konjugace, která může být realizována 2 způsoby, a to jako glukuronidace steroidů nebo tvorba sulfatovaných molekul [48,49]. 3.3.4 Syntetické steroidy Dexametazon a betametazon jsou silné, dlouhodobě působící epimerní deriváty kortizolu, oproti kterému vykazují přibližně třicetkrát vyšší protizánětlivé a imunosupresivní účinky. V klinické praxi jsou tato léčiva nejčastěji využívána v terapii obstrukčních plicních chorob [59,60]. Betametazon patří mezi 4 základní léčiva podávaná v neonatologii, jeho rolí je podpora plicní ventilace, případně léčba plicních onemocnění předčasně narozených dětí [61]. Z pohledu dopingu dochází ke zneužívání glukokortikoidů jako růstových stimulancií v oblasti jezdeckých sportů. Světová antidopingová agentura tak řadí glukokortikoidy na seznam zakázaných látek [59,60]. Problémem ve sportu je také užívání anabolických androgenních steroidů, odvozených od testosteronu. Konkrétními příklady může být androstendiol, androstendion, 7α-hydroxy DHEA a 7β-hydroxy DHEA, epiandrosteron, nebo samotný testosteron [62]. 3.3.5 Fyzikálně-chemické vlastnosti analyzovaných steroidů a jejich struktury Fyzikálně-chemické vlastnosti významné pro SFC analýzu zobrazuje Tabulka 2. Názvosloví a číselné pořadí steroidů zahrnuje Příloha 1 a Příloha 2. Většina steroidů jsou bezbarvé, bílé nebo nažloutlé pevné krystalické látky. Dle log P (rozdělovací/distribuční koeficient systému oktanol-voda) se jedná o látky spíše lipofilní, dobře rozpustné v acetonitrilu nebo methanolu. Nejméně lipofilním analytem je ve sledované skupině steroidů kortikosteron (14) s log P = 1,26. Hodnota pka (záporný dekadický logaritmus disociační konstanty pro kyseliny) se ve skupině sledovaných steroidů pohybuje v rozmezí přibližně 12 15; jedná se tak velmi často o slabé kyseliny. Analyzované látky patří spíše mezi akceptory protonu. Z pohledu struktury jsou steroidy často izobarické, stereoizomerní látky vykazující stejný sumární vzorec a molekulovou hmotnost. Jejich přehled poskytuje Obrázek 10 až Obrázek 12. Analyzované látky jsou řazeny dle molekulové hmotnosti a barevně kategorizovány dle hmoty. Barvy rámečků odpovídají barvám jednotlivých steroidů v grafech dalších částí této práce. 26

Tabulka 2: Souhrn fyzikálně-chemických vlastností analyzovaných steroidů. Číslo Zkratka Sumární vzorec m/z Log P pka Donory protonů Akceptory protonů 1 Preg C 21H 32O 2 316,24 3,98 14,605 1 2 2 17α-OH-Preg C 21H 32O 3 332,24 2,56 14,605 12,804 2 3 3 P C 21H 30O 2 314,22 3,78 N/A 0 2 4 17α -OH-P C 21H 30O 3 330,22 2,36 12,792 1 3 5 17α,20β-OH-P C 21H 32O 3 332,24 2,70 14,113 17,985 2 3 6 5α -DHP C 21H 32O 2 316,24 4,61 N/A 0 2 7 Epiallo-Preg C 21H 34O 2 318,26 4,46 14,667 1 2 8 Allo-Preg C 21H 34O 2 318,26 4,46 14,667 1 2 9 20α-OH-P C 21H 32O 2 316,24 3,62 14,690 1 2 10 11β-OH-P C 21H 30O 3 330,22 2,62 14,262 1 3 11 THDOC C 21H 34O 3 334,25 3,10 14,667 13,089 2 3 12 Allo-THDOC C 21H 34O 3 334,25 3,10 14,667 13,089 2 3 13 11-DOC C 21H 30O 3 330,22 2,42 13,087 1 3 14 CORT (B) C 21H 30O 4 346,21 1,26 14,458 13,087 2 4 15 11-DHB C 21H 28O 4 344,20 1,58 13,000 1 4 16 5α-DHB C 21H 32O 4 348,23 2,09 14,563 13,088 2 4 17 5β-DHB C 21H 32O 4 348,23 2,09 14,563 13,088 2 4 18 F C 21H 30O 5 362,21 1,88 15,270 12,555 14,710 3 5 19 21-dF (S) C 21H 30O 4 346,21 1,66 12,633 14,710 2 4 20 E C 21H 28O 5 360,19 1,48 12,277 14,623 2 5 21 ALDO C 21H 28O 5 360,19 1,76 14,105 12,911 2 5 22 T C 19H 28O 2 288,21 3,01 14.621 1 2 23 5α-DHT C 19H 30O 2 290,22 3,85 14,650 1 2 24 DHEA C 19H 28O 2 288,21 3,71 14,603 1 2 25 DHEA-S C 19H 27NaO 5S 390,15 N/A N/A 1 5 26 7α-OH-DHEA C 19H 28O 3 304,20 2,69 15,045 14,102 2 3 27 7β-OH-DHEA C 19H 28O 3 304,20 2,69 15,045 14,102 2 3 28 7-oxo-DHEA C 19H 26O 3 302,19 2,51 14,285 1 3 29 A4 C 19H 26O 2 286,19 3,50 N/A 0 2 30 EpiAST C 19H 30O 2 290,22 4,18 14,665 1 2 31 AST C 19H 30O 2 290,22 4,18 14,665 1 2 32 5α-dion C 19H 28O 2 288,21 4,34 N/A 0 2 33 5β-dion C 19H 28O 2 288,21 4,34 N/A 0 2 34 3α-diol C 19H 32O 2 292,24 3,69 14,668 14,652 2 2 35 3β-diol C 19H 32O 2 292,24 3,69 14,668 14,652 2 2 36 DEXA C 22H 29FO 5 392,20 1,78 37 BETA C 22H 29FO 5 392,20 1,78 12,406 14,861 14,124 14,861 12,406 14,124 3 6 3 6 Výše uvedené fyzikálně chemické vlastnosti byly získány z databází PubChem [63]a SciFinder [64]. 27

