Masarykova univerzita v Brn P írodov decká fakulta Bakalá ská práce Zm ny erytrocyt po lokální kryoterapii Vypracovala: Martina R ži ková Vedoucí práce: MUDr. Lenka Forýtková, CSc. Brno, kv ten 2008
Prohlašuji, že jsem bakalá skou práci vypracovala samostatn a použila pouze uvedenou literaturu. Martina R ži ková, v. r.
Ráda bych tímto pod kovala MUDr. Lence Forýtkové, CSc. a Prof. RNDr. Vojt chu Mornsteinovi, CSc. za jejich v decké p ipomínky i odborné rady k dané problematice. Dále bych cht la vyjád it pod kování panu Miroslavu Horákovi za technickou asistenci p i sestavování aparatury a neustálou pomoc p i jakýchkoliv potížích. Paní Svatav Modrové d kuji za odbornou asistenci v ásti m ení s hlubokomrazícím boxem. Firm DN FORMED Brno, s. r. o. d kuji za bezplatné zap j ení p ístroje Cryo-T i za cenné p ipomínky k této práci.
4 Zm ny erytrocyt po lokální kryoterapii Abstrakt P sobení chladu na lidský organismus se prokázalo jako velmi ú inná podp rná metoda p i lé b revmatických a chronických zán tlivých onemocn ní pohybového aparátu. Toto tvrzení je podloženo mnoha léka skými studiemi v dc z Japonska, Polska, N mecka i Francie. Japonec Toshiro Yamauchi se zasloužil o zavedení celot lové chladové terapie do léka ské praxe, podílel se i na zkonstruování první kryokomory. Lokální kryoterapie je založena na místním chlazení postiženého místa na lidském t le. Lokální terapie je vhodná pro pacienty, kte í trpí alergií na chlad nebo z jiných d vod nemohou podstoupit terapii celot lovou. Tato práce se zabývá zm nami erytrocyt po použití p ístroje pro lokální kryoterapii Cryo-T in vitro. Pro chlazení využívá Cryo-T plyn oxid uhli itý, který má dva fyzikální ú inky funguje jako chladicí prvek a v další fázi jako biochemické inidlo. Abstract When treating rheumatic and chronic inflammatory diseases of the motional apparatus, the action of cold on human organism proved as a very effective supportive method. This argument is verified by many medical studies carried out by scientists from Japan, Poland, Germany and France. The Japanese Toshiro Yamauchi had merit in implementation a whole-body cold therapy into the practice of medicine and he participated in constructing the first cryo-chamber as well. Local cryo-therapy is based on local human body lesion cooling. Local therapy is advisable for patients who suffer cold allergy or cannot undertake a whole-body therapy for other reasons. This paper focuses on changes in erythrocytes after local cryo-therapy performed by a Cryo-T in vitro appliance. The Cryo-T appliance uses carbon dioxide which has two physical results it acts as a cooling element and a biochemical agent in the next stage.
5 Martina R ži ková Klí ová slova Kryoterapie Vasokonstrikce, vasodilatace Erytrocyty Hemolýza Sv telný mikroskop Key words Cryo-therapy Vasoconstriction, vasodilatation Erythrocytes Haemolysis Light microscope
