HLUBOKÁ ŢILNÍ TROMBÓZA A VÝZNAM NĚKTERÝCH MUTACÍ V GENECH PRO

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biochemických věd HLUBOKÁ ŢILNÍ TROMBÓZA A VÝZNAM NĚKTERÝCH MUTACÍ V GENECH PRO KOAGULAČNÍ FAKTORY Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: Doc. PharmDr. Tomáš Šimůnek, Ph.D. Školitel-specialista: RNDr. Hana Kolaříková Hradec Králové 2012 Bc. Zuzana Čtveráčková

Prohlášení Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla vyuţita k získání stejného nebo jiného titulu.... V Hradci Králové Bc. Zuzana Čtveráčková

Poděkování Mé poděkování patří panu Doc. Pharm.Dr. Tomáši Šimůnkovi, PhD. za vedení diplomové práce a ochotný přístup. Také bych chtěla poděkovat RNDr. Haně Kolaříkové za odborné vedení v laboratoři a za cenné rady a připomínky při zpracovávání diplomové práce.

Abstrakt Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Zuzana Čtveráčková Školitel: Doc. PharmDr. Tomáš Šimůnek, Ph.D. Název diplomové práce: Hluboká ţilní trombóza a význam některých mutací v genech pro koagulační faktory. Diplomová práce je zaměřena na mutace v genech pro koagulační faktory, které mohou vést ke vzniku hluboké ţilní trombózy. V úvodní části je popsána role vrozené trombofilie ve vzniku onemocnění. Následuje popis jednotlivých trombofilních mutací a jejich význam, který však není vţdy zcela jasný. Sledovány byly tyto mutace: Faktor V Leiden (G1691A), faktor V R2 (H1299R), faktor II protrombin (G20210A), MTHFR (C677T, A1298C), faktor XIII (V34L), PAI-1 (4G/5G) a EPCR (A4600G haplotyp A3, G4678C haplotyp A1). Většina z uvedených mutací byla označena za rizikové faktory hluboké ţilní trombózy, ale konkrétně polymorfismus faktoru XIII V34L je povaţován za protektivní faktor. Dalšími mutacemi s tímto účinkem by mohly být některý z genotypů PAI-1 a haplotyp A1 EPCR. V praktické části byly pouţity vzorky a výsledky celkem 783 jedinců, přičemţ část byla diagnostikována metodou reverzní hybridizace komerční detekční soupravou CVD Stripassay T (ViennaLab) a u druhé části byla k diagnostice pouţita novější metoda real-time PCR (TaqMan SNP Genotyping Assays firmy Applied Biosystems). Nejčetnějšími polymorfismy byly MTHFR A1298C (54,5%) a C677T (53,4%). Frekvence dalších mutací byly 18,5% nosičů FV Leiden, 18,3% FV R2 a 4,3% FII protrombin. Protektivní faktor XIII (V34L) byl nalezen u 48,0% jedinců. Nejrizikovější genotyp PAI-1 4G/4G měl četnost 31,3% s frekvencí alely 4G 55,4% a frekvence alely 5G byla 44,7%. Sledované haplotypy EPCR A1 a A3 byly nalezeny s frekvencí 42,8% a 10,1%. 77,1% jedinců neslo dvě a více mutací.

Cílem mé práce bylo popsat význam trombofilních mutací ve vzniku hluboké ţilní trombózy a zjistit četnosti jednotlivých polymorfismů ve vybraném souboru jedinců, které jsem pak porovnala s prevalencemi v České republice, Evropě, či ve světě. Výsledky odpovídají závěrům jiných studií.

Abstract Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Bc. Zuzana Čtveráčková Supervisor: Doc. PharmDr. Tomáš Šimůnek, Ph.D. Title of diploma thesis: Deep vein thrombosis and role of selected mutations for the coagulation factors genes. This thesis is focused on mutations for the coagulation factors genes that can lead to deep vein thrombosis. In the first part, we describe the role of hereditary thrombophilia in the development of disease. Following is the description of each thrombophilic mutations and their meaning which is not always clear. The following mutations were detected: Factor V Leiden (G1691A), factor V R2 (H1299R), factor II prothrombin (G20210A), MTHFR (C677T, A1298C), factor XIII (V34L), PAI-1 (4G/5G) a EPCR (A4600G haplotype A3, G4678C haplotype A1). Most of them have been previously identified as risk factors for deep vein thrombosis, but specifically the factor XIII V34L polymorphism is considered to a protective factor. Other mutations with protective effect could be one of the genotypes of the PAI-1 and EPCR A1 haplotype. In the practical part, the samples and the results of 783 subjects were used. First part of them which was diagnosed by reverse hybridization commercial detection kit CVD Stripassay T (ViennaLab) and at the second part was use to diagnose a newer method real time PCR (TaqMan SNP Genotyping Assays firmy Applied Biosystems). The most frequent polymorphisms were MTHFR A1298C (54.5%) and C677T (53.4%). The frequency of other mutations were 18.5% FV Leiden carriers, 18.3% FV R2 and 4.3% FII prothrombin carriers. The protective factor XIII (V34L) was found in 48.0% of individuals. The highest-risk genotype 4G/4G PAI-1 had a frequency of 31.3% with a frequency of 4G

allele 55.4% and 5G allele frequency was 44.7%. EPCR haplotypes A1 and A3 were found with frequency of 42.8% and 10.1%, respectively. 77.1% of individuals carried two or more mutations. The aim of this thesis was to assess the importance of thrombophilic mutations in the development of deep venous thrombosis and to determine the frequency of each polymorphism in a selected group of individuals which I compared with the prevalence in the Czech Republic, Europe, or in the world. The results were consistent with results of other studies.

Obsah 1 Úvod... 10 2 Statistika... 11 3 Příčiny vzniku hluboké ţilní trombózy... 12 4 Role vrozené trombofilie... 13 4.1 Vrozená trombofilie a těhotenství... 13 4.2 Vrozená trombofilie a hormonální antikoncepce... 14 4.3 Role vrozené trombofilie na recidivu HŢT... 15 5 Koagulační kaskáda... 16 6 Trombofilní mutace... 17 6.1 Mutace v genu pro faktor V... 17 6.1.1 FV R2 (H1299R)... 17 6.1.2 FV Leiden (G1691A)... 18 6.2 FII Protrombin (G20210A)... 19 6.3 MTHFR (C677T, A1298C)... 20 6.4 F XIII (V34L)... 21 6.5 PAI-1 (4G/5G)... 22 6.6 EPCR (A4600G haplotyp A3, G4678C haplotyp A1)... 23 7 Diagnostika trombofilních mutací... 25 7.1 PCR... 25 7.2 Reverzní hybridizace... 26 7.3 Real-time PCR... 26 8 Cíl práce... 29 9 Materiál a metodika... 30 9.1 Izolace DNA... 31 9.1.1 Kvantifikace DNA... 32

9.2 PCR, reverzní hybridizace... 32 9.3 Real-time PCR... 37 10 Výsledky... 42 11 Diskuse... 45 12 Závěr... 56 13 Seznam zkratek... 57 14 Literatura... 58

