Kapilární zónová elektroforéza (CZE) (úloha pro pokročilé praktikum) Domácí příprava 1. Prostuujte si výpočet elektroosmotické mobility a efektivních elektroforetických mobilit z elektroferogramu. 2. Prostuujte si vliv ph na efektivní elektroforetickou mobilitu v CZE. 3. Prostuujte si vztahy, které používáme k výpočtu počtu teoretických pater, výškového ekvivalentu teoretického patra a rozlišení v chromatografii. 4. Prostuujte si přiloženou "Teorii k metoě staarního příavku". 5. Přineste si s sebou počítačku. Experimentální úkoly 1. Opipetujte 100 μl vzorku o malé ávkovací zkumavky a zaznamenejte jeho elektroferogram. 2. Přiřaďte jenotlivé píky příslušným sloučeninám obsaženým ve vzorku, kyž víte, že vzorek obsahuje násleující sloučeniny, které migrují v tomto pořaí: tyramin, thiomočovina, m-nitrofenol, kyselina benzoová a o-nitrofenol. 3. Ke 100 μl vzorku v malé ávkovací zkumavce přiejte 30 μl m-nitrofenolu o koncentraci 1,0 mg/ml (7,2 mmol/m 3 ) a po promíchání vzorku se stanarním příavkem zaznamenejte opět jeho elektroferogram. 4. Vytiskněte si oba va elektroferogramy opatřené příslušnou tabulkou s integračními výsleky. 1
Experimentální pomínky průměr kapiláry : 75 μm élka vstup-etektor : uveeno u přístroje celková élka : uveeno u přístroje ávkování : hyroynamické 10 mbar / 0,1 min separační napětí : 30 kv (vstupní elektroa je anoa, výstupní katoa) rampa : 6 kv/s separační pufr : 20 mm tetraboritan soný (ph = 9,1) etekce : fotometrická (UV absorpční při 220 nm) značkovač EOF : thiomočovina separované látky : tyramin = 4-(2-aminoetyl)fenol m-nitrofenol kyselina benzoová o-nitrofenol Vyhonocovací úkoly 1. Z prvního elektroferogramu vypočítejte elektroosmotickou mobilitu (m eof ) elektroosmotického toku a efektivní elektroforetické mobility tyraminu (m eff,t ) a kyseliny benzoové (m eff,b ) za aných experimentálních pomínek. 2. Z prvního elektroferogramu vypočítejte efektivní elektroforetické mobility o- nitrofenolu (m eff,o ) a m-nitrofenolu (m eff,m ) a elektroforetické (iontové) mobility o- nitrofenolátového (m O- ) a m-nitrofenolátového (m M- ) aniontu za aných experimentálních pomínek. 3. Z prvního elektroferogramu vypočítejte počet teoretických pater (n) a výškový ekvivalent teoretického patra (H) pro anou kolonu vzhleem k m-nitrofenolu a rozlišení (R 1,2 ) mezi píky kyseliny benzoové a o-nitrofenolu. 4. Vypočítejte koncentraci m-nitrofenolu ve vzorku z ploch píků m-nitrofenolu změřených pře stanarním příavkem a po stanarním příavku (jenoboová metoa stanarního příavku). 5. Vypočítejte élku zóny a objem vzorku naávkovaného o kapiláry a množství m-nitrofenolu v pmol a ng, které bylo naávkováno v prvním experimentu. Kolikrát lze teoreticky naávkovat ze 100 μl vzorku? Teorie k metoě stanarního příavku 2