6 Zm ny erytrocyt po lokální kryoterapii Obsah ABSTRAKT... 4 ABSTRACT... 4 KLÍ OVÁ SLOVA... 5 KEY WORDS... 5 OBSAH... 6 1 ÚVOD... 8 1.1 HISTORIE... 8 1.2 ADAPTACE NA CHLAD... 9 2 TEORETICKÁ ÁST... 11 2.1 KRYOTERAPIE... 11 2.1.1 Kryoterapie celot lová... 11 2.1.2 Kryoterapie lokální... 14 2.2 KRYOTERAPEUTICKÝ P ÍSTROJ... 16 2.2.1 Cryo-T... 16 2.2.1.1 Ovládací panel... 19 2.2.1.2 Chladicí médium... 20 2.2.1.3 Trysky... 20 2.2.2 Ú inek oxidu uhli itého... 21 2.3 SV TELNÝ MIKROSKOP... 23 2.4 TEPLOM RY... 26 3 CÍL PRÁCE... 27 4 EXPERIMENTÁLNÍ ÁST... 28 4.1 METODIKA... 28 4.2 POUŽÍVANÁ ZA ÍZENÍ... 30 4.3 SUSPENZE ERYTROCYT... 30 4.4 HEMOLÝZA ERYTROCYT... 30
7 Martina R ži ková 4.5 ZPRACOVÁNÍ VÝSLEDK... 31 5 VÝSLEDKY... 33 5.1 KONTROLNÍ M ENÍ... 33 5.2 CHLAZENÍ SUSPENZE ERYTROCYT, TEPLOTA M ENÁ POMOCÍ LIHOVÉHO TEPLOM RU... 33 5.3 CHLAZENÍ SUSPENZE ERYTROCYT, TEPLOTA M ENÁ POMOCÍ DIGITÁLNÍHO TEPLOM RU... 33 5.3.1 Rychlé rozmrazení chlazené suspenze erytrocyt... 34 5.3.2 Rozmrazení chlazené suspenze erytrocyt p i pokojové teplot... 34 5.4 CHLAZENÍ SUSPENZE ERYTROCYT POMOCÍ MRAZICÍHO BOXU... 36 5.5 CHLAZENÍ SUSPENZE ERYTROCYT POMOCÍ KAPALNÉHO DUSÍKU... 36 5.6 CHLAZENÍ SUSPENZE ERYTROCYT P I STEJNÉ TEPLOT CHLADICÍ SM SI... 39 5.7 CHLAZENÍ SUSPENZE ERYTROCYT V R ZNÝCH KONCENTRACÍCH... 40 6 DISKUZE... 41 7 ZÁV R... 43 8 SEZNAM LITERATURY... 44 8.1 KNIHY... 44 8.2 ELEKTRONICKÉ ZDROJE... 44
8 Zm ny erytrocyt po lokální kryoterapii 1 Úvod 1.1 Historie Skute nost, že chlad p sobí na lidský organismus blahodárn, pozorovali lidé již velmi dávno. Lé bu prost ednictvím nízkých teplot používali už sta í Egyp ané asi 2500 p ed naším letopo tem, v 5. století p ed n. l. Hippokrates poukázal na výrazné analgetické p sobení chladu na organismus. V širším rozm ru se tato metoda rozvinula v pr b hu napoleonských válek, kdy se velký po et t žkých zran ní ešil amputacemi a na znecitliv ní poškozených kon etin se dávaly obklady z ledu anebo sn hu. V odborné terminologii se za al používat název narkóza chladem hypotermie. Po átky sou asné kryogeniky (konec 19. století) úzce souvisejí s technickým pokrokem, který umožnil zkapal ování a dlouhodobé uchovávání plyn, ale také pr myslovou produkci vzniklých chladicích tekutin. Od roku 1907 se v medicín objevuje pojem kryochirurgie, která se zabývá destrukcí tkání pomocí nízkých teplot. B hem první poloviny 20. století se rozvinula kryobiologie, v da o bun ných zm nách podmín ných extrémn nízkými teplotami. V návaznosti na ni se zrodila kryoterapie, tedy impulsní stimulující povrchové aplikace nízkých teplot v krátkém asovém úseku (dv až t i minuty). Zavedení kryoterapie do léka ské praxe se p ipisuje Japonci Toshiro Yamauchimu z revmatologického institutu v Oite, který se podílel i na zkonstruování první kryogenické komory na sv t (1978). Od prvního užití celot lové chladové kryoterapie (CChT) Yamauchim, který s její pomocí lé il revmatoidní artritidu, ub hlo již více než 25 let. V tomto období se tato terapeutická metoda rozší ila hlavn v Evrop, o zdokonalení této technologie se zasloužili p edevším polští a n me tí odborníci. Indika ní spektrum chladové terapie je velmi rozsáhlé. Kryoterapie se úsp šn používá jak v oblasti akutní (klinické, rehabilita ní, ambulantní) a láze ské, tak i ve sportu. Na základ znalostí fyziologického ú inku krátkodobého chladu na lidský organismus se v posledních deseti letech poda ilo v decky zd vodnit a vysv tlit ú inky této metody. V dnešní dob se využívá chladová terapie celot lová i lokální.