1 ÚVOD Hluboká ţilní trombóza (HŢT) je stav vyvolaný částečným nebo úplným uzávěrem hlubokého ţilního systému. Do roku 1980 byly prováděny studie onemocnění HŢT pouze na malém souboru pacientů a pouţit k tomu byl pouze omezený počet laboratorních testů (měření koncentrace antitrombinu, proteinu C a proteinu S). Od počátku 90. let se zlepšila laboratorní technika a byly provedeny kvalitní klinické studie, coţ vedlo k objevu mnoha rizikových faktorů a k vědomí, ţe HŢT je chronické recidivující onemocnění (Kyrle et al., 2010). Za posledních 20 let tak bylo identifikováno několik kandidátních genů jako rizikové faktory pro ţilní trombózu. Většina variant těchto genů byla definována zejména v bělošské populaci, poněvadţ v jiných etnikách jsou méně časté (Cushman, 2007). Velkým rizikem HŢT jsou posttrombotické změny, označované jako posttrombotický syndrom. Jedná se o postiţení hlubokého ţilního systému dolních končetin jako následek hluboké ţilní trombózy (Šárník, 2002). Krevní sraţenina můţe způsobit zánět a blokovat tok krve, coţ způsobuje poškození ţilních chlopní, jejich děravění, a tím hromadění krve v dolních končetinách. Kromě toho jsou přítomny i změny v ţilních stěnách a kapilárách (Lepší, 2002). Projevuje se chronickými bolestmi nohou, otoky, zarudnutím a vředy (Vazqez a Kahn, 2010). Vznik těchto komplikací je dnes omezen včasným zasláním nemocného s ţilními problémy na potřebná vyšetření. Výsledkem je stoupající počet jedinců vyţadujících vyšetření, která umoţňují zachytit onemocnění včas a zahájit příslušnou léčbu. Rutinní screening jednotlivých vrozených genetických markerů před první příhodou HŢT však není moţné provádět, jelikoţ je to onemocnění multifaktoriální. 10

2 STATISTIKA Hluboká ţilní trombóza je onemocnění s kaţdoročně rostoucí incidencí. V závislosti na věku se vyskytuje v rozmezí 1:100 000 jedinců v dětském věku aţ po 1:100 jedincům ve stáří (Selingsohn a Lubetsky, 2001). V České republice je incidence 15 000 aţ 20 000 nemocných za rok (Strouhalová et al., 2006). Zatímco Silverstein et al. (1998) uvedl roční incidenci 48:100 000 jedinců bez ohledu na věk a pohlaví, Kyrle a Eichinger (2005) ve své práci uvádí výskyt onemocnění 1:1000 osob. U 12 18% pacientů, kteří ukončili léčbu HŢT perorálními antikoagulancii se do dvou let objeví recidiva onemocnění (Mansilha et al., 2005), u pacientů s první spontánní HŢT je pravděpodobnost recidivy do jednoho roku 5 15%. Kumulativní míra recidivy po čtyřech letech je asi 25% (Kyrle a Eichinger, 2005). Jednou z komplikací HŢT je plicní embolie, ke které dochází podle Mansilha et al. (2005) v 5% případů, avšak podle jiných autorů k ní můţe docházet aţ ve třetině případů (Kyrle et al., 2010). V České republice je četnost vzniku plicního embolu u postiţených hlubokou ţilní trombózou méně neţ 0,03 promile (Strouhalová et al., 2006). Velmi vzácná je hluboká ţilní trombóza horní končetiny, která tvoří pouze 4% všech případů tromboembolického onemocnění. Z toho 30 % představuje tzv. primární HŢT, tedy HŢT z neznámé příčiny (Martinelli et al., 2004). Incidence HŢT je u různých etnických skupin rozdílná. Niţší výskyt je ve Spojených státech, u Asiatů a hispánců, neţ u bělošské populace, a u Afroameričanů studie uvádějí vyšší incidenci aţ o 25%. Pozorované etnické rozdíly mohou souviset s niţším výskytem mutace faktoru V Leiden a mutace protrombinu 20210A u nebělošské populace (Cushman, 2007). I kdyţ je mutace faktoru V Leiden u Afroameričanů vzácná, vzhledem k vysoké prevalenci onemocnění se předpokládá, ţe mají neznámou variantu genu, který hraje důleţitou roli v trombóze u černošské populace. Doposud u nich byly prokázány pouze vyšší hladiny hemostatických markerů rizika trombózy, konkrétně faktor VIII, von Wilebrandův faktor a D-dimery, neţ u bělošské populace (Cuschman, 2007). 11

3 PŘÍČINY VZNIKU HLUBOKÉ ŢILNÍ TROMBÓZY Patofyziologie ţilní trombózy zahrnuje tři vzájemně propojené faktory, tzv. Virchowova trias. Je to poškození cévního endotelu, zpomalení krevního toku a hyperkoagulabilita (Prandoni et al., 1999). Etiopatogeneze nově vyvinuté hluboké ţilní trombózy či recidivy, je multifaktoriální, v závislosti na závaţnosti a počtu vrozených a nepřímých faktorů (Mansilha et al., 2005). Rizikové faktory mohou být rozděleny do tří skupin: Ovlivnitelné rizikové faktory obezita, hormonální antikoncepce Dočasné rizikové faktory hospitalizace, imobilita, cestování, úraz, rakovina, operace, šestinedělí Neovlivnitelné rizikové faktory věk, pohlaví, genetické faktory (Cushman, 2007; Prandoni et al., 1999) Mnoho pacientů má více neţ jeden rizikový faktor, coţ výrazně zvyšuje moţnost vzniku HŢT, a to platí i u pacientů s trombofilií, kteří jsou vystaveni dočasnému riziku (např. operace nebo trauma) (Kyrle a Echinger, 2005). Vzhledem k tomu, ţe faktor V Leiden a mutace G20210A v genu pro protrombin jsou relativně časté, není výjimkou jejich koinheritance s jinými trombofilními mutacemi (Seligsohn a Lubetsky, 2001). Na přítomnost vrozené trombofilie by mělo vzniknout podezření, pokud má pacient rekurentní nebo ţivot ohroţující ţilní tromboembolii, HŢT v rodinné anamnéze, věk pod 45 let, a ţena, která prodělala více potratů, či narození mrtvého dítěte anebo obojí (Luyendyk et al., 2006). HŢT obvykle vzniká v hlubokých ţilách lýtka, a to zejména v ţilním splavu v musculus soleus a musculus gastrocnemius, zapřičiněné stagnací krve v této oblasti. Vzácněji můţe vzniknout v ileo-femorální podkolenní ţíle, často následkem úrazu nebo po operaci. Tromby způsobující plicní embolii se mohou uvolňovat z ţil lýtka, coţ má menší klinický důsledek, jelikoţ příslušné emboly jsou malé a uzavřou pouze nejperifernější segmenty plicní arterie. Větší riziko klinicky závaţných plicních embolií nesou tromby větší, které pocházejí z proximální ţíly (popliteální, femorální a ilické) (Prandoni et al., 1999). 12

Hlavními komplikacemi HŢT jsou infarkt myokardu, cévní mozková příhoda, ţilní trombembolie, rekurence, posttrombotický syndrom a velké krvácení v důsledku antikoagulace, coţ všechno vede k významné morbiditě a mortalitě (Cushman, 2007; Luyendyk et al., 2006). 4 ROLE VROZENÉ TROMBOFILIE Některé důleţité prvky mohou ovlivnit schopnost klinické studie zjistit rozdíly v prognóze u pacientů s ţilní trombózou. Těmito prvky rozumíme především perspektivní a retrospektivní provádění klinických studií, vytvoření správně zaloţené kohorty, délku léčby a nezávislé vyhodnocení laboratorních zkoušek a klinických výsledků. Retrospektivní studie mají potenciál být nespolehlivé, jelikoţ se můţe uplatňovat mnoho chyb, včetně nedostatečného určení rekurentních trombotických příhod a výběru pacientů (Mansilha et al., 2005). Mezi výsledky jednotlivých studií o roli vrozené trombofilie na HŢT jsou rozpory. Autoři studie z roku 2004, jejímţ cílem bylo prozkoumat roli potenciálních rizikových faktorů u pacientů s primární HŢT horní končetiny, potvrdili na testované skupině pacientů zvýšené riziko onemocnění v přítomnosti vrozené trombofilie, konkrétně faktoru V Leiden a protrombinové mutace. Avšak sami uvádějí, ţe vzhledem k relativní vzácnosti onemocnění je k dispozici pouze malý vzorek pacientů, coţ neumoţňuje odhalit všechny rizikové faktory, na rozdíl od HŢT dolní končetiny. A proto mohou existovat rozpory mezi výsledky jednotlivých studií. Například uţívání hormonální antikoncepce a hyperhomocysteinémie jsou známé jako faktory zvyšující riziko HŢT dolních končetin a mozkové ţilní trombózy, ale nejsou spojeny s primární HŢT horní končetiny (Martinelli et al., 2004). 4.1 Vrozená trombofilie a těhotenství I přesto, ţe ţeny mají niţší riziko trombózy neţ muţi, těhotenství a uţívání hormonální antikoncepce představují významné rizikové faktory pro HŢT (Kyrle a Eichinger, 2005). Těhotenství a šestinedělí jsou spojeny s 2 14 krát vyšším rizikem pro první příhodu HŢT, avšak u ţen s vrozenou trombofilií je riziko ještě vyšší (Kyrle a 13