Obrázek 10: Struktury analyzovaných steroidů I. Vlastní obrázek. 28

Obrázek 11: Struktury analyzovaných steroidů II. Vlastní obrázek. 29

Obrázek 12: Struktury analyzovaných steroidů III. Vlastní obrázek. 3.3.6 Publikované metody zabývající se analýzou steroidů Za zlatý standard jsou dnes v klinické praxi považovány metody vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) ve spojení s hmotnostní spektrometrií, které vystřídaly dlouho používané techniky plynové chromatografie (GC) [3,52]. Nevýhodou takové metody byla nutnost derivatizace analytů. Steroidy lze rovněž analyzovat pomocí metod kapilární elektroforézy (CE) a jí přidruženými separačními módy, jako je micelární elektrokinetická chromatografie (MEKC) či kapilární elektrochromatografie (CEC) [65]. V posledních letech se rozšiřuje analýza steroidů také o metody ultra-vysokoúčinné superkritické fluidní chromatografie (UHPSFC), přičemž jednu z prvních analýz steroidů pomocí SFC-MS experimentu provedl v roce 1998 Miko Tuomola, který sledoval přítomnost androsteronu v prasečí tukové tkáni [3]. 30

Žádná z publikovaných metod nepokryla všechny steroidy analyzované v této práci. V rámci metodiky UHPSFC nebyly nalezeny studie zabývající se stanovením analytů 5 (17α,20β-OH-P), 7 (EpialloPreg), 9 (20α-OH-P), 16 a 17 (5α-DHB a 5β-DHB), 28 (7-oxo-DHEA) a 35 (3β-diol). Pro metody kapalinové chromatografie byly nejčastěji využívány stacionární fáze s C18 řetězcem, nebo modifikované fenylovou skupinou. Délka analýz se pohybovala v rozmezí 5 22 minut. Nejvíce bylo analyzováno 14 shodných analytů, přičemž nejvíce bylo v rámci 1 metody analyzováno 70 steroidních látek. Metody plynové chromatografie nejčastěji používaly pro separaci kolonu MXT-1 s délkou analýz v rozmezí 12 35 minut. Nejvíce bylo analyzováno 17 shodných analytů v metodě čítající 30 steroidů. Tabulka 3 zobrazuje nejzajímavější aplikace metod kapalinové a plynové chromatografie v analýze steroidů za posledních 5 let. V rámci metod UHPSFC byly nejčastěji voleny stacionární fáze BEH a BEH 2-EP. Délka analýz se pohybovala v rozmezí 5 až 21 minut. V případě jedné studie bylo analyzováno 25 shodných analytů, v rámci 1 metody to pak bylo 15 shodných analytů. Celkově bylo nejvíce analyzováno 51 látek v jedné studii, které byly rozděleny mezi 3 UHPSFC metody po 32, 9 a 10 analytech. Z pohledu separace izomerů lze říct, že metody obsahovaly vždy maximálně 1 pár kritických izomerů. Obrázek 13 zobrazuje příklad UHPSFC separace na koloně BEH 2-EP, dosažené v rámci jedné z publikovaných studií. Tabulka 4 ukazuje přehled nejzajímavějších aplikací metody UHPSFC v analýze steroidů. Obrázek 13: Chromatogram UHPSFC separace 19 steroidů na koloně BEH 2-EP (100 x 3,0 mm, 1,7 µm) ze studie [45]. 5α-dion (1), A4 (2), 11K-5α-dion (3), 11Keto-A4 (4), 5α DHT (5), epiast (6), 11OH-5α-dion (7), T (8), 11K-AST (9), 11OH-A4 (10), 11K-epiAST (11), 11K-DHT (12), 3α-diol (13), 11OH-AST (14), 11K-T (15), 11OH-epiAST (16), 11OH-DHT (17), 11K-3α-diol (18), 11OH-T (19). Předpona K znační keto skupinu, OH hydroxy skupinu. Barevně označeny jsou steroidy zahrnuté rovněž v této diplomové práci. 31