9 Martina R ži ková 1.2 Adaptace na chlad lov k si udržuje v pr b hu dne i noci tém konstantní t lesnou teplotu. Tato teplota kolísá pouze v rozmezí 1 C. Zm nu t lesné teploty m žeme pozorovat p i dlouhodobé fyzické zát ži, p i nemoci nebo p i extrémních vn jších podmínkách. T lesná teplota je regulována principem zp tné vazby. Termoregula ní centrum najdeme v zadní ásti hypothalamu. Sem p icházejí informace jak z periferních receptor, které jsou uloženy v k ži, tak i z centrálních receptor, které se nacházejí v p ením hypothalamu, v míše a podél velkých cév. ím v tší je teplotní gradient mezi k ží a chladným prost edím, tím v tší jsou tepelné ztráty. Ochrana p ed tepelnými ztrátami v zásad probíhá dv ma zp soby: zv tšením izola ních schopností povrchu t la a zvýšenou produkcí tepla termogenezí. 1 Mezi d je, p i nichž dochází k zv tšení izola ních schopností povrchu t la, adíme vasokonstrikci (stažení cév) a zv tšení vrstvy podkožního tuku. V extrémním chladu bývá asto vasokonstrikce vyst ídána vasodilatací (rozší ením cév). Díky vasodilataci dojde ke zvýšení prokrvení a kon etiny tak mají v tší rezistenci v i omrzlinám. Termogeneze je umožn na svalovou inností i t esem nebo tzv. net esovou termogenezí. Zvýšeného prokrvení povrchových oblastí t la lze dosáhnout hlavn svalovou prací. Nejú inn jší metoda produkce tepla je však net esová termogeneze. Net esová termogeneze probíhá v hn dé tukové tkáni, která se vyskytuje u novorozenc a u zví at adaptovaných na chlad. U dosp lého lov ka se m že net esová termogeneze vyvíjet v bílém tuku nebo v kosterní svalovin. 2 Hlavní reak ní typy chladové aklimace m žeme rozd lit do t í skupin: Metabolická dochází ke zvýšené tvorb tepla. Izola ní tvorba tepla z stává stejná a dochází ke zvyšování izolace (vasokonstrikce, tuková vrstva). 1 P evzato z Zeman, V.: Adaptace na chlad u lov ka, možnosti a hranice. Galén, Praha 2006, str. 23. 2 P evzato z Zeman, V.: Adaptace na chlad u lov ka, možnosti a hranice. Galén, Praha 2006, str. 26.
10 Zm ny erytrocyt po lokální kryoterapii Hypotermická tvorba tepla ani vasokonstrikce se nezvyšují, dochází k poklesu t lesné teploty, organismus se adaptuje na nižší t lesnou teplotu. 3 3 P evzato z Zeman, V.: Adaptace na chlad u lov ka, možnosti a hranice. Galén, Praha 2006, str. 26.
11 Martina R ži ková 2 Teoretická ást 2.1 Kryoterapie 2.1.1 Kryoterapie celot lová Celot lová kryoterapie nebo celot lová chladová terapie (CChT) je krátkodobá terapie se systémovým ú inkem, p i níž se zpravidla používá teplota v rozmezí od -100 C do -150 C. Princip ú inku terapie se odvíjí na základ podn tu-reakce-adaptace. CChT probíhá v kryokomo e a celková doba trvání je nejvýše 3 minuty. P ed touto terapií je vždy nutno projít léka ským vyšet ením, p i n mž se zjiš ují základní životní funkce, kam pat í: poslech srdce a plic, prohmat dutiny b išní, m ení tlaku a pulzu. Léka e rovn ž zajímá anamnéza prod laných nemocí a opera ní zákroky. V pr b hu kryoterapie se teplota krve a vnit ních orgán nem ní. Teplota povrchu t la se m ní zna n. Povrchová teplota t la v oblasti hrudní kosti se m ní o 0,5 C až 3,2 C a teplota dolních kon etin dokonce o 9,5 C až 11,5 C. P i m ení teploty pod jazykem v dob terapie v kryokomo e p i -110 C, která trvala 90 vte in, se u skupiny 229 dobrovolník zjistilo, že u 78 % byl pokles teploty pod jazykem menší než 0,5 C, u 13 % nebyl zjišt n rozdíl teplot žádný a dokonce u 9 % došlo k nár stu teploty o 0,5 C. 4 Ú inek CChT spo ívá v náhlém ochlazení k že. Tím se utlumí kožní nervová zakon ení, a tudíž i vnímání bolesti. Organismus vnímá nízkou teplotu jako stresovou situaci. Dochází vyplavování látek, které mají tento stres a jeho p sobení na naše t lo snížit nebo dokonce úpln zastavit. Vyplavují se edorfiny, ozna ované jako hormony št stí, jež se významn podílejí na snížení bolesti. Dále se v krvi p i kryoterapii nacházejí ve v tší mí e kortikoidy, adrenalin a noradrenalin, které vykazují pozitivní efekt p i hojení ran a p i lé b poúrazových stav. V neposlední ad se zvyšuje i hladina mužského hormonu testosteronu. 4 P evzato z MUDr. Ernest Caban: Kryoterapia.