Eichinger, 2005). Podle výsledků retrospektivních studií se zjistilo, ţe trombóza se během těhotenství objevuje u více neţ 60 % ţen s deficitem antitrombinu III, a u více neţ 20 % ţen s deficitem proteinu C nebo proteinu S (Girling a De Swiet, 1998). Vrozené trombofilie také zvyšují riziko abortu. Seligsohn a Lubetsky (2001) zjistili, ţe u nosiček mutace protrombinu G20210A anebo faktoru V Leiden bylo riziko pozdní ztráty plodu (po 20. týdnu těhotenství) trojnásobné. A u ţen s deficitem proteinu C, proteinu S, antitrombinu a nosiček faktoru V Leiden bylo pozorováno zvýšené relativní riziko předčasné ztráty plodu (před 25. týdnem těhotenství). Ve studii také bylo 52% těhotných ţen s fetální růstovou retardací plodu, preeklampsií, abrupcí placenty a narozením mrtvého dítěte, které byly heterozygotní pro faktor V Leiden nebo mutaci G20210A v protrombinu, anebo homozygotní pro mutaci MTHFR C677T ve srovnání se 17% kontrol. Tyto data jsou dostatečným důvodem pro screening ţen, které chtějí otěhotnět a mají v osobní nebo rodinné anamnéze ţilní trombózu, nebo měly tři nevysvětlitelné potraty, růstovou retardaci plodu, preeklampsii, abrupci placenty a narození mrtvého dítěte (Seligsohn, Lubetsky, 2001). 4.2 Vrozená trombofilie a hormonální antikoncepce Zatímco role hormonální antikoncepce v HŢT dolní končetiny a mozkové ţilní trombóze je známa, údaje o hormonální antikoncepci jako rizikovém faktoru pro HŢT horní končetiny jsou omezené a sporné. Martinelli et al. (2004) uvádí multiplikativní interakci mezi uţíváním antikoncepčních prostředků a nejčastějšími vrozenými trombofiliemi. Příkladem je uţívání hormonální antikoncepce nosičkami faktoru V Leiden. U ţen heterozygotních pro faktor V Leiden se udává 3 aţ 7-násobné riziko ţilní tromboembolie (VTE) a uţívání hormonální antikoncepce zvyšuje riziko 2 3 krát. Avšak v případě přítomnosti obou těchto faktorů je riziko HŢT 14-ti aţ 34 násobné. Předpokládá se, ţe hormonální antikoncepce indukuje rezistenci na aktivovaný protein C, přičemţ stejný efekt má i faktor V Leiden, a tím je biochemický důsledek znásobený (Cushman, 2007; Martinelli et al., 2004). Objevení faktoru V Leiden a mutace protrombinu (G20210A) vedlo k diskusi o uţívání hormonální antikoncepce u nosiček těchto mutací. I kdyţ bylo u uţivatelek 14

hormonální antikoncepce heterozygotních pro faktor V Leiden zjištěno 20-ti aţ 30-ti násobné riziko trombózy a 16-ti násobné riziko s mutací protrombinu, musí být výsledky posouzeny s ohledem na velmi nízké absolutní riziko HŢT u mladých ţen. Přítomnost faktoru V Leiden tedy není kontraindikací pro uţívání hormonální antikoncepce pokud pacientka v minulosti neprodělala ţilní tromboembolismus (Kyrle a Eichinger, 2005). Hormonální antikoncepce, těhotenství a menopauza představují specifické problémy při posuzování rizik, diagnostice a léčbě hluboké ţilní trombózy (Kyrle a Eichinger, 2005). 4.3 Role vrozené trombofilie na recidivu HŽT Martinelli et al. (2004) sledovali roli rizikových faktorů a hodnotili recidivy po dobu antikoagulační léčby u pacientů s primární HŢT horní končetiny a zjistili, ţe hluboká ţilná trombóza má vyšší tendenci k recidivě pokud je přítomna vrozená trombofilie. Za rok byl výskyt recidivy v testované skupině 2,4 %, přičemţ u pacientů s a bez trombofile byl výskyt 4,4 % a 1,6 %. I přesto, ţe v některých studiích byla prokázána asociace mezi faktorem V Leiden a mutací protrombinu (G20210A) s rekurentní ţilní trombózou, v roce 2005 byla provedena studie ke zjištění vztahu mezi vznikem recidivy hluboké ţilní trombózy a některými genetickými polymorfismy - (FV G1691A, FII G20210A, MTHFR C677T, PAI-1 4G/5G) a autoři této studie tvrdí, ţe není statisticky významný rozdíl ve vzniku recidivy mezi nosiči těchto polymorfismů a pacienty bez polymorfismu a stejný výsledek byl prokázán i u rizika vzniku plicní embolie (Mansilha et al., 2005). I kdyţ autoři v roce 2005 uvedli, ţe faktor V Leiden není rizikovým faktorem pro opakované hluboké ţílní trombózy (Kyrle a Eichinger, 2005), v další studii v roce 2010 jiţ uvádějí riziko recidivy u homozygotních nosičů mutace faktoru V Leiden zvýšené 2,5-krát ve srovnání s účastníky studie, kteří mutaci neměli (Kyrle et al., 2010). 15

5 KOAGULAČNÍ KASKÁDA Jiţ v roce 1874 Virchow vyslovil názor, ţe trombóza je způsobena změnami buď ve sloţení krve ovlivňující koagulační systém, cévní stěně nebo krevní stázi. Intenzivní výzkum vedl k objevu plazmatických faktorů navzájem interagujících v tzv. koagulační kaskádě. Koagulace můţe být zahájena dvěma cestami: 1) aktivace vnitřního systému, zahrnující faktory XII, prekalikrein, vysokomolekulární kininogen, faktory XI, IX a faktor VIII na záporně nabitých površích nebo 2) a vnější dráha aktivace zahájena faktorem VII a tkáňovým faktorem. Obě cesty se sbíhají ve společném systému obsahujícím faktory X, V a II. Výsledkem je generace trombinu, coţ vede k aktivaci fibrinogenu na fibrin. Následné zesíťovatění fibrinových vláken aktivovaným faktorem XIII zvyšuje stabilitu fibrinové zátky a odolnost vůči fibrinolýze (Endler a Mannhalter, 2003). Obr. 1 Vnitřní a vnější cesta aktivace koagulační kaskády (web College of American Pathologists) 16