Tabulka 3: Publikované metody analýzy steroidů pomocí UHPLC a GC. Technika Shodné analyty; (celkový počet) Materiál Příprava vzorku Analytická kolona Mobilní fáze Detekce UHPLC 1, 3, 6, 7, 8; (12) hovězí sérum SPE HSS T3 (50 x 2,1 mm, 1,8 µm) HPLC UHPLC UHPLC UHPLC GC GC 1-4, 6, 8, 18, 20, 22-24, 31-32, 34-35; (18) 2-4, 14, 18-22, 24, 29; (15) 3-4, 6, 14, 18, 20, 23, 29, 30-31, 34, 36; (70) 22, 23, 29, 30, 32, 34; (19) 1-8, 11-12, 14, 18, 20, 22-24, 29; (30) 1, 3, 22-24, 34-35; (23) Lidské a myší sérum Sérum, plazma, tkáň endometria Mořská a říční voda DMEM médium Myší sérum GC 1, 22-24; (4) Plazma Nádorová tkáň prsu LLE Homogenizace, LLE SPE LLE SLE Derivatizace Homogenizace, ethylenkarbonyl. derivatizace LLE Derivatizace Raptor Biphenyl (100 x 2,1 mm, 2,7 µm) Kinetex Biphenyl (100 x 2,1 mm, 1,7 µm) Hypersil Gold (100 x 2,1 mm, 1,9 µm) HSS T3 (50 x 2,1 mm, 1,8 µm) MXT-1 (30 m x 0,25 mm, 0,25 µm) MXT-1 (30 m x 0,25 mm, 0,25 µm) HP-5 ms (30 m x 0,25 mm, 0,25 µm) A: H2O:FA B: ACN:FA A: H2O B: MeOH A: H2O:NH4F B: MeOH:H2O:NH4F A: H2O:FA B: MeOH:FA A: 0,1% FA B: MeOH Helium Helium Helium MS/MS (QTrap) MS/MS (QqQ) MS/MS (QqQ) MS/MS (QTrap) MS/MS (QqQ) MS/MS (QqQ) MS/MS (QqQ) MS/MS (QqQ) Čas [min] 14 21,5 21 12,5 5 34 12 13,5 Rok Zdroj 2020 [66] 2019 [67] 2018 [68] 2017 [69] 2016 [45] 2018 [70] 2018 [71] 2015 [72] ACN acetonitril, DMEM Dulbeccovo modifikované médium, FA kyselina mravenčí, MeOH methanol, LLE extrakce kapalina-kapalina, NH4F fluorid amonný, SLE LLE s využitím inertního nosiče, SPE extrakce na tuhé fázi 32

Tabulka 4: Publikované metody analýzy steroidů pomocí UHPSFC. Shodné analyty (celkový počet) 3-4, 6, 10, 18-20, 22-24, 29, 31-32, 34; (28) 3-4, 6, 10, 18-20, 22-24, 29, 30-32, 34; (31) 22, 23, 29, 30, 32, 34; (19) Materiál Vous Ryouše sloního Příprava vzorku Extrakce 100% MeOH Analytická kolona BEH (100 x 3,0 mm, 1,7 µm) Sérum LLE BEH (100 x 3,0 mm, 1,7 µm) DMEM médium LLE BEH 2-EP (100 x 3,0 mm, 1,7 µm) 25; (12) Bovinní moč LLE, SPE BEH 2-EP (100 x 3,0 mm, 1,7 µm) 1-3, 6, 22-24, 26-27, 29-33; (32) Standardy v MeOH a ACN (mozkomíšní mok*) 2x Zorbax Rx-Sil Rapid Resolution HT (100 x 3,0 mm, 1,7 µm) rekonstituce 4, 11-14, 18-20; (9) Torus Diol (150 x 3,0 mm, 1,7 µm) (N/A) 25; (10) BEH 2-EP (100 x 3,0 mm, 1,7 µm) 36, 37; (49) Moč Filtrace, ředění Torus 2-PIC (100 x 3,0 mm, 1,7 µm) Mobilní fáze B: MeOH (2-25 %) B: MeOH (2-25%) B: MeOH (2-9,5 %) B: MeOH:H2O:AmF (5-30 %) B: IPA (2-45 %) B: MeOH (7-30 %) B: MeOH:H2O + 40 mm AmF B: MeOH:H2O + 20 mm AmF Make-up kapalina N/A MeOH + 0,1% FA MeOH + 0,1% FA MeOH:H2O + 0,1% FA MeOH:H2O + 1 mm NH4F MeOH:H2O + 1 mm AmF + 0,1% FA MeOH:H2O + 5 mm NH4F + 0,1% FA MeOH Detekce MS/MS (QqQ) MS/MS (QqQ) MS/MS (QqQ) MS/MS (QqQ) MS/MS (QqQ) MS/MS (QqQ) Čas [min] 6 6 5 12 21 10 14 Rok Zdroj 2020 [73] 2018 [74] 2016 [45] 2015 [75] 2018 [76] 7 [77] AmF mravenčan amonný, ACN acetonitril, FA kyselina mravenčí, IPA isopropanol, LLE extrakce kapalina-kapalina, MeOH methanol, NH4F fluorid amonný, SPE extrakce na tuhé fázi, * - metoda byla na mozkomíšní mok pouze testována, metoda nebyla validována a nebyl určen způsob přípravy vzorku 33

