Studijní materiál HMF_1 1. Hydroxymethylfurfural a jeho stanovení v potravinách 2. Kapalinová chromatografie (HPLC, UPLC) V Brně dne 20. 11. 2011 Vypracoval: RNDr. Ivana Borkovcová, Ph.D.
1. Hydroxymethylfurfural a jeho stanovení v potravinách 1.1. Hydroxymethylfurfural Synonyma: 5-hydroxymethyl-2-furankarbaldehyd, HMF HOH 2 C O C O H Obr. č. 1: Strukturní vzorec hydroxymethylfurfuralu Cyklický aldehyd hydroxymethylfurfural (HMF) je endogenní cizorodá látka, vyskytující se v potravinách obsahujících sacharidy. Vzniká v nich jednak dehydratací hexos a hexulos v kyselém prostředí a jednak v důsledku Maillardových reakcí. HMF je prakticky nepřítomen v čerstvých a nezpracovaných potravinách, jeho koncentrace roste následkem tepelných procesů. Je řazen mezi tzv. heat toxicants, tj toxické látky vznikající tepelným působením. Přítomnost HMF se tak stává indikátorem snížení jakosti potravin způsobeného nadměrným zahříváním při tepelných úpravách, dále nevhodným a dlouhodobým skladováním a také možným falšováním potravin. HMF je uznávaný parametr související s čerstvostí a kvalitou některých potravin. Dlouhodobě je známa přítomnost HMF v medu a je podchycena jak v legislativě národní, tak i mezinárodní. (Stephan Bogdanov, Harmonised Methods Of the International Honey Commission, Směrnice Rady 2001/110/ES, vyhláška 43/2005 Sb ) HMF je přítomen v celé řadě dalších potravin, které obsahují sacharidy v kyselém prostředí anebo při jejichž technologickém opracování probíhá Maillardova reakce. Koncentrace HMF v těchto potravinách může dosahovat významných hodnot. Hydroxymethylfurfuralu jsou přisuzovány cytotoxické, genotoxické a karcinogenní vlastnosti, jeho přítomnost zhoršuje organoleptické vlastnosti a nutriční hodnotu potravin. V současné době je HMF zařazen spolu s dalšími látkami na seznamu programu The National Toxicology Program k hlubšímu testování na karcinogenitu. 1.2. Metody stanovení Pro stanovení HMF, popř. jeho derivátů, se používají následující metody: spektrofotometrické metody po reakci s kyselinou barbiturovou nebo thiobarbiturovou, chromatografické metody, o plynová chromatografie (GC), o iontově-výměnná chromatografie (IEC), o vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC, UPLC).
. 1.3. Příprava vzorku Izolace analytů z matrice spočívá v jejich převedení do vodného roztoku, o u medu rozpuštěním ve vodě a filtrací, o u kečupů, marmelád, protlaků, džusů jsou vyčeřeny vodné roztoky činidly Carrez I a II a následně filtrovány, o u mléka a mléčných výrobků se na vzorek působí minerálními kyselinami, kyselinou šťavelovou a trichloroctovou a následně filtruje. 2. Kapalinová chromatografie, HPLC Kapalinová chromatografie (HPLC, High Performance Cromatography) je fyzikálněchemická separační technika, užívaná pro dělení a analýzu směsí látek. Jejím základním principem je rozdělování složek směsi mezi dvěma fázemi, mobilní a stacionární, na základě jejich chemických a fyzikálně chemických vlastností a vzájemných interakcí. Stacionární fází je modifikovaný sorbent, mobilní fázi tvoří kapalina, rozpouštědlo nebo směs rozpouštědel, která se v chromatografickém systému pohybuje. Pro separaci je rozhodující afinita analytu k těmto fázím Chromatografické analýzy se zpravidla používají pro dělení složité směsi látek, které mají navzájem dosti podobné chemické a fyzikální vlastnosti a které by se jinými metodami kvalitativně a kvantitativně analyzovaly jen velmi obtížně, pokud by to vůbec bylo možné. Kapalinový chromatograf tvoří tyto hlavní části: zásobníky s mobilní fází, vysokotlaká pumpa, dávkovač (aautosampler), kolona,detektor a řídící a vyhodnocovací jednotka (PC s příslušným programem). Chromatografickým systémem protéká mobilní fáze, která je ze zásobních lahví vedena přes vysokotlaké čerpadlo do dávkovače, kde je do proudu mobilní fáze nadávkován vzorek a dále do kolony, kde dochází k separaci jednotlivých složek. Výstup z kolony vede do detektoru, kde jsou jednotlivé složky detekovány a odtud do odpadu. Signál z detektoru je zaznamenáván pomocí PC v podobě chromatogramu. Jestliže se složení mobilní fáze po celou dobu analýzy nemění, pracujeme v izokratickém modu, jestliže se složení mobilní fáze mění, mísením rozpouštědel se mění její polarita, pracujeme s gradientovou elucí.