6 TROMBOFILNÍ MUTACE 6.1 Mutace v genu pro faktor V Dahlbäck et al. (1993) popsali abnormalitu, která byla rozšířená u pacientů s trombózou. U APTT (aktivovaný parciální tromboplastinový čas) testu zjistili, ţe přidání aktivovaného proteinu C k plazmě u pacientů s venózním tromboembolismem nevedlo k očekávanému prodlouţení času sráţlivosti, coţ je jev označený jako rezistence na aktivovaný protein C (APCR). Rezistence na APC je hlavním rizikovým faktorem pro HŢT. Genové mutace faktoru V, jako FV Leiden (R506Q) a FV R2 (H1299R) mohou způsobit rezistenci na APC sníţením vnímavosti FVa (aktivovaný faktor V) k APC, způsobené inaktivací anebo ovlivněním kofaktorové aktivity FV. Při kvantifikaci kofaktorové aktivity FV R2 u homozygotů bylo zjištěno sníţení na 73% oproti normálnímu FV a homozygotní FV Leiden neměl ţádnou kofaktorovou aktivitu v inaktivaci FVIIIa (Castoldi et al., 2004). 6.1.1 FV R2 (H1299R) V roce 1996 byla objevena jednonukleotidová substituce A G na pozici 4070, která působí záměnu histidinu za arginin v pozici 1299, známou jako R2. Mutace se nachází v exonu 13, genu pro koagulační faktor V, který je lokalizován na chromozomu 1 v pozici 1q23. Bylo zjištěno, ţe je více neţ 12 různých polymorfismů v celém genu, které jsou souhrnně označovány jako HR2. Polymorfismus je v populaci poměrně častý (5 17%), i kdyţ jsou známy rozdíly v prevalenci mezi různými etnickými skupinami (Otrock et al. 2008; web Genetics home reference). Polymorfismus způsobuje mírnou rezistenci na APC, zejména v homozygotní formě. Ačkoli základní molekulární mechanismus je neznámý, ukázalo se, ţe FV R2 je inaktivován APC stejnou mírou jako normální FVa, zatímco jeho kofaktorová aktivita je sníţena (Castoldi et al., 2004). V jedné studii byl studován vliv přítomnosti haplotypu HR2 faktoru V na generaci trombinu a výsledky ukázaly, ţe FV HR2 hraje roli jako rizikový faktor pro ţilní trombózu u homozygotních pacientů i v důsledku nárůstu mnoţství trombinu (Strey et al., 2005). 17

Jeho vztah s ţilní trombózou je však stále zpochybňován, protoţe některé studie zaznamenaly nárůst rizika trombózy při přítomnosti pouze samotného haplotypu HR2 (2 aţ 3-krát), zatímco jiní pozorovali tuto souvislost pouze pokud byl přítomen současně jako sloţený heterozygot s FV Leiden. V tomto případě je riziko ţilní trombózy stejné jako riziko u samotné homozygotní Leidenské mutace a také se sniţuje medián věku, ve kterém dochází k první trombotické příhodě (Otrock et al., 2008, Segers et al. 2007, Faioni et al., 1999). 6.1.2 FV Leiden (G1691A) Vrozená rezistence na APC je aţ v 95% případů výsledkem jednonukleotidové substituce G A na pozici 1691v koagulačním faktoru V. Důsledkem je nahrazení argininu glutaminem v pozici 506 a tím i zrušení inaktivačního štěpícího místa pro APC. Gen koagulačního faktoru V je lokalizován na chromozomu 1 v pozici 1q23 (Lillicrap, 2001; Franco a Reitsma, 2001; web Genetics home reference). Mutace FV Leiden, má významné důsledky pro funkci FV v prokoagulačních a antikoagulačních drahách procesu sráţení krve (Segers et al., 2007). Mutovaný faktor V je rezistentní k APC, vyvolává hyperkoagulační stav a výrazně zvyšuje náchylnost k venózní tromboembolii (Franco a Reitsma, 2001). Prokoagulační aktivita a prodlouţený poločas FV způsobuje zvýšený sklon k trombóze i u pacientů nesoucích jednu kopii mutovaného genu (Arsov et al., 2006). Bylo zjištěno, ţe faktor V Leiden je mnohem slabším kofaktorem APC při inaktivaci faktoru VIIIa, neţ normální faktor V. Příčinou je neschopnost štěpení faktoru V Leiden v místě Arg506, který tak nemůţe být transformován do antikoagulační molekuly (Segers et al., 2007). Faktor V Leiden je v bělošské populaci nejčastější genetickou příčinou vzniku trombózy. Prevalence tohoto faktoru v populaci je od 1% do 15% (Slavík et al., 2009; Franco a Reitsma, 2001). Je přítomen u 12-30% pacientů se spontánní hlubokou ţilní trombózou, a udává se sedminásobné riziko HŢT u heterozygotů a 80-ti násobné riziko u homozygotů. Není však rizikovým faktorem pro opakované HŢT (Kyrle a Eichinger, 2005; Castoldi et al., 2004). 18

6.2 FII Protrombin (G20210A) Protrombin je prekurzor serinové proteázy trombinu, klíčový enzym v procesu hemostázy a trombózy, který vykazuje prokoagulační, antikoagulační a antifibrinolytickou aktivitu (Biousse et al., 1998; Poort et al., 1996). Polymorfismus faktoru II G20210A je jednonukleotidová substituce G A na pozici 20210 v genu pro protrombin (Lillicrap, 2001). Protrombin je kódován 21 kb dlouhým genem, lokalizovaným na chromozomu 11 v pozici p11 - q12. Protrombinový gen je rozdělen do 14 exonů, 13 intronů s 5 překládanou oblastí a 3 nepřekládanou oblastí, které mohou hrát regulační úlohu v expresi genu (Biousse et al. 1998; Poort et al., 1996). Varianta G20210A je umístěna v 3 nepřekládané oblasti, která se nepřepisuje do protrombinové mrna, a způsobuje zvýšení plazmatické koncentrace protrombinu. FII 20210 se nachází v polyadenylačním místě a představuje hypermorfní mutaci, coţ způsobuje zvýšené rozpoznávání místa štěpení, vyšší efektivitu polyadenylačního místa, zvýšenou expresi mrna a syntézu proteinů (Gehring et al., 2001; Ceelie et al., 2004). Polymorfismus G20210A je povaţován za druhou nejčastější genetickou abnormalitu související s trombofilií a jeho popis podpořil pojetí ţilního tromboembolismu jako multigenního onemocnění (Franco a Reitsma, 2001). Studie potvrdily, ţe heterozygotní nosiči 20210A alely mají 3x zvýšené riziko venózního tromboembolismu. Podle studie na geografické rozdělení mutace, které se zúčastnilo 5527 asymptomatických jedinců v osmi zemích, byla odhadnuta prevalence mutace od 0,7% aţ 4,0% s celkovou prevalencí 2,0% (Endler a Mannhalter, 2003; Rosendaal et al., 1998). U pacientů s první příhodou HŢT je prevalence 6,2 % a v rodinách s trombózou je to 18 % (Rosendaal et al., 1998). Několik studií ukázalo, ţe protrombinová varianta často koinheruje s fv Leiden, coţ vede ke zvýšenému riziku HŢT. 1 aţ 10% symptomatických nosičů Leidenské mutace současně nese i variantní protrombin, a tito sloţení heterozygoti mají 50-ti aţ 80-ti násobné relativní riziko trombózy. Podle těchto výsledků bylo navrţeno testování na mutaci protrombinu u symptomatických nosičů FV Leiden (Endler a Mannhalter, 2003). 19