4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Přístrojové vybavení a materiál UHPSFC systém Acquity UPC 2 : binární čerpadlo, automatický dávkovač, kolonový termostat, regulátor zpětného tlaku, make-up čerpadlo, PDA detektor, Waters, Milford, MA, USA Xevo TQ-XS hmotnostní spektrometr, Waters, Milford, MA, USA Analytické váhy, Sartorius, Goettingen, Německo Automatické mikropipety se špičkami, Eppendorf, Hamburk, Německo Ultrazvuková lázeň Sonorex Digitec, Bandelin electronic, Berlín, Německo Šroubovací vialky s uzávěry, Vitrum, Janov nad Nisou, ČR Total Recovery vialky s uzávěry, Thermo Scientific, Rockwood, USA Software MassLynx, v4.1, Waters, Milford, MA, USA Software TargetLynx, Waters, Milford, MA, USA 4.2 Stacionární fáze Analytické kolony firmy Waters, Milford, MA, USA Acquity UPC 2 Torus DIOL (100 x 3,0 mm, 1,7 μm) Acquity UPC 2 Torus DEA (100 x 3,0 mm, 1,7 μm) Acquity UPC 2 Torus 2-PIC (100 x 3,0 mm, 1,7 μm) Acquity UPC 2 Torus 1-AA (100 x 3,0 mm, 1,7 μm) Acquity UPC 2 Torus 1-AA (150 x 3,0 mm, 1,7 μm) Viridis CSH PFP (100 x 3,0 mm, 1,7 μm) Viridis HSS C18 SB (100 x 3,0 mm, 1,8 μm) Viridis BEH (100 x 3,0 mm, 1,7 μm) Viridis BEH 2-EP (100 x 3,0 mm, 1,7 μm) Acquity UPLC BEH Amide (100 x 3,0 mm, 1,7 μm) Acquity UPLC BEH Shield RP18 (100 x 3,0 mm, 1,7 μm) CORTECS HILIC (100 x 3,0 mm, 2,7 μm) Analytické kolony dalších výrobců GreenSep Diol (100 x 3,0 mm, 1,8 μm), ES Industries, West Berlin, NJ, USA GreenSep Naphthyl HC (100 x 3,0 mm, 3 μm), ES Industries, West Berlin, NJ, USA Ascentis Express F5 (100 x 3,0 mm, 2,7 μm), Supelco, Bellefonte, PA, USA Kinetex Biphenyl (100 x 3,0 mm, 2,6 μm), Phenomenex, Torrance, CA, USA ACE C18 (100 x 3,0 mm, 1,7 μm), ACE, Aberdeen, Skotsko ACE C18-PFP (100 x 3,0 mm, 1,7 μm), ACE, Aberdeen, Skotsko ACE C18-AR (100 x 3,0 mm, 1,7 μm), ACE, Aberdeen, Skotsko 34

