Stručný návod k použití softwaru K použití s typizační sadou IMMUCOR MIA FORA NGS HLA Určeno pro diagnostiku in vitro Strana 1 ze 17
Tato příručka je určena k použití se softwarem MIA FORA NGS SR-790-00017 S veškerými dotazy, komentáři a požadavky se prosím obracejte na našeho zástupce prostřednictvím níže uvedené adresy. Autorizovaný zástupce: Immucor Medizinische Diagnostik GmbH Adam-Opel-Strasse 26A Rodermark 63322 Německo Tel.: (+49) 6074-84 20-0 Technický servis pro Evropu: +32/3 385 47 91 IMMUCOR je obchodní značka Immucor, Inc. MIA FORA je obchodní značka Sirona Genomics, Inc. illumina je obchodní značka Illumina, Inc. MiSeq je obchodní značka Illumina, Inc. Účel použití Sada pro typizaci HLA pomocí NGS MIA FORA TM slouží k amplifikaci a sekvenování HLA genů HLA -A, -B, -C, -DRB-1/3/4/5, -DQA1, -DQB1, -DPA1 a -DPB1 na sekvenační platformě Illumina NGS. Software MIA FORA slouží jako návod ke stanovení typu HLA z dat získaných pomocí sady Strana 2 ze 17
MIA FORA NGS HLA. Test je určen k použití v laboratořích způsobilých k manipulaci DNA pro amplifikaci a sekvenování. Popis návodu Tento návod poskytuje základní pokyny k použití softwaru MIA FORA NGS Software 790-00017 ve spojení s následujícími sadami: SR- Typizační sada MIA FORA NGS HLA IVD pouze v Evropské unii) SR-800-10377 (označení CE pro Podrobné informace naleznete v příručce pro uživatele softwaru MIA FORA NGS. Tento návod nemůže nahradit příručku pro uživatele. Příslušná dokumentace Níže uvedené materiály obsahují doplňující informace vztahující se k tomuto návodu, nebo na něj odkazující. Příručka pro uživatele softwaru MIA FORA NGS (LC1619) Příbalový leták pro typizační sadu MIA FORA NGS HLA (LC1618CE) Omezení Omezení naleznete v příslušné dokumentaci. Strana 3 ze 17
Vytvoření projektu a analýza vzorku: 1. Vytvořte soubor s čárovými kódy vzorku (soubor Windows s hodnotami oddělenými čárkou(soubor csv)), který bude obsahovat názvy vzorků a přidělené čárové kódy. Uveďte také název projektu a polohy jamek. Tyto údaje budou použity pro analýzu sekvence. a. Otevřete software MIA FORA a přejděte na záložku Projects (Projekty). Klikněte na tlačítko New Project (Nový projekt) v pravém horním rohu hlavní stránky. b. Zadejte požadovaný název projektu (Project), číslo sady MIA FORA NGS (Lot), datum přijetí (Received at) a jméno operátora (Operator). Klikněte na tlačítko Browse (Hledat) a soubor s čárovým kódem vzorku (csv) bude nahrán. Poznámka: Název projektu nesmí být delší než 30 znaků. Znaky pomlčky a podtržítka jsou povoleny, zvláštní znaky však povoleny nejsou a budou odstraněny. Strana 4 ze 17
c. K navigaci v listu s čárovými kódy slouží tlačítko Next (Další), správnost názvů vzorků potvrdíte pomocí Yes (Ano). d. Nový projekt potvrdíte kliknutím na Finish (Dokončit). 2. Postup nastavení běhu MiSeq a pojmenování souborů FASTQ pomocí Illumina Experiment Manager naleznete v Příloze A. 3. Nový projekt je připraven k nahrání souborů FASTQ, jakmile je první řada označena oranžovou barvou. a. Klikněte na zelené tlačítko přehrávání pod záložkou Next Step (Následující krok), pomocí kterého spustíte nápovědu k souboru FASTQ. Strana 5 ze 17
b. Pomocí hledání (browse) nahrajte soubory FASTQ. Před zvolením obou souborů dlouze stiskněte klávesu CTRL. POZNÁMKA: Názvy souborů FASTQ musejí začínat názvem projektu, aby byl software schopen rozpoznat soubory. c. Klikněte na Finish (Dokončit) a spustí se nahrávání souborů FASTQ. 4. Klikněte na Project name (Název projektu) a vyberte projekt určený k analýze a kontrole dat. Poznámka: Nejaktuálnější projekty jsou uvedeny v horní části seznamu. Strana 6 ze 17
5. Klikněte na záložku Statistics (Statistiky) a spusťte kontrolu kvality běhu a. Zkontrolujte Piechart (Výsečový graf) i. Platné výsledky jsou >85 %. Neplatné výsledky <10 %. b. Zvolte Insert Distribution (Rozdělení insertu) i. Velikost insertu by měla být cca 150-400 c. Zkontrolujte Read Distribution Among Samples/Barcode (Interpretace rozdělení mezi vzorky/čárovými kódy) d. Zkontrolujte Nucleotide Distribution Along Each Position (Rozdělení nukleotidu pro jednotlivé pozice) i. Graf by měl od pozice 20 vykazovat stejné % pro každou bázi e. Zkontrolujte Quality Score Distribution Along Each Position (Rozdělení výsledků kvality pro jednotlivé pozice) Strana 7 ze 17