6.3 MTHFR (C677T, A1298C) Termolabilní varianta enzymu metylentetrahydrofolátreduktázy (MTHFR) je popisována v souvislosti se zvýšením plazmatické hladiny aminokyseliny homocysteinu. Jedná se o jednonukleotidovou substituci C T na pozici 677, coţ má za následek nahrazení alaninu za valin v místě 22. MTHFR gen je lokalizován na chromozomu 1 v pozici p36.3 (Lillicrap, 2001; web Genetics home reference). Enzym MTHFR katalyzuje redukci 5,10 metylentetrahydrofolátu na 5- metyltetrahydrofolát a je kofaktorem pro metylaci homocysteinu na metionin (Fujimura et al., 2000). C677T polymorfismus je ve svém homozygotním stavu spojený se sníţenou enzymatickou činností, termolabilitou a mírnou aţ střední hyperhomocysteinémií (Franco a Reitsma, 2001). V druhém méně častém polymorfismu dochází k jednonukleotidové substituci A C na pozici 1298, coţ vede k záměně glutamátu za alanin v místě 423. MTHFR gen je lokalizován na chromozomu 1 v pozici p36.3 (Lillicrap, 2001; web Genetics home reference). Někteří autoři uvádějí spojení samotného polymorfismu A1298C se sníţenou MTHFR aktivitou a zvýšením hladiny plazmatického homocysteinu (Akar et al., 2000a), ale jiné zdroje uvádějí tyto změny pouze při sloţené heterozygozitě s polymorfismem C677T (Franco a Reitsma, 2001). Tento polymorfismus má heterogenní etnické rozdělení (Franco a Reitsma, 2001). Mírná hyperhomocysteinémie je přítomna asi u 25% pacientů s hlubokou ţilní trombózou (Kyrle a Eichinger, 2005) a je známo, ţe polymorfismus C677T se často vyskytuje současně s faktorem V Leiden a mutací G20210A v genu pro protrombin. Kombinace hyperhomocysteinémie s kterýmkoliv faktorem výrazně zvyšuje riziko ţilní trombózy (Seligsohn a Lubetsky, 2001). U homozygotních nosičů polymorfismu MTHFR C677T bylo v některých studiích potvrzeno dvojnásobné zvýšení relativního rizika ţilní tromboembolie (Lillicrap, 2001). Co se týče recidivy HŢT, v roce 2010 jiţ prospektivní kohortní studie odhaduje zvýšení rizika recidivy spojené se zvýšenou koncentrací homocysteinu 1,5 krát. Avšak 20

autoři jiných studií nepovaţují příčinnou souvislost mezi hyperhomocysteinémií a ţilní trombózou za moţnou (Kyrle et al., 2010). 6.4 F XIII (V34L) Polymorfismus V34L je výsledkem jednonukleotidové substituce G T v pozici 103, coţ vede k nahrazení valinu leucinem na pozici 34 v genu F13A1, který je umístěn na chromozomu 6p24-25. FXIII cirkuluje v plazmě jako tetramer skládající se ze dvou podjednotek A, které obsahují aktivní místo a dvou B podjednotek, které fungují jako nosiči pro podjednotky A v plasmě. Aktivovaný faktor XIIIa se podílí na hojení, cytoskeletálních remodelacích, fagocytóze, a zánětlivých procesech (web ARUP Laboratories; Ariens et al., 2000; Franco a Reitsma, 2001). Trombin odštěpuje z fibrinogenu fibrinopeptidy A a B a vzniklé fibrinové monomery spontánně polymerují a vytváří nestabilní rozpustný fibrin. Faktor XIII, který se aktivuje trombinem, vytváří kovalentní vazby v síťovaném fibrinu sraţeniny ke zvýšení odolnosti proti chemickým, mechanickým a proteolytickým vlivům (Ariens et al., 2000). Aktivace FXIII zahrnuje trombinem indukované štěpení peptidové vazby mezi Arg37 a Gly38 na podjednotce A, coţ má za následek uvolnění aktivačního peptidu. V druhém kroku vyvolá vápník disociaci dimeru podjednotky A z podjednotky B (Ariens et al., 2000). Protoţe Val34Leu se nachází blízko místa štěpení trombinem, testovala se hypotéza, zda by tento polymorfismus mohl měnit aktivační rychlost faktoru XIII trombinem a ovlivnit strukturu fibrinu. Analýza proteolýzy FXIII trombinem ukázala zvýšenou katalytickou účinnost, takţe FXIII 34Leu byl rozštěpen trombinem rychleji a niţšími dávkami neţ 34Val, ale místo štěpení trombinem zůstalo nezměněno (Ariens et al., 2000; Dossenbach-Glaninger et al., 2003). Varianta V34L zvyšuje rychlost aktivace faktoru XIII trombinem, coţ vede k předčasnému vyčerpání FXIIIa. Polymorfismus V34L také ovlivňuje strukturu síťované fibrinové sraţeniny. Při vysokých koncentracích fibrinogenu, má fibrinová sraţenina volnější strukturu a silnější vlákna a jsou rychleji degradovány fibrinolýzou, coţ poskytuje ochranu 21

proti trombotickým příhodám (web ARUP Laboratories; González-Conejero et al., 2006; Ariens et al., 2000). U tohoto polymorfismu byl prokázán protektivní efekt proti ţilnímu tromboembolismu (Lillicarp, 2001). Paradoxně, ex vivo a in vitro studie naznačují, ţe nosičství alely 34 Leu vede ke zvýšení míry síťovatění fibrinu faktorem XIIIa. Nedávné studie uváděly, ţe výskyt alely 34Leu je niţší u pacientů s hlubokou ţilní trombózou ve srovnání s odpovídající kontrolní skupinou. Tyto klinické studie naznačují, ţe tento polymorfismus můţe být rizikovým faktorem trombózy (Ariens et al., 2000). Homozygozita pro polymorfismus Val34Leu je u těhotných ţen spojena s časnou ztrátou plodu. Intravenózní krevní sraţeniny a zvýšení fibrinu v intravilózním prostoru jsou časté morfologické nálezy u spontánního abortu s uvedením dysfunkce hemostázy. Tato skutečnost poukazuje na faktor XIII, který stabilizuje fibrin vytvořením kovalentní glutamyl-lysinové peptidové vazby mezi fibrinovými řetězci (Dossenbach-Glaninger et al., 2003). FXIII Val34Leu vykazuje heterogenní etnické rozdělení (Franco a Reitsma, 2001). 6.5 PAI-1 (4G/5G) Plazmatická koncentrace PAI-1 je spojena s častým polymorfismem 4G/5G, coţ je delece nebo inzerce guanosinu 675 bp od místa začátku translace v genu PAI-1, který je lokalizován na chromozomu 7 v místě q21.3 q22. (Dossenbach-Glaninger et al., 2003; web Genetics home reference). Delece/inzerce (4G nebo 5G) v promotoru PAI-1 jsou zapojeny do regulace syntézy inhibitoru (Sartori et al., 1998). PAI-1 je jedním z primárních regulátorů fibrinolytického systému. Zvýšená exprese tohoto inhibitoru můţe ohrozit normální fibrinové uvolňovací mechanismy a tak podporovat patologické ukládání fibrinu (Segui et al., 2000). U pacientů s HŢT lze nalézt nadměrný PAI-1 způsobující hypofibrinolýzu (Sartori et al., 2003). Bylo také zjištěno, ţe polymorfismus 4G/5G můţe ovlivnit lipoproteiny o velmi nízké hustotě odpovídající prvkům v PAI-1 promotorové sekvenci a tedy modulovat PAI-1 syntézu jako odpověď na hypertriglyceridémii (Segui et al., 2000). 22