12 Zm ny erytrocyt po lokální kryoterapii CChT zahrnuje okamžitou vasokonstrikci s reflexní vasodilatací, prokrvení vaziva, k že, podkoží a šlachosvalového aparátu dosahuje n kolikanásobk oproti normálnímu stavu. P i pravidelných návšt vách kryokomory m žeme o ekávat uvoln ní kosterní svaloviny, zlepšení funkce kloub, zlepšené prokrvení celého t la, mizení otok a zán t v oblasti kon etin a snížení bolestivosti. Komplexní ú inky na lidský organismus jsou doprovázeny významným posílením obranyschopnosti v i akutním i chronickým nemocem. Tyto ú inky je nezbytné využít p i intenzivním procvi ení a rozpohybování jak celého t la, tak jeho bolestivých, nemocných, operovaných i jinak postižených ástí. Kombinace extrémního chladu a následného cvi ení je cesta k trvalejšímu zlepšení obtíží. U zdravého jedince by fyzická zát ž po terapii m la trvat alespo 15 min. P i intenzivním cvi ení dochází k výrazn jší látkové vým n, p i níž jsou vylu ovány látky zp sobující poškození a stárnutí bun k. K t mto látkám adíme jedy, kyselinu mlé nou a volné radikály. CChT je vhodná pro všechny, kdo se cht jí adaptovat na zvýšenou t lesnou zát ž a zvýšit si t lesnou kondici, jako je tomu nap. u sportovc. Dále je tato terapie vhodná pro osoby s civiliza ními chorobami : bolestivé páte ní syndromy chronický únavový syndrom oslabení imunitního systému (snížená odolnost v i infek ním chorobám) psychická deprese pomeran ová k že (celulitida) nadváha 5 Terapie se doporu uje i osobám s následujícími chorobami nebo chorobnými stavy: akutní a chronická zán tlivá onemocn ní kloub a páte e degenerativní kloubní onemocn ní, dna zán tlivá revmatická onemocn ní m kkých tkání a k že bolestivé kontraktury (stahy) kosterní svaloviny fibromyalgie 5 P evzato z webových stránek www.kryocentrum.cz
13 Martina R ži ková rehabilitace po operacích velkých kloub a páte e poúrazové a poopera ní hematomy a otoky autoimunitní onemocn ní a poruchy imunity roztroušená skleróza lupénka (psoriasa) s kloubními i kožními p íznaky neurodermitida ekzémy migréna chronická onemocn ní dýchacího systému astma zvon ní, pískání v uších (tinnitus) stavy po kosmetických a plastických operacích (odsátí podkožního tuku, zlepšení hojení jizvy) senná rýma 6 Využití CChT není vhodné pro osoby s: alkoholovým nebo drogovým opojením klaustrofobií strachu z malých prostor známou t žkou alergií na chlad extrémní nebo nelé enou hypertenzí s krevním tlakem stabiln p es 160/110 akutním onemocn ním srdce a ob hu (srde ní infarkt, nestabilní angína pectoris, plicní embolie, myokarditis atd.) prod lanými v posledních šesti m sících závažnými chronickými i akutními chorobami (vždy je nutno otázat se svého léka e) 7 Kryoterapie se podílí na lepším snášení fyzické námahy, omezuje nár st únavy p i svalové práci. Lepší prokrvení zpomaluje stárnutí bun k, urychluje odplavení toxických látek z t la a zlepšuje p ísun vitamín, minerál a dalších stavebních látek. 6 P evzato z webových stránek www.kryocentrum.cz. 7 P evzato z webových stránek www.kryocentrum.cz.
14 Zm ny erytrocyt po lokální kryoterapii Lé ba chladem má široké pole p sobení u lidí všech v kových kategorií (výjimku tvo í jen velmi malé d ti a velmi sta í), obou pohlaví, kde nezáleží na druhu nemoci. 2.1.2 Kryoterapie lokální Lokální používání chladu je v sou asné medicín velmi rozší ené, jeho použití nachází uplatn ní hlavn p i lé b a rehabilitaci poúrazových stav a p i onemocn ních pohybového aparátu. Používaná teplota p i lokální terapii se r zní. Japonští a n me tí odborníci pod pojmem kryoterapie rozumí teploty nižší než -100 C, kdežto v anglosaských zemích se k terapii používají i vyšší teploty než -100 C a název kryoterapie (cryotherapy) z stává. Optimální teplota chlazení není p esn známá. P i chlazení ástí t la je však optimální, aby teplota tkání dosáhla 18 C. P i nižší teplot (15 C) se zv tšuje propustnost pro tká ový mok, ímž m že dojít ke zv tšení edému. P i chlazení jednotlivých ástí t la dochází ke snížení teploty tkání, vasokonstrikci, ke zpomalení zán tlivých proces, zmenšení bolesti a snížení svalového nap tí. 8 Je to efektivní metoda snížení bolesti, což umož uje pohodln jší rehabilitaci. Dochází rovn ž k ohrani ení krevní podlitiny a zmenšení edému. as chlazení se také r zní. P i chlazení ledovými sá ky m že doba chlazení dosahovat dvacet až t icet minut. U hluboko umíst ných poškození lze dobu chlazení prodloužit až na 45 min. P i použití kryoterapeutických p ístroj, které dosahují teplot -60 C a nižších, se doba chlazení pohybuje v rozmezí 2 3 minut. Lokální kryoterapie je ur ena pro následující onemocn ní: p i revmatických a degenerativních poruchách kloub po zran ní, pohmožd ní v pr b hu rekonvalescence rehabilitace po operaci natažené svaly, svalové k e e p i syndromech bolesti u nadváhy a obezity (zvyšuje bun ný metabolismus) v kosmetice lé ba celulitidy (v kombinaci s kompresními masážemi) 9 8 P evzato z MUDr. Ernest Caban: Kryoterapia. 9 P evzato z webových stránek www.dnformed.com
15 Martina R ži ková Podrobn jší aplikace lokální kryoterapie je uvedena v kapitole o p ístroji Cryo-T, který byl používán k m ení. V pr b hu terapie je t eba dát pozor na to, aby nedošlo ke vzniku omrzlin nebo i poškození nerv p i aplikaci chladu. P i kryoterapii se pokožka zbarvuje na bílo. Tento jev vyžaduje neustálé sledování a kontrolování barvy pokožky pacienta. Lokální kryoterapie je vhodná metoda p i první pomoci v p ípad poškození pohybového aparátu, a už se jedná o svaly, šlachy i m kké tká ové struktury. Umož uje proces rehabilitace a p i poškození kloub rychlejší návrat na normální rozsah kloubového pohybu.