Obr.č.1: Schema kapalinového chromatografu isokratická konfigurace Obr. č.2: Schema chromatogramu jednosložkové směsi Záznam odezvy chromatografického detektoru na čase se nazývá chromatogram Zóny separovaných látek procházející detektorem jsou zaznamenávány jako chromatografické píky Pro vyhodnocení chromatogramu slouží tyto údaje: h výška píku, W šířka píku v nulové linii, W 0,5 šířka píku v polovině jeho výšky, t R retenční čas, t M mrtvý čas, tj. retenční čas nesorbvané složky
Retenční čas komponenty vzorku (t R ) - časový interval od nástřiku vzorku do okamžiku detekce odpovídající průchodu maximální koncentrace látky detektorem Retenční čas je kvalitativní údaj, látka je-není přítomna ve směsi, provádíme porovnání s retenčním časem standardu. Mrtvý čas kolony (t M ) - časový interval od nástřiku vzorku do okamžiku detekce maximální koncentrace složky, jež není stacionární fází zadržována Šířka chromatografického píku (w) - odečítá se na úrovni základní linie, v polovině výšky píku nebo v inflexním bodu, udává se v časových jednotkách Výška píku (h) - vzdálenost mezi maximem píku a jeho nulovou linií Plocha píku (A) - plocha pod linií chromatografické křivky píku Plocha píku je kvantitativní údaj, je přímo úměrná koncentraci analytu. Vyhodnocení obsahu analyzované látky provádíme pomocí kalibrační přímky metodou vnějšího standardu, metodou vnitřního standardu nebo metodou standardního přídavku. Jako vnitřní standard se používají sloučeniny, které mají obdobnou strukturu a vlastnosti jako analyzovaná látka, ve výsledném chromatogramu jiný retenční čas, tj. nedochází ke koeluci píků a v analyzované matrici se přirozeně nevyskytují. Redukovaný retenční čas (t R) - charakterizuje dobu, po kterou se analyt zdrží interakcemi se stacionární fází: t R = t R - t M Retenční (kapacitní) faktor (k) - definován výrazem: k = t R / t M Rozlišení (R S ) - definováno vztahem: R S = 2.(t R,2 t R,1 ) / (Y 2 + Y 1 ) Obr. č. 3: Zvýšení účinnosti a rozlišení snížením velikosti částic sorbentu
Chromatografická kolona Účinností kolony se rozumí její schopnost separovat složky analyzované směsi. vyjadřování účinnosti chromatografických kolon počtem teoretických pater n a výškou teoretického patra H hypotetický předpoklad, že kolona může být rozdělena na sled elementárních jednotek - pater v rámci jednoho patra se uskuteční kompletní elementární separační krok údaj o počtu teoretických pater musí být vždy doprovázen informací o délce kolony K porovnání účinností kolon různých délek se používá údaj o počtu teoretických pater na jednotku délky kolony nebo údaj o výšce teoretického patra H: H = L / n Účinnost separace N Účinnost separace N je možné vyjádřit pomocí výškového ekvivalentu teoretického patra H a délky kolony L: Účinnost separace N je nepřímo úměrná velikosti částic sorbentu d p L/d p Je-li tento poměr podobný, pak je srovnatelná účinost různých kolon Praktický příklad zvýšení účinnosti a rozlišení snížením velikosti částeček sorbentu je demonstrován na obr.č. 3. Obr.č. 4: van Deemterova závislost. Na obr. č. 4 je graficky znázorněna závislost HETP na průtokové rychlosti mobilní fáze. Při určitém průtoku mobilní fáze je HETP nejnižší, a za těchto podmínek, tj. v minimu křivky je separace nejúčinnější.
Obr.č. 5: Závislost výšky teoretického patra na velikosti částic a průtokové rychlosti mobilní fáze (zdroj: materiály Waters, USA) Menší částice větší účinnost, ale vysoký zpětný tlak na koloně, až 100 MPa, 1200 bar, 18 000 psi Požadavky na materiál částic a design přístroje HPLC: 350 400 bar (částice 3 5 µm) UHPLC: 600 bar (částice 2,5 µm) UPLC :1200 bar (částice < 2 µm) Výhody UPLC: Až 8x kratší časy oproti konvenční HPLC bez snížení účinosti Použití zejména při analýzách vysokého počtu vzorků, dlouhé časy analýz, vyvoj metody Menší spotřeba rozpouštěděl Menší nástřiky = menší spotřeba vzorku (je-li k dispzici malé množství vzorku, krev sérum)
0.70 0.65 AU 0.60 0.55 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 Tryptamine Agmatine 2-Phenylethylamine Putrescine Cadaverine Histamine 1,7- Diaminoheptane Tyramine Spermidine Spermine 0.00 4.00 4.20 4.40 4.60 4.80 5.00 5.20 5.40 5.60 5.80 6.00 6.20 6.40 6.60 6.80 7.00 7.20 7.40 7.60 7.80 8.00 8.20 8.40 Minutes Obr.č. 6: UPLC chromatogram směsi biogenních aminů 7000.00 6500.00 6000.00 5500.00 5000.00 4500.00 Putrescine Cadaverine 1.7-Diaminoheptane EU 4000.00 3500.00 3000.00 2500.00 2000.00 1500.00 1000.00 500.00 0.00 Tryptamine Agmatine 2-Phenylethylamine Histamine Tyramine Spermidine Spermine 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 21.00 22.00 23.00 24.00 25.00 26.00 27.00 Minutes Obr. č. 7: HPLC chromatogram směsi biogenních amnů HPLC UPLC Doba analýzy 38 min. 6 min Průtok mobilní fáze 1,0 ml.min -1 0,5 ml.min -1 nástřik 20 µl 7 µl Rozměry kolony 150 x 4,6 mm 50 x 2,1 mm Velikost částic sorbentu 3 5 µm 1,7 µm Tabulka č. 1: Srovnání parametrů HPLC a UPLC při stanovení biogenních aminů