U těhotných ţen je homozygozita pro polymorfismus PAI-1 spojena s časnou ztrátou plodu. Zvýšení koncentrace PAI-1 můţe mít za následek opakující se aborty pravděpodobně omezením rozvoje trofoblastů a zvýšeným ukládáním fibrinu v placentární cirkulaci (Dossenbach-Glaninger et al., 2003). 6.6 EPCR (A4600G haplotyp A3, G4678C haplotyp A1) Lidský EPCR gen zabírá přibliţně 8 kb, je lokalizován na chromozomu 20 v pozici q11.2 a skládá se ze 4 exonů a 3 intronů. Polymorfismus je jednonukleotidovou substitucí A G v pozici 4600 u haplotypu A3 a jednonukleotidovou substitucí G C na pozici 4678 u haplotypu A1 (Navarro et al., 2011; Haiashi et al., 1999; Lillicrap, 2001). Je to transmembránový protein typu 1, který se exprimuje v buňkách endotelu velkých cév a je přítomen ve stopovém mnoţství ve většině kapilár. EPCR je podobný molekulám hlavního histokompatibilního komplexu 1. třídy. Má A1 a A2 extracelulární domény, transmembránovou doménu a velmi krátkou cytoplazmatickou část (de Willige et al., 2004). Antikoagulační cesta proteinu C hraje klíčovou roli v regulaci tvorby fibrinu prostřednictvím proteolytické inaktivace prokoagulačních kofaktorů FVa a FVIIIa. Protein C je aktivován na vaskulární endoteliální buněčné membráně. Pro správnou antikoagulační funkci proteinu C je třeba jeho spojení s endoteliálním receptorem proteinu C (EPCR). Ten umoţní postavení proteinu C vedle komplexu trombintrombomodulin na endoteliálních buňkách a podporuje tak jeho aktivaci. Aktivovaný protein C reguluje tvorbu trombinu inaktivací faktorů Va a VIIIa a vykazuje cytoprotektivní účinky přes vazbu na EPCR. Odpovídající tvorba APC závisí na povrchu endoteliálních buněk, trombinu, trombomodulinu, proteinu C a EPCR. Proto jakákoliv změna v těchto komponentech můţe způsobit sníţení nebo zvýšení tvorby APC a modulovat rizika trombózy (Navarro et al., 2011; Lillicrap, 2001). Rozsáhlá analýza genu EPCR odhalila 13 polymorfismů a 3 haplotypy, které významně ovlivňují plazmatickou hladinu APC, a tím i riziko ţilní trombózy (Navarro et al., 2011). H1 (A1) A4600G v exonu 4 kóduje substituci Ser219Gly v transmembránové oblasti EPCR a haplotyp H3 (A3) G4678C v 3 -nepřekládané 23

oblasti. H3 je spojován s vysokou hladinou sepcr coţ je v plazmě přítomna rozpustná forma EPCR, která je generována činností metaloproteázy (Saposnik et al., 2004; Medina et al., 2004). Metaloproteasová aktivita vede ke štěpení celé extracelulární domény EPCR. Výsledný sepcr si zachovává svou afinitu pro protein C i APC, ale v této formě inhibuje APC antikoagulační aktivitu blokováním interakce PC a APC s negativně nabitými povrchy, která je nezbytná pro efektivní inaktivaci FVa a FVIIa. U zdravých jedinců je hladina cirkulujícího plazmatického sepcr asi 100 ng/ml. Ve studii z roku 2004 zjistili, ţe distribuce hladiny sepcr byla v kontrolní populaci trimodální a byla geneticky řízena haplotypem 3. Tento haplotyp vysvětlil 86,5% variaci v hladinách sepcr. Nosiči dvou H3 alel mají vyšší hladinu sepcr (439ng/ml), neţ nosiči jedné H3 alely (258ng/ml), která má vyšší hladinu neţ nonh3 nosiči (94ng/ml) (de Willige et al., 2004). Haplotyp H1 je spojován se zvýšenou hladinou cirkulujícího APC a sníţením rizika ţilní trombózy. Nedávno bylo prokázáno, ţe má také ochrannou funkci proti opakované ztrátě těhotenství, zvláště u nosiček FV Leiden (Navarro et al., 2011). EPCR H3 je spojována s vyšší plazmatickou hladinou proteinu C a faktoru VII, coţ můţe být povaţováno za riziko trombózy (Navarro et al., 2011). Co se týče mutace, která tvoří H3 haplotyp, alela 4600G (219Gly) vyvstává jako nejpravděpodobnější kandidát odpovědný za spojení H3 haplotypu se zvýšenou hladinou sepcr, díky tomu, ţe štěpení EPCR zakotveného v endoteliální buněčné membráně na sepcr nastane uvnitř oblasti proteinu kódovaného exonem 4, blízko pozice 4600 (Navarro et al., 2011). Alternativní vysvětlení pro trombogenicitu, kterou H3 můţe vyvolat je, ţe zvyšuje vylučování sepcr, a to by mohlo sníţit mnoţství EPCR na endoteliálním povrchu (Navarro et al., 2011). Spojení haplotypu H3 a vysokých hladin sepcr s rizikem VTE je sporné. Některé studie uvádějí, ţe zvýšené riziko VTE u nosičů haplotypu H3 je pouze u muţů a jiné studie nenašli významnou souvislost mezi EPCR H3 a rizikem trombózy. Ale bylo pozorováno, ţe EPCR H3 zvyšuje riziko VTE u nosičů mutace protrombinu G20210A, coţ je pravděpodobně způsobeno jeho asociací se 24

zvýšenou hladinou sepcr. Také bylo zjištěno, ţe nosiči H3 mívají první příhodu VTE v mladém věku (Navarro et al., 2011). Hypomorfní mutace genu by mohly vést k poklesu EPCR aktivity na membráně anebo nízké expresi EPCR. Výsledkem by pak mohlo být sníţení tvorby APC, méně inaktivace FVa a FVIIIa, více trombinu a zvýšené riziko trombózy. Na druhou stranu, nadměrná exprese EPCR by mohla vést ke sníţení rizika trombózy (de Willige et al., 2004). Zvýšení plazmatického sepcr můţe být spojeno s vyšším trombotickým rizikem, protoţe plazmatický sepcr inhibuje aktivaci proteinu C a antikoagulační aktivitu APC. Vysoká hladina plazmatického sepcr také můţe vést k nízké zbytkové hladině EPCR na membráně a to vede ke sníţení aktivace proteinu C (de Willige et al., 2004). Zvýšená hladina sepcr se nachází přibliţně u 20% zdravých subjektů, převáţně nosičů haplotypu H3 (Saposnik et al., 2004). 7 DIAGNOSTIKA TROMBOFILNÍCH MUTACÍ Od objevu inhibitorů koagulace v 90. letech minulého století jsou k diagnostice markerů trombofilních stavů pouţívány molekulárně biologické metody, které jsou zaloţeny na metodě PCR (real-time PCR, multiplex PCR, PCR s následným štěpením restrikčními endonukleázami). Dnes se však analýza stále více zaměřuje také na odhalení patofyziologie hemokoagulačních procesů na molekulární úrovni (Slavík et al., 2009). 7.1 PCR PCR je enzymatická amplifikace fragmentu DNA, který je umístěný mezi dva oligonukleotidové primery. Zahrnuje tři fáze, které se opakují a probíhají v tzv. termocykléru. První fází je denaturace DNA zahřátím na 92 95 C po dobu asi 30 sek. Druhý krok je hybridizace denaturované DNA s nadbytkem syntetických oligonukleotidových primerů během inkubace při 50 60 C asi 30 sek. Třetí fází je replikace úseku DNA DNA-polymerázou mezi místy komplementárními 25

