Molekulová absorpční spektrometrie v ultrafialové a viditelné oblasti Obsah kapitoly Teorie, základní pojmy UV spektra organických sloučenin Zásady měření UV spektra biologicky významných látek Dvousložková a vícesložková analýza Derivační spektrometrie Automatizace spektrofotometrického měření FIA Teorie UVVIS spektrometrie Absorpce elektromagnetického záření změna energetického stavu molekuly změna elektronového stavu (obsazenost orbitalů): 150600 kj/mol změna vibračního stavu: 260 kj/mol změna rotačního stavu: cca 3 kj/mol vztah k vlnové délce absorbovaného záření E = E e + E v + E r = h. ν = h. c / λ h = 6,626.10 34 J s (Planckova konstanta) 1
Spektrální oblasti Označení Vzdálená ultrafialová oblast far UV (vakuová oblast) Blízká ultrafialová oblast near UV Viditelná oblast VIS λ <190 nm 190380 nm 380780 nm Absorbující látky nasycené sloučeniny monoenové sloučeniny polynenasycené a aromatické sloučeniny barevné látky Komplementarita barev λ (nm) 400435 435480 480490 490500 500560 560580 580595 595620 620760 Barva absorbovaného světla fialová modrá zelenomodrá modrozelená zelená zelenožlutá žlutooranžová červenooranžová červená Barva absorbující látky žlutozelená žlutá oranžová červenooranžová purpurová fialová modrá zelenomodrá modrozelená 2
Energetické změny při elektronových přechodech E σ* π* n π* π π* n σ* σ σ* n π Pravděpodobnost přechodu ovlivňuje absorpční koeficient souvislost se spinovým stavem excitovaného elektronu: 1) přechod S0 (základní singlet) S1 (vyšší singlet) je spinově dovolený ε max 10 3 10 5 l.mol 1.cm 1 2) přechod S0 T1 (triplet) je spinově zakázaný ε max 10 0 l.mol 1.cm 1 σ Základní pojmy chromogen = absorbující látka chromofor = skupina (seskupení atomů v molekule), která způsobuje absorpci v UVVIS oblasti auxochrom = substituent nebo skupina atomů s volným elektronovým párem (např. Cl, OH, SH, NH 2 ); v konjugaci s πelektronovým chromoforem obvykle vyvolává posun λ max k delším vlnovým délkám bathochromní posun (červený posun) = posun λ max k delším vlnovým délkám vyvolaný chemickou modifikací molekuly nebo vlivem rozpouštědla hypsochromní posun (modrý posun) = posun λ max ke kratším vlnovým délkám hypochromní efekt = snížení ε max hyperchromní efekt = zvýšení ε max 3
Chromofory a odpovídající přechody Chromofor, příklad sloučeniny H 2 O C=O, H CH=O H 2 C=CH CH=O C=N N=N σ σ* 183 C=S n π* 500 NO 2 n π* 420450 N=O Přechod CC a CH, CH 4 σ σ* cca 170, 173 CX, CH 3 OH, CH 3 NH 2, CH 3 I n σ* 180260, 187, 215, 258 C=C, H 2 C=CH 2 π π* 160190, 162 H 2 C=CH CH=CH 2 π π* 217 n π*, π π* n π*, π π* n σ*, n π* n π* n π* 270, 170200, 270, 185 328, 208 190, 300 340 630700 Konjugované polyeny n H (CH=CH) n H CH 3 (CH=CH) n CH 3 2 217 4,3 223 4,4 3 268 4,7 275 4,5 4 304? 310 4,9 5 334 5,1 341 5,1 4
αkaroten, λ max = 447 nm βkaroten, λ max = 451 nm γkaroten, λ max = 462 nm lykopen, λ max = 476 nm Benzoidní aromatické sloučeniny Sloučenina Benzen Toluen Brombenzen Fenol Benzaldehyd Acetofenon Kys. benzoová Anilin Styren Skořicový aldehyd Kys. skořicová Bifenyl 204 207 210 211 250 246 230 230 247 285 273 248 3,9 3,8 3,9 3,8 4,1 4,0 4,1 3,9 4,0 4,4 4,3 4,2 254 261 261 270 280 280 273 280 281 2,0 2,4 2,3 3,2 3,0 3,0 3,0 3,5 2,0 320 320 1,7 1,7 5