16 Zm ny erytrocyt po lokální kryoterapii 2.2 Kryoterapeutický p ístroj 2.2.1 Cryo-T P ístroj Cryo-T je ur en pro kryoterapii, umož uje jednoduchou a bezpe nou aplikaci chladicího média oxidu uhli itého. Chladicí médium dosahuje teplot až -75 C. Oxid uhli itý má na lidský organismus dvojí ú inek: chladicí médium zp sobuje vasokonstrikci sekundární reakcí je vasodilatace Kryoterapie pomocí p ístroje Cryo-T je vhodná metoda pro lé bu následujících chorobných stav : zlomeniny a pohmožd niny: opožd né synostózy nová poran ní pseudoarthrosis popáleniny zmírn ní teplotního šoku poopera ní rehabilitace revmatické a degenerativní kloubová onemocn ní, osteopatie: degenerace chronický postupující revmatismus ankylozující artritida v po áte ní fázi Bechterowa nemoc Scheuermannova nemoc kloubová spojení po chirurgických zákrocích na ploténkách bolestivé syndromy odvápn ní kostí osteoporóza aseptická nekróza stehenních kostí Sudeck v syndrom onemocn ní kloub : akutní a chronické zán ty periartikulární zán ty ramena degenerativní zm ny
17 Martina R ži ková mnohokloubní zán ty zán ty kotník revmatické kloubní zán ty nadm rné svalové k e e, k e ovitost onemocn ní sval, šlach, podvrtnutí, zán tlivé stavy: mezižeberních nerv sedacích nerv bolesti v k íži parézy k e ovitost bolesti v k íži migrény otékání, nadváha a otylost urychlení bun ného metabolismu kosmetická terapie celulitida 10 Možné kontraindikace u lokálních kryoterapeutických procedur jsou: kryoglobulinemie chladová aglutinace nebo hemolýza chladová hemoglobinurie chladová kop ivka p ecitliv lost na chlad Raynaudova nemoc trofické poruchy poruchy vnímavosti výrazná anémie nádory omrzliny mikrocirkula ní tká ové poruchy vážná onemocn ní srde ního a ob hového systému 10 P evzato z firemních materiál firmy DN FORMED, s. r. o., Návod k obsluze na Kryoterapeutický p ístroj Cryo-T.
18 Zm ny erytrocyt po lokální kryoterapii onemocn ní ledvin a mo ového m chý e neurologické poruchy parestézie polyneuropatie 11 Kryoterapeutický p ístroj Cryo-T se skládá ze t í hlavních ástí: ovládacího panelu, ocelové láhve, v níž je stla ený oxid uhli itý, a vym nitelných trysek umož ující p esné chlazení p edem zvolených ástí t la. P ístroj používá nap tí 220 240 V. 11 P evzato z firemních materiál firmy DN FORMED Brno, s. r. o., Návod k obsluze na Kryoterapeutický p ístroj Cryo-T.