4.3 Použitá rozpouštědla a aditiva Pro přípravu mobilních fází, standardních roztoků, pomocné kapaliny a oplachových kapalin byly použity tato rozpouštědla a aditiva: Acetonitril, LC MS grade, VWR International S.A.S., Fontenay-sous-Bois, Francie Methanol, LC MS grade, VWR International S.A.S., Fontenay-sous-Bois, Francie 2-Propanol, LC MS grade, VWR International S.A.S., Fontenay-sous-Bois, Francie Ethanol (> 99,7 %), VWR International S.A.S., Fontenay-sous-Bois, Francie Ultračistá voda, Millipore, destilovaná v přístroji Milli Q RG, Burlington, VT, USA Amoniak, Ammonia solution 25 %, LC MS, Merck KGaA, Darmstat, Německo Oxid uhličitý, CO 2 > 99,995 %, Messer, Bad Soden am Taunus, Německo 4.4 Standardy analyzovaných steroidů Dexametazon a betametazon (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Německo) Kortikosteron, aldosteron, androstendion, 3β-dihydroandrosteron, dihydroandrosteron (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Německo) Pregnenolon, 17α-hydroxypregnenolon, progesteron, 17α-hydroxyprogesteron, 17α,20β-dihydroxyprogesteron, 5α-dihydroprogesteron, epiallopregnanolon, allopregnanolon, 20α-hydroxyprogesteron, 11β-hydroxyprogesteron, tetrahydrodeoxykortikosteron, allotetrahydrodeoxykortikosteron, deoxykortikosteron, 11-dehydrokortikosteron, 5α-dihydrokortikosteron, 5β-dihydrokortikosteron, kortizol, 11-deoxykortizol, kortizon, testosteron, 5α-dihydrotestosteron, dehydroepiandrosteron, dehydroepiandrosteron sulfát, 7α-hydroxyDHEA, 7β-hydroxyDHEA, 7-oxoDHEA, epiandrosteron, androsteron, 5α-androstandion, 5β-androstandion (Steraloids, Newport, RI, USA) 4.5 Pracovní postup 4.5.1 Příprava zásobních roztoků standardů Zásobní roztoky 37 standardů steroidů byly připraveny v koncentraci 1 mg/ml. Do vialek bylo naváženo 0,150 0,300 mg krystalické látky, která byla rozpuštěna přibližně ve 150 300 µl acetonitrilu. Vialky byly následně vystaveny účinkům ultrazvuku po dobu 5 minut. Výjimku tvořily steroidy 2 a 25, u kterých byly vlivem snížené rozpustnosti připraveny zásobní standardy v koncentraci 100 µg/ml a 50 µg/ml. 4.5.2 Příprava pracovních roztoků a směsí standardů Pracovní roztoky byly připraveny z předchozích zásobních roztoků. Ředění obvykle probíhalo desítkovou řadou. Do vialky bylo napipetováno 100 µl zásobního roztoku, který byl doplněn 35

900 µl acetonitrilu. V průběhu experimentu bylo pracováno s koncentracemi v rozsahu 10 ng/ml až 100 µg/ml, které byly vytvořené obdobným způsobem. Pro screening stacionárních a mobilních fází, jakožto i pro optimalizaci podmínek iontového zdroje a chromatografických podmínek, byly vytvořeny 4 směsi. Zastoupení steroidů ve směsi bylo postaveno tak, aby jedna směs neobsahovala analyty se stejnou molekulovou hmotností. Tabulka 5 ukazuje složení jednotlivých směsí 1 4. Tabulka 5: Jednotlivé směsi standardů používané v rámci experimentu. SMĚS 1 3 4 5 9 14 21 23 28 29 32 SMĚS 2 1 2 10 11 15 16 20 24 26 31 34 36 SMĚS 3 6 7 13 18 19 27 33 SMĚS 4 8 12 17 22 30 35 25 Směsi byly pro analýzu připraveny v koncentraci 100 ng/ml, vyjma steroidů 34 a 35 (dihydroandrosteron a 3β-dihydroandrosteron; koncentrace 1 µg/ml), které poskytoval nízkou odezvu MS a v nižších koncentracích nebylo možné je detekovat. Při tvorbě směsí standardů bylo vycházeno z pracovních roztoků v koncentraci 10 µg/ml. Pro směs 1 bylo do jedné vialky postupně napipetováno 10 µl každého z 10 standardů a takto napipetované standardy byly doplněny 900 µl acetonitrilu. Obdobný postup byl aplikován rovněž při tvorbě směsí 2, 3 a 4. 4.5.3 Příprava mobilních fází a oplachových kapalin V rámci diplomové práce bylo testováno 6 mobilních fází (Tabulka 2). Jedná se vždy o CO 2 (složka A) s rozdílným typem organického modifikátoru (složka B), případně přídavkem aditiva. Tabulka 6: Testované mobilní fáze Složka A Složka B Aditivum 1. CO2 MeOH 0,1% NH4OH 2. CO2 MeOH:ACN 1:1-3. CO2 MeOH - 4. CO2 EtOH - 5. CO2 IPA - 6. CO2 IPA:ACN 1:1 1. MeOH + 0,1% NH 4OH Odměrná baňka o objemu 500 ml byla částečně naplněna methanolem tak, aby mohly být přidány 2 ml 25% NH 4OH. Baňka byla následně doplněná methanolem po rysku. 2. MeOH:ACN 1:1 250 ml methanolu bylo v zásobní láhvi o objemu 500 ml smíseno se 250 ml acetonitrilu. Obě kapaliny byly odměřeny pomocí odměrného válce. 36