V HPLC, GC a CZE se běžně používá několik kvantitativních vyhonocovacích meto: metoa vnitřní normalizace, metoa absolutní kalibrace, metoa vnitřního stanaru a metoa stanarního příavku. Tato poslení kvantitativní vyhonocovací metoa, tj. metoa stanarního příavku, umožňuje ostranit rušivý vliv matrice při kvantitativní analýze. Při této metoě změříme nejprve analytickou oezvu (tj. plochu píku) stanovované látky v půvoním vzorku, který je určen k analýze (první experiment). Ve ruhém kroku přiáme k půvonímu vzorku stanarní příavek vlastní stanovované látky o znamém množství a opět změříme analytickou oezvu (tj. plochu píku) stanovované látky v takto získaném vzorku se stanarním příavkem (ruhý experiment). Ze získaných ploch píků stanovované látky v půvoním vzorku a ve vzorku se stanarním příavkem o známém množství stanovované látky jsme potom schopni vypočítat koncentraci (popř. množství) stanovované látky v půvoním vzorku. Koncentrace stanovované látky v půvoním vzorku : c x [mol/m 3 ] Objem půvoního vzorku : V [μl] Plocha píku stanovované látky v půvoním vzorku : A 1 [Vs] Objem stanarního příavku : V [μl] Koncentrace stanovované látky ve stanarním příavku : c [mol/m 3 ] Plocha píku stanovované látky ve vzorku se stanarním příavkem : A 2 [Vs] Neznámou veličinou je c x a výchozími známými veličinami jsou V, A 1, V, c a A 2. Půvoní vzorek obsahuje látkové množství stanovované látky n 1 = c x V [μmol] a stanarní příavek obsahuje látkové množství stanovované látky n = c V [μmol]. Vzorek se stanarním příavkem obsahuje tey celkové látkové množství stanovované látky n 1 + n, jeho celkový objem je a tuíž koncentrace stanovované látky v tomto vzorku je rovna c = 2 n + n 1 = c V+c V x [μmol/μl nebo mol/m 3 ]. Při analýze je o přístroje v prvním experimentu ávkována část půvoního vzorku o objemu V [μl] (tzv. ávkovaný objem) a stejný objem vzorku se stanarním příavkem 3
je o přístroje ávkován ve ruhém experimentu. Látkové množství stanovované látky ávkované o přístroje v prvním experimentu je tey n,1 = c x V [μmol] a látkové množství stanovované látky ávkované o přístroje ve ruhém experimentu je rovno 1 n = c V = n + n,2 2 V = c V+c V x V [μmol]. Analytická oezva přístroje (tj. plocha píku) pozorovaná v prvním experimentu je přímo úměrná látkovému množství stanovované látky ávkovanému o přístroje v prvním experimentu A 1 = RF n,1 = RF cx V, ke RF je tzv. faktor oezvy (reonse faktor) příslušného etektoru pro stanovovanou látku a říká, jak velkou analytickou oezvu (v našem přípaě plochu píku) poskytuje jenotkové látkové množství příslušné stanovované látky. Analytická oezva přístroje (plocha píku) pozorovaná ve ruhém experimentu je také přímo úměrná látkovému množství stanovované látky ávkovaného o přístroje ve ruhém experimentu a konstantou úměrnosti je stejný faktor oezvy, neboť se jená o stejnou látku (tj. stanovovanou látku) A = RF n = RF c V = RF n 1 + n V = RF c V+c V 2,2 2 x V. Dáme-li obě změřené plochy píků stanovované látky o poměru, vykrátí se nám parametry, které nabývají v obou vou experimentech týchž honot (tj. RF a V ) A2 A = 1 RF c x V+c V RF cx V V = c x V+c V c x ( ). Osamostatněním koncentrace c x z přecházející rovnice získáme vztah pro výpočet koncentrace stanovované látky v půvoním vzorku z výchozích známých veličin metoy stanarního příavku 4
c = c x A1 V A V +V A V ( ) 2 1 1 1. Poku vyjáříme koncentraci stanovované látky ve stanarním příavku (tj. c ) v jiných jenotkách (např. v mg/ml), lze použít stejný vztah pro výpočet koncentrace stanovované látky v půvoním vzorku (tj. c x ), avšak tato koncentrace vyje ve stejných jenotkách, v jakých byla vyjářena koncentrace stanovované látky ve stanarním příavku (tey např. v mg/ml). 5