19 Martina R ži ková Obr. 1 P ístroj Cryo-T. Zdroj: Firemní materiály firmy DN FORMED, s. r. o., Návod k obsluze na Kryoterapeutický p ístroj Cryo-T. 2.2.1.1 Ovládací panel Na ovládacím panelu p ístroje je umíst n asova. asova m í délku procedury, umož uje p ednastavení doby procedury a poté nás upozorní akustickým signálem, také umož uje akustickou signalizaci každých 30 vte in. Další displej m í celkovou dobu
20 Zm ny erytrocyt po lokální kryoterapii používání a s ítá dobu procedur od posledního resetování. Vynulování je možné delším stiskem tla ítka režimu asova e. 2.2.1.2 Chladicí médium Chladicí médium oxid uhli itý je v kapalné form uložen v ocelových lahvích. P i použití nejv tší trysky obsahuje desetilitrová láhev dostate né množství pro 45 minut terapie. P i použití nejmenší trysky m žeme provád t proceduru celé 2 hodiny. Desetilitrová láhev obsahuje asi 7,5 kg kapalného plynu. Provozní tlak oxidu uhli itého se v lahvích pohybuje mezi 5 6 MPa, maximální tlak dosahuje hodnot 8 MPa. Oxid uhli itý je netoxická látka, p i vyšších koncentracích v ovzduší m že zp sobit dušení. P i kryoterapii se do ovzduší dostává v tší množství oxidu uhli itého, proto je velmi d ležitá dobrá ventilace v místnosti, kde se procedura provádí. Tvorb v tších koncentrací oxidu uhli itého v ovzduší m žeme také zabránit p estávkami mezi terapiemi. 2.2.1.3 Trysky P ístroj Cryo-T obsahuje 3 trysky, které se liší velikostí a tvarem, ímž umož ují p esné chlazení vybrané ásti t la. a) Nejmenší tryska kryopunk ní procedury, výborn se hodí na terapie pro malé klouby a ke zmírn ní bolesti v ur itých bodech na t le. b) St ední tryska použití pro chlazení st edn velkých oblastí. Tuto trysku lze použít na kloubní spojení, kolena i kotníky. c) Nejv tší tryska vhodná pro kryoterapie velkých ástí t la, nap. hýžd, boky, ramena. K nastavení požadované teploty p i procedu e slouží nastavovací kroužek na zadní ásti trysky. Pokud tímto kroužkem oto íme ve sm ru hodinových ru i ek (p i pohledu od konce trysky), dojde v chladicím médiu ke zvýšení procenta vzduchu, a tím se zvýší i teplota proudu v trysce. P i opa ném pohybu dojde ke snížení teploty proudu chladícího média. LED kontrolka, která je umíst na na zadním konci trysky, zobrazuje teplotu chladicího média. Rozsvícení první kontrolky (zelená) signalizuje, že je p ístroj
21 Martina R ži ková p ipraven k provozu. Druhá LED kontrolka se rozsvítí p i dosažení teploty -50 C, t etí p i dosažení teploty -63 C a poslední kontrolka signalizuje teplotu -75 C. 2.2.2 Ú inek oxidu uhli itého Oxid uhli itý m že do bun k vstoupit na základ prosté difúze. Plazmatická membrána, která se nachází na povrchu bun k, je voln propustná pro malé molekuly. K t mto molekulám pat í nap. kyslík, oxid uhli itý a další. Obr. 2 Pr chod látek p es plazmatickou membránu. Zdroj: http://www.zoologie.upol.cz/osoby/fellnerova/memtrans.pdf Zvýšený obsah oxidu uhli itého v povrchové vrstv pokožky zp sobí rozší ení všech cév až po vláse nice se sou asným zvýšením obsahu kyslíku v krvi. To má za následek dokonalé prokrvení pokožky, svalstva a všech t lesných orgán v etn žláz a mozku, dob e okysli enou krví. D sledkem je zlepšená innost všech t lesných
22 Zm ny erytrocyt po lokální kryoterapii orgán a žláz, což vede k všeobecnému posílení organismu, k povzbuzení imunitního systému a sebehojivých schopností t la. 12 P i látkové vým n, která probíhá v bu kách živých organism, je jedním z kone ných produkt i oxid uhli itý. Proto je tato látka t lu vlastní a pro n p irozená. Pokud zvýšíme obsah oxidu uhli itého v pokožce t la, organismus spouští adu fyziologických proces, jejichž úkolem je dostat v tší množství dob e okysli ené krve ke všem bu kám. Hlavním ú inkem oxidu uhli itého je: vasodilatace zvýšená dodávka kyslíku do tkání Zvýšenou dodávkou kyslíku do tkání a tím i do bun k umož ujeme t lu zvýšenou tvorbu energeticky bohatých látek, tzv. adenosintrifosfát (ATP). Dostate né množství ATP vylepšuje innost tkání a orgán, které produkují látky t lu prosp šné hormony a látky imunitního systému. P evzato z webových stránek http://www.studio-evik.estranky.cz/stranka/suche-uhlicitekoupele. 12
23 Martina R ži ková 2.3 Sv telný mikroskop Mikroskop je nástroj, který nám umož uje pozorovat p edm ty, jež jsou pro sledování pouhým okem p íliš malé. Snažíme-li se dob e vid t n jaký drobný p edm t, p ibližujeme si jej k oku. Tím si zv tšujeme zorný úhel. Pokud ovšem u zdravého oka umístíme p edm t do menší vzdálenosti, než je konven ní zraková vzdálenost (= 25 cm), vidíme ho nez eteln a rozmazan. Mikroskop umož uje zv tšení zorného úhlu díky soustav o ek, a tím dovoluje prohlédnutí malých p edm t. Mikroskop se skládá ze t í základních ástí: optické soustavy osv tlovací soustavy mechanického za ízení Optická soustava se skládá ze t í ástí: objektivu, okuláru a pohyblivého tubusu. Objektiv i okulár mají kladnou optickou mohutnost, tzn. že se chovají jako spojky. Objektiv vytvá í zv tšený, skute ný a p evrácený obraz. Obraz vytvo ený objektivem se stává p edm tem pro okulár. Obraz okuláru je zv tšený, zdánlivý a p evrácený. V praxi se nej ast ji setkáme se dv ma druhy mikroskop. Jedná se o mikroskop monokulární a binokulární. Obr. 3 Schéma optické soustavy mikroskopu. Zdroj: Hrazdira, I., Mornstein, V., Škorpíková, J.: Základy biofyziky a zdravotnické techniky. Neptun, Brno 2006, 312 s.