k oligonukleotidovým primerům. Na volnou 3 -OH skupinu primeru se kovalentně naváţe nukleotid a řetězec se prodluţuje. Proces se mnohokrát opakuje, aţ je dosaţeno poţadovaného stupně amplifikace (Snustad et al., 2009; Nusbaum et al., 2004). 7.2 Reverzní hybridizace Termín hybridizace označuje proces, ve kterém asociují dva řetězce DNA do dvouřetězce podle sekvenční komplementarity. Je-li jeden řetězec označen, slouţí jako sonda k vyhledávání komplementárních úseků DNA. Dnes se vyuţívají komerční kity, ve kterých jsou specifické oligonukleotidové sondy imobilizovány na nitrocelulózové membráně testovacích prouţků. Druhým hybridizujícím řetězcem je amplifikovaná biotinylovaná DNA. V případě komplementarity dochází k hybridizaci DNA k příslušné sondě. Po hybridizaci se na vytvořený biotinylovaný hybrid naváţe přidaný streptavidin, který je konjugovaný s alkalickou fosfatázou. Následuje inkubace s roztokem substrátu a vznikne purpurově hnědý precipitát. Při promývání se reakce zastaví a je moţno odečíst výsledek. Testovací prouţky mají navázáno více sond na přesně definovaných místech, aby se mohlo testovat více mutací najednou, a obsahují vţdy sondu komplementární k mutované sekvenci genu i k normální sekvenci (wild type). Z testovacího prouţku je pak moţno odečíst, zda je vyšetřovaný jedinec pro danou mutaci heterozygotní, homozygotní anebo je bez mutace. (SOP; Horák et al., 2010; web ViennaLab) 7.3 Real-time PCR Real-time PCR probíhá v termocykléru, který kromě klasických funkcí umoţňuje také detekci a kvantifikaci fluorescenčního signálu a sledování průběhu PCR v reálném čase (,,real-time ). Produkty PCR jsou tak ihned detekovány a není nutné pouţívat k detekci elektroforézu či reverzní hybridizaci jako u klasické PCR. 26

Obr. 2 Princip alelické diskriminace selektivní hybridizací TaqMan sond (web Applied Biosystems) Na prvním obrázku jsou znázorněny komponenty potřebné k testu a templátová DNA. Na prostředním obrázku je denaturovaná DNA a průběh hybridizace sond a primerů. V třetím obrázku je jiţ emitována fluorescence z komplementárně navázané sondy. Obecným principem je označení primerů anebo sond fluorofory, které po absorpci světla určité vlnové délky emitují světlo odlišné vlnové délky. Emitovaná vlnová délka světla je vţdy vyšší neţ absorbovaná. Některé sondy (např. TaqMan ) jsou označeny fluoroforem a tzv. zhášečem, coţ je molekula, která přijímá energii z fluoroforu a způsobuje její rozptýlení ve formě světla nebo tepla. Absorpční spektrum zhášeče se tak musí překrývat s emisním spektrem fluoroforu (Šmarda, et al. 2008). Firma Applied Biosystems vyuţívá TaqMan sondy, coţ jsou oligonukleotidy s fluoroforem na 5 konci a zhášečem připojeným na 3 konci. Dokud není sonda hydrolyzována, jsou fluorofor a zhášeč blízko sebe a zhášeč pohlcuje fluorescenční záření. Během PCR, sonda hybridizuje specificky do vnitřní oblasti PCR produktu. 27

Polymeráza pak uskutečňuje extenzi primerů a replikaci templátu, na kterém je TaqMan sonda navázána. 5 exonukleázová aktivita polymerázy rozštěpí sondu, molekula fluoroforu se uvolní z těsné blízkosti zhášeče a zvýší se intenzita fluorescence. Tento proces se opakuje (web Premier biosoft). Dnes se pouţívá tzv. TaqMan MGB sonda (MGB minor groove binder), coţ je nefluorescenční zhášeč, který zvyšuje teplotu tání sondy schopností navázat se do malé dráţky. Proto mají MGB sondy 13 18 nukleotidů a jsou tak kratší neţ jiné typy sond (web Biosynthesis). 28

8 CÍL PRÁCE Cílem diplomové práce je shrnutí informací o významu vybraných trombofilních mutací, určení jejich četnosti ve vybraném souboru jedinců a porovnání výsledků s frekvencemi výskytu popsanými v literatuře. Dalším cílem je zjistit přínos nově zavedené metody real-time PCR ve srovnání s dříve pouţívanou metodou reverzní hybridizace. 29

9 MATERIÁL A METODIKA Praktická část diplomové práce byla zpracována v Laboratoři forenzní genetiky, spol. s. r. o. v Ostravě. Náhodně byly vybrány vzorky krve a výsledky celkem 783 jedinců. V tomto souboru bylo 508 ţen a 275 muţů a většina pacientů byla ve věku od 20 do 60 let. Nejčastější diagnózy, se kterými byly pacienti odesláni na genetické vyšetření byly vady koagulace, flebitida a tromboflebitida, infertilita, onemocnění oběhové soustavy, a předoperační vyšetření. Pacientské vzorky byly odeslány z ambulancí praktických lékařů, klinických genetiků, klinických hematologů, gynekologů a z ambulance pro léčbu neplodnosti v Moravskoslezském kraji. Z mnoha známých vrozených trombofilních mutací je v této práci popsáno devět mutací v genech pro koagulační faktory. Právě tyto mutace se vyšetřují v Laboratoři forenzní genetiky, spol. s. r. o. při indikaci vyšetření trombofilie. U části pacientů byla k detekci pouţita metoda reverzní hybridizace detekční soupravou CVD StripAssay T (ViennaLab), která obsahuje testovací pouţky se sondami pro vybrané trombofilní mutace. Nově byla také zavedena metoda - real time PCR (TaqMan SNP Genotyping Assays firmy Applied Biosystems), kterou byla diagnostikována další část souboru. 30

9.1 Izolace DNA DNA byla izolována z krve pouţitím kitu QIAamp DNA Mini firmy QIAGEN. Pracovní postup: o Napipetovali jsme 20 µl proteinasy K do 1,5 ml zkumavky, o přidali 200 µl krve, o přidali 200 µl pufru AL (lysis buffer), o vortexovali 15s a inkubovali při 50-56 C 10 min., o napipetovali jsme 200 µl etanolu (96 100%), o vortexovali 15s a obsah jsme napipetovali do kolonek se sběrnou zkumavkou a zavřeli, o centrifugovali jsme 6000 x g (8000 rpm) 1 min. a poté jsme kolonku přemístili do nové 2 ml sběrné zkumavky, o napipetovali jsme 500 µl promývacího pufru AW 1, zavřeli kolonku, o centrifugovali 6000 x g (8000 rpm) 1 min. a opět přemístili kolonku do nové 2 ml sběrné zkumavky, o napipetovali jsme 500 µl promývacího pufru AW2, o centrifugovali 20 000 x g (14000 rpm) 3 min. a kolonku jsme přemístili do nové 1,5ml sběrné zkumavky, o přidat jsme 200 µl vody a inkubovali při pokojové teplotě (15 25 C) 1 minutu, o centrifugovali jsme 6000 x g (8000 rpm) 1 minutu. Vzorky DNA byly do doby analýzy skladovány při teplotě 2 8 C a po analýze při teplotě -18 aţ -20 C. 31