Spektra kondenzovaných aromatických uhlovodíků Pětičlenné heterocykly Sloučenina Furan Furfural 2Acetylfuran Pyrrol 2Acetylpyrrol Thiofen 2Acetylthiofen Thiazol 200 227 225 210 250 260 4,0 3,3 3,4 4,2 3,6 3,9 272 269 240 287 235 285 240 4,1 4,1 2,5 4,2 3,7 3,7 3,6 6
Šestičlenné heterocykly Sloučenina Pyridin 195 250 3,3 2Pikolin 262 3,4 Pyrazin 260 3,7 Chinolin 227 4,6 275 3,7 313 3,4 Isochinolin 218 4,9 262 3,6 317 3,5 Pyrimidin 343 3,3 Indol 225 4,7 270 3,8 Zásady spektrometrického měření výběr kyvety křemenné pro UV oblast skleněné pro VIS b 0,15 cm optimální rozsah A 0,12 výběr rozpouštědla záznam spektra rychlost skenu horší opakovatelnost spektrální interval užší (0,20,5 nm) vysoké rozlišení, horší opakovatelnost širší (1,54 nm) malé rozlišení, lepší opakovatelnost měření absorbance vhodné pro široké absorpční pásy (VIS oblast) ředění vzorku jen pro stabilní absorbující látky 7
Rozpouštědla pro UV spektrometrii Rozpouštědlo Spodní mez λ (nm) Rozpouštědlo Spodní mez λ (nm) acetonitril, voda 190 chloroform 240 isooktan, cyklohexan 195 ethylacetát 260 hexan 201 dimethylformamid 270 methanol, ethanol 205 octová kys. 270 1,4dioxan 215 benzen 280 diethylether 220 toluen 285 glycerol 230 pyridin 300 dichlormethan 233 aceton 330 Vliv rozpouštědla na absorpční spektrum V různých rozpouštědlech se mírně liší: hodnoty λ max, ε tvar spektra (interakce rozpouštědloanalyt) Spektrum fenolu změřené v ethanolovém a isooktanovém roztoku 8
Biologicky významné látky Látka NAD, NADP NADH, NADPH FMN, FAD pyridoxal 260 260 340 260 375 445 450 250 320 ε (l.mol 1.cm 1 ) 15 000 15 000 6 200 15 000 10 000 (FMN) 9 000 (FAD) 12 500 (FMN) 11 000 (FAD) 3 000 6 000 Další biologicky významné látky Látka cholesterol kalciferoly βkaroten retinol trans,trans9,12 oktadecenová kys. adenosin guanosin cytidin thymidin uridin 235 265 450 330 231 267 248 271 267 262 ε (l.mol 1.cm 1 ) 20 000 18 300 120 000 45 000 35 000 12 300 11 000 9 100 9 650 8 500 9
Analýza dvou složek vedle sebe 0,8 0,6 λ 1 λ 2 A 0,4 0,2 0 380 420 460 500 540 580 620 (nm) Aditivita absorbance: A λ1 = b. (ε Aλ1. c A + ε Bλ1. c B ) A λ2 = b. (ε Aλ2. c A + ε Bλ2. c B ) c A = c B = A λ1 A λ2. ε Bλ1 / ε Bλ2 b. ( ε Aλ1 ε Aλ2. ε Bλ1 / ε Bλ2 ) A λ2 A λ1. ε Aλ2 / ε Aλ1 b. (ε Bλ2 ε Bλ1. ε Aλ2 / ε Aλ1 ) Derivační spektrometrie 0,12 0,10 0,08 0,06 Původní spektrum A vs. λ 0,04 (nm) 0,01 1. derivace da/dλ vs. λ 2. derivace d 2 A/dλ 2 vs. λ 0,01 10
T = Φ /Φ 0 A = log 10 T = 2,303. ln T = ε. b. c da/dλ = 2,303. (1/T). dt/dλ = b. c. dε/dλ první (i druhá) derivace absorbance je rovněž přímo úměrná koncentraci absorbující látky 0,12 0,10 0,08 0,06 Dvě složky šířka pásů: 20 nm shodná výška pásů λmax = 9 nm 0,04 původní spektrum A vs. λ 436 0,01 433 456 první derivace da/dλ vs. λ 0,01 druhá derivace d 2 A/dλ 2 vs. λ 453 11