24 Zm ny erytrocyt po lokální kryoterapii Osv tlovací soustava se skládá se sv telného zdroje, kondenzoru, zrcátka a irisové clony. U starších mikroskop je použito zrcátka, aby odráželo um lé nebo p irozené sv tlo do optické soustavy mikroskopu. Moderní p ístroje mají osv tlovací za ízení zabudováno p ímo v t le mikroskopu. Kondenzor je tvo en soustavou o ek o krátké ohniskové vzdálenosti. Jeho hlavním úkolem je soust e ovat sv tlo, které prochází pozorovaným preparátem. Kondenzor je uložen pod stolkem mikroskopu. Irisová clona je sou ástí kondenzoru a umož uje regulovat kontrast obrazu analyzovaného preparátu. Mechanická ást zahrnuje stativ, nosi tubusu, stolek a revolverovou hlavici. Stativ vytvá í velmi pevnou oporu mikroskopu, je spojen svým ramenem s nosi em tubusu a se stolkem. V horní ásti tubusu se nachází okulár, ve spodní ásti je revolverová otá ecí hlavice, v níž jsou umíst ny jednotlivé objektivy. Revolverová hlavice umož uje snadné st ídání objektiv. Na t le mikroskopu se nalézají dva šrouby makrometrický a mikrometrický. Makrometrický šroub slouží k hrubšímu posunu a zaost ení pozorovaného p edm tu. Mikrometrický šroub umož uje jemný posuv a p esné zaost ení preparátu. Celkové zv tšení Z mikroskopu se vypo ítá jako sou in zv tšení objektivu Z ob a okuláru Z ok : d Z = Z ob Z ok =, f f ok ob kde d.. konven ní zraková vzdálenost,.. optický interval mikroskopu (vzdálenost mezi obrazovým ohniskem objektivu a p edm tovým ohniskem okuláru), f ob a f ok.. ohniskové vzdálenosti objektivu a okuláru. V tuto chvíli by nás mohlo napadnout, že vhodnou volbou o ek v mikroskopu dosáhneme neomezeného zv tšení preparátu. Takové zv tšení by nám však neumož ovalo rozlišení detail vzorku. Zv tšení je tedy omezeno rozlišovací mezí mikroskopu: λ δ =, n sinα
25 Martina R ži ková kde.. m ížková konstanta (vzdálenost dvou vryp m ížky),.. vlnová délka použitého sv tla, n.. index lomu prost edí mezi elem objektivu a krycím sklí kem preparátu,.. úhel svíraný optickou osou mikroskopu s plášt m kuželu, v n mž se nacházejí paprsky, které z daného místa preparátu mohou vstoupit do objektivu a podílet se na zobrazení. Výraz ve jmenovateli se nazývá numerická apertura objektivu.
26 Zm ny erytrocyt po lokální kryoterapii 2.4 Teplom ry Teplota t la i jiných objekt je d ležitým parametrem nejen v léka ství. Mezi hlavní d vody m ení teploty pat í sledování nemocných pacient a fyziologických reakcí, lé by hypertermií a další laboratorní experimenty. P i m ení teploty teplom rem musíme vzít v úvahu následující parametry jako p esnost teplom ru, doba ustálení teplotního údaje, invazivita, tepelná kapacita i vodivost idla. Termometrie je obor, který se zabývá m ením teploty. Rozložení hodnot teploty na povrchu t la sleduje termografie. Termometrické metody d líme na m ení kontaktní a bezkontaktní. Mezi kontaktní termometrické možnosti m ení teploty pat í metody založené na tepelné roztažnosti jednotlivých látek, objem m rné látky je závislý na její teplot (rtu ové a alkoholové teplom ry), a na metody, které jsou založeny na zm nách elektrických vlastností vodi i polovodi (termistory a termo lánky). Bezkontaktní m ení teploty se provádí radia ním teplom rem. V experimentální ásti byl k m ení teploty používán klasický dilata ní lihový teplom r s rozsahem do -80 C a dále digitální teplom r pro m ení i extrémn nízkých hodnot kapalného dusíku typ GTH 175/MOP s m ícím rozsahem od -199,9 C do +199,9 C.