9.1.1 Kvantifikace DNA Výtěţek DNA byl určován z koncentrace DNA v eluátu, Pracovní postup o Napipetovali jsme 200 µl pufru a přidali 1 µl fluorescenčního barviva (na jeden vzorek), o Napipetovali jsme 200 µl připraveného pufru do kaţdé zkumavky, o přidali 10 µl standardu1, do další zkumavky 10 µl standardu 2, o do dalších zkumavek jsme napipetovali 10 µl vzorku, o na fluorometru jsme provedli kalibraci standardy, o provedli jsme vlastní měření vzorků. 9.2 PCR, reverzní hybridizace Přístroje a pomůcky: Laminární box (ESCO Class II BSC) PCR Box (ESCO PCR Cabinet) Mikrocentrifuga (MultiSpin MSC 6000, BIOSAN) Vortex (BioVortex V1 BioSan) Termoblok (TS 100 ThermoShaker, BIOSAN) Automatické pipety jednokanálové ThermoShaker BIOSAN PST-60-HL plus Thermocycler (ESCO Swift Maxi) Vodní lázeň BIOSAN ULTRATHERM BWT U Chemikálie a reagencie: Komerční detekční souprava CVD StripAssay T SuperTaq DNA polymerasa, HT BIOTECHNOLOGY LTD Injekční voda 32

Marker molekulových hmotností Agaróza 1xTBE Buffer Spotřební materiál: Sterilní špičky do automatických pipet pro jedno pouţití Sterilní PCR zkumavky (0,5 ml a 0,5 ml) Kontejnery na infekční odpad Latexové bezprašné rukavice Pracovní postup PCR 1. Příprava Master Mixu o PCR amplifikace probíhala v 25 µl PCR zkumavkách. MasterMix se připravoval do označených sterilních 1,5 ml eppendorfek pro potřebný počet vzorků. Tab. 1. Sloţení Master mixu Množství na 1 vzorek (µl) Amplification Mix 15 SuperTaq DNA Polymerasa 5 2. Pracovní postup PCR o Vzorky s izolovanou DNA jsme promíchali a centrifugovali, o připravili jsme a popsali PCR zkumavky, o připravený Master mix jsme rozpipetovali do PCR zkumavek po 20 µl, o napipetovali jsme 5 µl připravené DNA, o napipetovali jsme 5 µl pozitivní kontroly nebo injekční vody (beztemplátová kontrola kontrola PCR reakce), o PCR zkumavky jsme umístili do termobloku termocykléru, o po ukončení amplifikačního programu jsme PCR zkumavky s amplifikovanou DNA vyjmuli z termobloku, 33

Tab.2. Teplotní profil amplifikace Proces Teplota Čas denaturace 94 2 min denaturace 94 15 sec hybridizace 58 30 sec syntéza 72 30 sec Opakovat 30 krát závěrečná syntéza 72 3 sec 3. Kontrola amplifikace o K separaci PCR produktů jsme pouţili připravený 2-3 % agarózový gel, o smíchali 10 µl vzorku (produktu amplifikace) s 2 µl nanášecího barviva a nanesli do jamek gelu, o za poslední vzorek jsme nanesli pozitivní kontrolu, blank a ladder velikostní marker, o při separaci na horizontální elektroforéze jsme aplikovali konstantní elektrické napětí o velikosti 120 V po dobu přibliţně 40 min., o poté jsme agarózový gel vizualizovali na transiluminátoru pomocí UV světla a zkontrolovali délky a počet amplikonů: 134 bp, 165 bp, 173 bp, 202 bp, 223 bp, 254 bp, 283 bp,324 bp, o v případě přítomnosti amplikonu na gelu jsme pokračovali v analýze, o v případě, ţe by amplikony nebyly přítomny, provedli bysme znovu amplifikaci, popř. izolace DNA. 34

Pracovní postup reverzní hybridizace 1. Příprava reagencií o Připravili jsme detekční soupravu CVD Stripassay T, o vytemperovali vodní lázeň na 45 C, o vytemperovali Hybridization solution a Wash solution A na 45 C ve vodní lázni, o ostatní roztoky jsme vytemperovali na pokojovou teplotu. 2. Denaturace a hybridizace o Do jamek jsme nanesli 10 µl denaturačního roztoku, o přidali 10 µl produktu amplifikace a promíchali, o 5 min. jsme nechali denaturovat při pokojové teplotě, o napipetovali jsme do kaţdé jamky 1 ml hybridizačního pufru, o vloţili jsme do jamek testovací prouţky, o inkubovali jsme na třepačce 30 min při 45 C. 3. Promytí o Odpipetovali jsme obsah jamky a napipetovali 1 ml stringent wash solution A, o 10 20 s. jsme promíchávali a poté odpipetovali obsah, o Napipetovali jsme stringent wash solution A a inkubovali na třepačce 15 min při 45 C, o Odpipetovali jsme obsah jamek a opakovali poslední krok 4. Barevná reakce o Odpipetovali jsme obsah jamek a přidali 1 ml conjugate solution, o Inkubovali jsme 15 min. při pokojové teplotě, o odpipetovali obsah a přidali 1 ml stringent wash solution B, o promíchávali jsme 10 20 s. a odpipetovali obsah, o napipetovali jsme 1 ml stringent wash solution B, o inkubovali na třepačce 5 min. při pokojové teplotě, 35

o odpipetovali jsme obsah a opakovali poslední dva kroky, o odpipetovali jsme obsah a přidali 1 ml color developer, o inkubovali jsme na třepačce 15 min. při pokojové teplotě, bez přístupu světla, o 3 min. jsme promývali testovací prouţky destilovanou vodou, o odpipetovali obsah a opakovali poslední krok, o prouţky jsme nechali vysušit bez přístupu světla, pak nalepili do laboratorního deníku a vyhodnotili v PC. 5. Vyhodnocení výsledků Genotyp vzorku jsme stanovili pomocí přiloţené šablony, se kterou jsme porovnali pozitivní linie na testovacím prouţku. CVD Stripassay T strip obsahuje 10 wild-type sond a 8 mutant-type sond (obr. 3). Obr. 3. Testovací prouţek kitu CVD Strip Assay T Test (ViennaLab) pro vybrané trombofilní mutace 36

EPCR haplotypy A1(H1), A2 (H2), A3(H3) a výsledné homozygotní a heterozygotní genotypy jsme určovali sondami pro mutace 4600 A G a 4678 G C (obr. 4) Obr. 4. Šablona k vyhodnocení genotypů EPCR (web ViennaLab) 9.3 Real-time PCR Přístroje a pomocná zařízení: Laminární box (ESCO Class II BSC) PCR Box (ESCO PCR Cabinet) Mikrocentrifuga (MultiSpin MSC 6000, BIOSAN) Vortex (BioVortex V1 Biosan) Automatické pipety jednokanálové Ledničky, mrazáky 7300 Real-Time PCR Systém (Applied Biosystems) Stojánek na destičku (Micro Amp Optical 96 Splash Free Support Base Applied Biosystems) Hladítko (MicroAmp Adhesive Film Applicator Applied Biosystems) Chemikálie a reagencie: Roztoky jsou 40 x koncetrované a pouţívají se bez ředění. Před pouţitím se roztoky alikvotují po 50 µl. TaqMan SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems) 37

o Factor V Leiden (G1691A) o Factor V R2 (H1299R) o Factor II Protrombin (G20210A) o MTHFR (C677T) o MTHFR (A1298C) o Factor XIII (V34L) o PAI-1 (4G/5G) o EPCR (A4600G) o EPCR (G4678C) TaqMan Genotyping MasterMix (Applied Biosystems) Injekční voda (Aqua pro injectione B/Braun) Spotřební materiál: Sterilní špičky do automatických pipet pro jedno pouţití Špičky s filtrem k automatickým pipetám pro jedno pouţití Sterilní 0,5 ml a 1,5 ml mikrozkumavky 96-ti jamková destička (Micro Amp Optical 96 Well Reaction Plate, 0,2 ml) Krycí fólie (Micro Amp Optical Adhesive Film) kontejner na infekční odpad Jednorázové rukavice Pracovní postup real time PCR 1. Izolace DNA DNA jsme izolovali dle postupu uvedného výše 2. Příprava plotničky v programu 7300 Systém Software 3. Příprava master mixu 38