0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 Dvě složky šířka pásů: 20 nm shodná výška pásů λmax = 7,5 nm původní spektrum A vs. λ 436 0,01 433 454 0,01 první derivace da/dλ vs. λ druhá derivace d 2 A/dλ 2 vs. λ 451 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 Dvě složky šířka pásů: 20 nm shodná výška pásů λ max = 6 nm původní spektrum A vs. λ 5 0,01 0 0 0,01 první derivace da/dλ vs. λ druhá derivace d 2 A/dλ 2 vs. λ 5 12
0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 Dvě složky šířka pásů: 20 nm A max = A max / 3 λ max = 9 nm původní spektrum A vs. λ 436; 15,2.10 3 6 0,01 433; 2,78.103 456; 0,95.103 první derivace da/dλ vs. λ 0 0 0,01 druhá derivace d 2 A/dλ 2 vs. λ 452; 5,5.10 3 6 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 Dvě složky šířka pásů: 20 nm A max = A max / 3 λ max = 7,5 nm původní spektrum A vs. λ 6 454; 1,05.10 3 433; 2,81.10 3 0,01 0 0,01 první derivace da/dλ vs. λ druhá derivace d 2 A/dλ 2 vs. λ 6 13
0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 Dvě složky šířka pásů: 20 nm A max = A max / 3 λ max = 6 nm původní spektrum A vs. λ 6 433; 2,87.10 3 451; 1,47.10 3 0,01 0 0,01 první derivace da/dλ vs. λ druhá derivace d 2 A/dλ 2 vs. λ 6 Průtoková analýza FIA FIA = flow injection analysis alternativa k běžnému vsádkovému provedení reakce (vzorek + činidlo v nádobě) průtokové uspořádání přípravy vzorku, reakce analytu s činidlem a měření jednotlivé operace probíhají v toku činidla nebo nosného roztoku, do něhož je injektován vzorek efektivní způsob automatizace spektrometrické analýzy (UVVIS spektrofotometrie, AAS, AES ) 14
Příklad použití FIA Spektrofotometrické stanovení chloridů Hg(SCN) 2 + 2Cl HgCl 2 + 2SCN Fe 3+ + SCN [Fe(SCN)] 2+ měření rhodanátového komplexu železa (λ max = 480 nm) FIA uspořádání: peristaltické čerpadlo pumpuje kontinuálně činidlo nástřik 30 µl vzorku každých 38 s kapilára stočená do spirály zajišťuje promíchání detektor: fotometr s mikrocelou (10 µl) kalibrace 575 mg/l analýza 100 vzorků za hodinu Instrumentace pro FIA zařízení pro odběr vzorků peristaltické čerpadlo (hadičky s průměrem 0,254 mm, průtok 0540 ml/min) PTFE kapiláry a spojky nízkotlaký injektor (smayčka 5500 µl) pomocná zařízení mikrokolony, filtry, ventily, termostat detektor 15
Některá uspořádání analyzátorů na principu FIA dávkování do toku diluentu (využití v AAS, ICP pro analýzu koncentrovaných vzorků) dávkování vzorku do toku činidla, detekce dávkování vzorku do toku diluentu, spojení s tokem činidla, detekce příklad: generování hydridů As, Se, Sb, Te, Sn v AAS, ICP dávkování do toku diluentu, spojení postupně s toky dvou činidel technika stopped flow stanovení SCN : tvorba barevného produktu analytu s činidlem 5BrPADAP (2(5bromo2pyridylazo)5 diethylaminofenol) za přít. ox. činidla (K 2 Cr 2 O 7 ) Další možnosti využití FIA prekoncentrace analytu (sorpce a eluce, koprecipitace a rozpouštění, převedení na těkavou sloučeninu ) detekce nestabilních reakčních produktů přesným časováním měření 16