6. IPA:ACN 1:1 250 ml isopropanolu bylo v zásobní láhvi o objemu 500 ml smíseno se 250 ml acetonitrilu. Obě kapaliny byly odměřeny pomocí odměrného válce. Jako oplachová kapalina (silná, slabá a oplachová kapalina pro písty čerpadla) byl vždy použit 100% methanol. 4.6 Vývoj UHPSFC MS/MS metody 4.6.1 Výchozí chromatografické podmínky Charakterizace steroidů (MS sken) i sken produktových iontů byly měřeny s použitím výchozích chromatografických podmínek. Zvolenou stacionární fází byla Acquity UPC 2 CSH PFP (100 x 3,0 mm, 1,7 µm). Jako mobilní fáze byla použita směs CO 2 a MeOH 0,1% NH 4OH v gradientové eluce 5 40 % při průtoku 1,5 ml/min (Obrázek 14). Pomocnou kapalinu tvořil 100% methanol s průtokem 0,3 ml/min. Analýzy probíhaly při teplotě 40 C a tlaku 150 bar (2176 psi). Jednotlivě byly nastřikovány standardy steroidů v koncentraci 1 µg/ml v objemu 1,0 µl při teplotě automatického dávkovače 10 C. Tyto jednotlivé analýzy byly klíčové pro popis chování steroidů v MS a zamezení vzájemných interferencí. Obrázek 14: Gradientový program s 5 40 % organického modifikátoru s včleněným izokratickým krokem mezi 5. a 6. minutou, s délkou analýzy 6 + 2 minuty ekvilibrace kolony. Metody SIM a SRM K dosažení alespoň částečné separace byla při měření metod SIM a SRM využita izokratická eluce. Mobilní fázi tvořil CO 2 s 5 % MeOH + 0,1% NH 4OH (složka B) v délce analýzy 6 minut. Ostatní podmínky separace teplota a tlak, objem nastřikovaného vzorku a jeho teplota, byly shodné. Analyzovány byly jak jednotlivé pracovní roztoky standardů, tak jejich směsi. 37

4.6.2 Optimalizace podmínek iontového zdroje K hmotnostní analýze byl využit hmotnostní spektrometr s trojitým kvadrupólem. Optimalizace podmínek iontového zdroje byla měřena v módu SIM, kdy byly podle dat získaných z MS skenu nastaveny m/z sledovaných prekurzorů a časová rozmezí pro jejich detekci. Optimalizace byla prováděna s využitím ESI ionizace v pozitivním a negativním módu. Optimalizace měření probíhala postupnou změnou jednoho parametru v čase, vždy formou série měření. Sledované parametry iontového zdroje uvádí Tabulka 7. Nejvýznamnějším parametrem optimalizace je napětí na kapiláře. Napětí na vstupním kuželu patří k podmínkám specifickým jednotlivým analytům. Tabulka 7: Sledovaná rozmezí optimalizovaných parametrů iontového zdroje. Sledované rozmezí Parametr ESI + ESI - Napětí na kapiláře 0,5 3,5 kv 0,5 3,5 kv Napětí na vstupním kuželu 10 120 V 5 50 V Desolvační teplota 150 550 C Desolvační plyn 500 1100 l/hod Průtok plynu na vstupním kuželu 200 350 l/hod Tlak zmlžujícího plynu 3,0 7,0 bar Pomocí skenu produktových iontů byla zjištěna fragmentační spektra jednotlivých steroidů působením vložené kolizní energie 10, 20 a 30 ev, na jejichž základě byly vybrány fragmenty s dostatečnou intenzitou, a tedy vhodné pro tvorbu SRM. Kolizním plynem byl argon. Optimalizace kolizní energie pro jednotlivé analyty probíhala pomocí zvolených SRM přechodů v sérii měření s rozsahem 5 50 ev. Pro každý pár prekurzor-fragment byla následně vybrána nejvhodnější kolizní energie, nutná k získání citlivé odezvy. 4.6.3 Screening stacionárních fází V rámci screeningu stacionárních fází bylo otestováno celkem 18 různých stacionárních fází (kapitola 4.2) s plně porézními částicemi < 2 µm a povrchově porézními částicemi < 3 µm. Výjimkou byla analytická kolona GreenSep Naphthyl s plně porézními částicemi o velikosti 3 µm. Pro každou kolonu bylo provedeno měření za generických podmínek gradientové eluce s CO 2 a MeOH + 0,1% NH 4OH 5 40 % s včleněným izokratickým krokem. Gradientový program i použité chromatografické podmínky shrnuje podkapitola 4.6.1. Průtoková rychlost činila pro většinu kolon 1,5 ml/min. V případě kolon BEH Shield RP18, Ascentis Express F5, CORTECS HILIC, ACE C18, ACE C18-AR, ACE C18-PFP byl v důsledku vyššího tlaku systému snížen průtok na 1,2 ml/min. Ke snížení průtoku na 1,2 ml/min došlo rovněž u analytické kolony Torus 1-AA s rozměry 150 x 3,0 mm, 1,7 µm. 38