27 Martina R ži ková 3 Cíl práce Cílem této práce je prov it ú inky chladu na bun né úrovni. V dostupné literatu e se jen velmi málo prací zam uje na p ímý vliv chladu na bu ky. Hlavním úkolem je tedy analyzovat a popsat základní p sobení chladu na bu ky. Konkrétním zástupcem bun k budou ko ské erytrocyty. Teoretická ást má za úkol uvést tená e do dané problematiky. Seznamuje nás se základními principy kryoterapie jak celot lové, tak i lokální. Podrobn ji se zabývá p ístroji, které byly nezbytné pro m ení. Praktická ást se zabývá studiem chladové terapie na erytrocyty. Cílem je pozorování stupn hemolýzy v závislosti na zp sobu a délce chlazení suspenze erytrocyt. M ení se zam ujeme na: po etní zm ny erytrocyt p i r zných teplotách (teplotní závislost) porovnání po etních zm n erytrocyt p i používání rozdílných chladicích sm sí (oxid uhli itý, kapalný dusík) po etní zm ny erytrocyt p i chlazení suspenze o rozdílných koncentracích
28 Zm ny erytrocyt po lokální kryoterapii 4 Experimentální ást 4.1 Metodika Na kovový stojan byla pomocí svorek upevn na st ední tryska p ístroje Cryo-T. Nad ni byla v konstantní vzdálenosti upevn na plastová zkumavka se zkoumaným materiálem. Plastová zkumavka byla umíst na v takové vzdálenosti od trysky, aby chlazení oxidem uhli itým bylo co nejú inn jší, tedy se nacházela ve vrcholu kužele, který byl tryskající chladicí sm sí tvo en. Do plastové zkumavky se vložil teplom r pomocí otvoru v plastové uzáv rce zkumavky. Teplom r byl nastaven tak, aby se nacházel ve st edu zkumavky a nedotýkal se jejích okraj a aby byl uprost ed suspenze krve, tedy aby idlo teplom ru bylo dostate n pono eno v m ené kapalin a zárove se nedotýkalo dna zkumavky. Tímto by mohlo dojít ke zkreslení m ené teploty suspenze. T lo teplom ru nebo m icího idla bylo udržováno stále v konstantní vzdálenosti, aby vyhovovalo výše uvedeným podmínkám. Obr. 4 P ístroj Cryo-T uspo ádání p i m ení.
29 Martina R ži ková Obr. 5 Mikroskop Olympus CX21 s fotoaparátem Olympus SP-350 p ipojeným k po íta i. Na po íta i je spušt ný program Quick PHOTO CAMERA 2.2. Obr. 5 Celkové uspo ádání laborato e p i m ení.
30 Zm ny erytrocyt po lokální kryoterapii 4.2 Používaná za ízení P i m ení se používal p ístroj Cryo-T od firmy DN-FORMED Brno, s. r. o., ostatní vybavení poskytl Biofyzikální ústav LF MU. Dále se využíval sv telný mikroskop Olympus CX21, který byl p ipojen k po íta i p es fotoaparát Olympus SP-350. Program Quick PHOTO CAMERA 2.2 umož oval pohodln jší zp sob po ítání erytrocyt. K ur ování po tu erytrocyt bylo využito Bürkerovy po ítací kom rky (viz níže). 4.3 Suspenze erytrocyt P i m ení se užívala ko ská krev z Kliniky chorob koní na Veterinární a farmaceutické univerzit v Brn. Pro práci jsem používala 2% suspenzi ko ské krve, která se získala na ed ním pomocí sterilního fyziologického roztoku. 4.4 Hemolýza erytrocyt K po ítání erytrocyt se používalo Bürkerovy po ítací kom rky. Tato kom rka je tvo ená speciáln upraveným podložním sklem, na n mž je mikroskopická m ížka. Podložní sklo se p ikryje sklem krycím, které je p ichyceno pomocí svorek. Tímto zp sobem se vytvo í p esn definovaný prostor, v n mž se poté po ítají erytrocyty. Erytrocyty se po ítají v malých tvercích, jejichž plocha je S = 0,0025 mm 2, výška prostoru kom rky je 0,1 mm. Po et tverc, ve kterých se erytrocyty zapo ítávají, je r zný. V této práci byl pro m ení zvolen po et 20. Bürkerovo pravidlo nám íká, jak po ítat erytrocyty v jednotlivých tvercích. Zapo ítávají se ervené krvinky, které jsou uvnit tverce nebo se dotýkají horní a pravé hrany tverce.