Před každou analýzou bylo nutné ekvilibrovat kolonu mobilní fází, a to CO 2 se 40 % složky B po dobu 15 minut. V případě chromatografických kolon primárně určených pro UHPLC (např. Kinetex Biphenyl či BEH Shield RP18) bylo nutno nejprve vymýt mobilní fázi (transportní médium) s obsahem vody pomocí 100% acetonitrilu v systému UHPLC. Po tomto kroku byla analytická kolona umístěna do UHPSFC systému a promyta 100% methanolem. Po 15 minutách bylo sníženo procentuálního zastoupení methanolu na 50 %. Finálním krokem bylo promytí kolony 100% CO 2. 4.6.4 Screening mobilních fází Screeningu širšího spektra mobilních fází byly podrobeny 2 různé analytické kolony, konkrétně GreenSep Naphthyl (100 x 3,0 mm, 3 µm) a Torus 1 AA (100 x 3,0 mm, 1,7 µm). Chromatografické podmínky byly stejné jako v předchozích kapitolách viz podkapitola 4.6.1. Výjimku tvořil pouze druh zvoleného organického modifikátoru (Tabulka 6). V případě následující optimalizace nastavení gradientové eluce bylo měněno složení mobilní fáze na počátku a na konci gradientu, prodlužována délka analýzy. Dále byla testována teplota analýzy v rozmezí 20 50 C a vliv gradientových křivek. Měněn byl vždy jeden parametr v daném čase. 39

5 VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 Optimalizace MS metody 5.1.1 MS Sken a výběr prekurzorových iontů Prvním krokem v rámci optimalizace MS metody bylo provedení MS skenu, při kterém byl plynule proměřen celkový iontový proud v rozsahu hmot m/z 100 900. Výsledkem byl zisk spekter analyzovaných standardů v koncentraci 10 µg/ml v tomto rozsahu hmot. Všechna měření byla provedena jak v pozitivním, tak negativním módu ionizace. K ionizaci v negativním záznamu iontů docházelo kromě steroidu 25 (DHEA-S) také v případě analytů 10 (11β-OH-P), 15 (11-DHB), 16 a 17 (5α-DHB, 5β-DHB). Vyjma steroidu 25 ale tyto analyty poskytovaly signál o nízké intenzitě. Steroid 25 tak byl charakterizován deprotonovanou molekulou [M-H] - a ostatní látky byly charakterizovány v pozitivním módu ionizace. Pro 21 analytů byla jako prekurzorový iont vybrána protonovaná molekula. V některých případech byly prekurzorovými ionty molekuly po ztrátě 1 nebo 2 molekul vody [M+H-H2O] + (10 analytů) a [M+H-2H2O] + (5 analytů), což jsou typické ztráty pro steroidní struktury [52]. V případě 22 steroidů poskytoval nejvyšší relativní intenzitu iont [M+Na] +, který ale není vhodný pro kvantifikaci. Tabulka 8 popisuje vybrané produktové ionty, které jsou podbarveny zelenou barvou. Tučně jsou označeny nejintenzivnější ionty spektra, přičemž ve 22 případech byl tímto iontem [M+Na] + addukt. Barevné značky označují jednotlivé izobarické interference, přičemž nesouvisejí s barvami analyzovaných steroidů. Z tabulky je patrné, že již v tomto stádiu experimentu lze pozorovat interference vzniklé vlivem ztráty molekuly vody, vedoucí k tvorbě izobaru jiné analyzované látky. Jako takový příklad lze uvést ztrátu molekuly vody steroidu 2 (17α-OH-P), která je charakterizovaná iontovým přechodem m/z 333,25 [M+H] + 315,08 [M+H-H 2O] +, přičemž m/z 315,02 je zároveň [M+H] + iontem charakteristickým pro steroid 3 (P). Další příklady zahrnují Obrázek 15 a Obrázek 16. 40

Tabulka 8: Vybrané prekurzorové ionty získané pomocí metody SIM.. 41

Obrázek 15: MS spektra steroidů 6 (5α-DHP) a 11 (THDOC). Interference iontů jsou značeny fialovou a růžovou barvou. 42

Obrázek 16: MS spektra steroidů 10 (THDOC) a 16 (5α-DHB). Interference iontů jsou značeny mentolovou barvou. 43

5.1.2 Výběr produktových iontů Dalším krokem vývoje MS metody bylo změření skenu produktových iontů a výběr vhodných fragmentů pro sestavení SRM přechodů. Ty byly vyjma steroidu 25 (DHEA-S) provedeny v pozitivním módu. K analýze byly použity pracovní roztoky standardů v koncentraci 1 µg/ml. MS/MS spektra byla skenována v po dobu 0,15 s v rozsahu 90 až 450 m/z. Tabulka 9 shrnuje přehled získaných vybraných fragmentů. Analyt Tabulka 9: Vybrané produktové ionty v pozitivním módu, vyjma analytu 25 v negativním módu. Prekurzor (m/z) Vybrané produktové ionty Vybrané produktové ionty Prekurzor (m/z) Analyt (m/z) (m/z) 1. 2. 3. 1. 2. 3. 1 299,09 281,16 159,06 174,79 20 361,02 162,92 120,85 144,93 2 297,09 279,14 158,93 132,81 21 360,95 342,91 314,88 298,88 3 315,02 108,99 97,13 123,05 22 289,02 109,06 97,11 123,00 4 331,08 108,93 97,09 312,95 23 291,15 255,02 159,00 215,13 5 333,08 271,00 201,05 175,02 24 271,15 253,05 197,34 212,94 6 317,08 280,86 298,79 189,16 25 366,93 96,72 227,06 123,19 7 301,02 189,09 282,98 134,93 26 269,02 250,98 173,10 269,08 8 301,09 282,98 134,99 146,89 27 269,02 251,12 211,22 156,88 9 317,08 108,94 281,03 96,99 28 303,09 284,89 175,03 243,11 10 331,08 312,99 295,00 120,99 29 287,02 109,06 96,98 123,07 11 317,02 280,96 299,04 30 273,09 254,89 160,94 147,19 12 317,15 281,07 298,93 280,83 31 273,09 255,04 146,97 199,11 13 331,08 97,02 108,93 122,88 32 289,15 271,11 253,18 213,03 14 347,08 328,96 311,02 120,87 33 271,09 253,06 146,97 15 345,02 120,94 300,89 147,06 34 257,15 161,31 147,18 175,12 16 349,08 313,04 159,00 294,74 35 257,15 160,79 147,31 174,98 17 331,00 313,08 294,86 237,02 36 393,01 372,94 355,09 336,85 18 362,99 121,09 327,00 96,91 37 393,08 354,74 278,98 237,00 19 347,02 108,99 96,91 123,04 Jak ilustruje Obrázek 17 a Obrázek 18, získaná spektra produktových iontů se liší intenzitou i počtem přítomných fragmentů. Charakteristické fragmentační spektrum testosteronu (22, C21 steroid) je při kolizní energii 20 ev tvořeno 3 fragmenty: m/z 97, m/z 109 a m/z 123, jak ve své práci uvádí rovněž Lee [78]. Tyto produktové ionty jsou přítomné i u dalších steroidů z tabulky 3, 4 a 13, kde rovněž tvoří 3 vybrané fragmenty, vycházející z různých prekurzorů. Takovým z nich je například 11-deoxykortikosteron (13, C19 steroid). Získaná spektra tak pocházejí od 2 různých typů analyty. Oproti testosteronu poskytuje betametazon (37) bohatější fragmentační spektrum. Jako zvolené produkty byly vybrány m/z 237, m/z 279 a m/z 355. Mechanismy fragmentace toho analytu se ve své práci zabývá Kopylov [79]. 44

Při výběru SRM přechodů byl brán zřetel na výběr charakteristických iontů s ohledem na jejich intenzitu s cílem zabránit možným interferencím. Obrázek 17: Získaná fragmentační spektra testosteronu (nahoře) a deoxykortikosteronu (dole). Spektra poskytují typické fragmentační ionty s m/z 97, m/z 109 a m/z 123. Popis fragmentů převzat z [78,80] 45

Obrázek 18: Získané fragmentační spektrum analytu 37 (betametazon). Produkty vybrané v rámci této práce jsou označeny rámečkem. Charakterizace iontů provedena dle [79]. 46

5.1.3 Optimalizace parametrů iontového zdroje Cílem experimentu bylo nalezení optimální podmínek pro nastavení iontového zdroje tak, aby byly hodnoty relativních intenzit prekurzorových iontů co nejvyšší. V sérii měření byl vždy sledován optimalizovaný parametr v určitém rozsahu (podkapitola 4.6.2), výsledky byly hodnoceny na základě ploch píků ze získaných chromatogramů a jako průměr dvou měření vyneseny do příslušných grafů (Obrázek 19). Optimalizace nastavení iontového zdroje byla prováděna s důrazem na pozitivní mód ionizace, který byl zvoleným módem ionizace pro všechny analyty, vyjma steroidu 25 (DHEA-S). V případě negativního módu byla zvolena pouze optimalizace nejdůležitějších parametrů iontového zdroje, a tedy zkrácena na sledování vlivu napětí na kapiláře, napětí na vstupním kuželu a optimalizaci kolizní energie. Ostatní parametry optimalizace kopírují hodnoty pozitivu, jelikož se nejedná o nejdůležitější z optimalizovaných parametrů. Dosažené výsledky optimalizace shrnuje Tabulka 10. Napětí na vstupní kapiláře je jedním z nejdůležitějších parametrů optimalizace nastavení iontového zdroje. Nejlepších výsledků bylo dosaženo v rozmezí hodnot od 2,0 do 3,5 kv. Kompromisem byla vybrána jako optimální hodnota 3,0 kv, která poskytovala nejlepší odezvu pro 1/3 analytů a zároveň nevede k výraznému snížení intenzity odezvy pro žádný z analytů. Obrázek 19 ukazuje výsledky optimalizace napětí na vstupní kapiláře pro steroidy 12 až 19. Obrázek 19: Výsledky optimalizace napětí na vstupní kapiláře pro vybrané steroidy. 47