6. Klikněte na Review (Kontrola) a spusťte kontrolu dat Obr. 1. Kontrolní okno: (A) Rozbalovací menu se vzorky a lokusy (B) Zvolené genotypy pro vzorek (C) SNP (jednonukleotidový polymorfismus) a tabulky s navrženými LD (D) Tabulka vypočtených alelových frekvencí kandidátních genů (E) Linie pokrytí a prohlížeč zarovnávání (alignment) (F) Prohlížeč zarovnávání (alignement) pro contig de novo Strana 8 ze 17
a. Prostřednictvím systému značení pomocí praporků (Smart Flagging System) zkontrolujte všechny případné abnormální stavy, nedostatečná data a nejasnosti. b. Otevřete rozbalovací nabídku Sample (Vzorek) a Locus (Lokus) a zkontrolujte všechny údaje (Obr. 1 (A)) c. Zkontrolujte alely v tabulce Candidate (Kandidátní geny) (Obr. 1 (D)), i. Vezměte v potaz sloupec minimálního pokrytí cdna (pátý sloupec) a sloupec minimálního centrálního pokrytí cdna (šestý sloupec). d. V případě homozygotních stavů (pouze jedna alela na daný lokus) zkontrolujte informaci obsahující návrh LD, šedé stínování v linii pokrytí a tabulku s kandidátními geny, a zjistěte, zda nechybějí alely (Obr. 1 (C)). e. Linie pokrytí (Coverage Plots) zobrazíte zvýrazněním kandidátních alel v tabulce s kandidátními geny, poté zvolte možnost Coverage (Pokrytí) (Obr. 1 (E)). Strana 9 ze 17
f. V levém okně jsou zobrazeny referenční sekvence pokrytí souběžné s cdna, v pravém okně se nacházejí referenční sekvence pokrytí souběžné s genomem. Červené svislé čáry (křížky) nad křivkami znázorňujícími pokrytí označují polohy, které jsou odlišné mezi vybranými referenčními alelami. Šedě vystínované oblasti znázorňují rozdíl mezi celkovým pokrytím pro základní gen a celkovým pokrytím pro vybrané alely. g. Pro potvrzení / kontrolu automatického přidělení zvolte přidělenou alelu a alelu dle vlastního výběru. Klikněte na tlačítko Consensus Alignment (Odsouhlasené zarovnání) a proveďte srovnání s nejblíže odpovídající Contig. h. Projděte různé funkce zarovnání a porovnejte alely, a potvrďte nebo změňte automatické přidělení. Strana 10 ze 17
i. Použijte nástroje SNP a LD Suggestion (Návrh LD) a zvolte nejvhodnější řešení. i. V tabulce SNP je uveden seznam polymorfních de-novo spojených contig, fázovaných bloků a frekvencí nukleotidů na jednotlivých polymorfních místech. Pokud je poměr nukleotidových frekvencí v Contig1 vůči Contig2 odlišný od průměrného poměru, budou příslušné buňky vyznačeny oranžovou barvou. Strana 11 ze 17
ii. V panelu LD Suggestion (Návrh LD) jsou uvedeny záznamy z databáze Linkage Disequilibrium (Nerovnováhy vazeb) obsahující alely uvedené v tabulce genotypu vzorku. Jednotlivé řady představují alely, u kterých byla zaznamenána vzájemná propojení. Panel LD Suggestion (Návrh LD) má pouze informativní povahu. LD neslouží k výpočtu genotypů vzorku. j. V případě, že budou ve stavu provedeny změny, klikněte na tlačítko Refresh (Obnovit) nad tabulkou s genotypy. Pokud jsou všechny stavy správné, klikněte na tlačítko schválení a přejděte na následující vzorek. Vypočítaný stav mohou změnit pouze uživatelé ve funkci technika či ředitele laboratoře. k. Po schválení vzorku může výsledek změnit pouze uživatel v řídící roli, a to kliknutím na ReAnalysis (Provést novou analýzu). Strana 12 ze 17
7. Před vygenerováním zprávy (Report) klikněte na Summary (Shrnutí) a zkontrolujte genotypy všech vzorků. Strana 13 ze 17
8. Klikněte na tlačítko Report (Zpráva) a zvolte výsledný formát (PDF, PDF bez komentáře, XML) Strana 14 ze 17
PŘÍLOHA A Příloha: Spuštění MiSeq vyžaduje vytvoření listu se vzorky 1. Pomocí níže uvedeného odkazu stáhněte Illumina Experiment Manager. https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/experiment_manager/downloa ds.html 2. Otevřete software a klikněte na Create Sample Sheet (Vytvořit list se vzorky) 3. Zvolte MiSeq Instrument a klikněte na Next (Další). 4. Pod záložkou Select Category (Zvolit kategorii) zvolte Other (Jiná), pod Select Application (Zvolit aplikaci) zvolte FASTQ Only (Pouze FASTQ) a nakonec klikněte na Next (Další). Strana 15 ze 17
5. Zadejte Workflow Parameters (Parametry pracovního postupu) a zvolte Next (Další) a. Reagent Cartridge barcode field (Pole pro čárový kód kazety činidla): Zadejte číslo čárového kódu MiSeq. Číslo čárového kódu naleznete na štítku kazety. b. Sample Prep Kit (Sada pro přípravu vzorku): Zvolte TruSeq HT c. Index Reads (Počet interpretací indexu): Zvolte 0 d. Experiment name (Název pokusu): Musí začínat názvem projektu, který byl právě vytvořen pomocí softwaru MIA FORA (např: Školení_6led16_QUAIL) Pozn.: Zkopírujte název pokusu a vložte jej do pole Sample ID (ID vzorku) v kroku 6. e. Investigator Name (Jméno osoby provádějící pokus): Jméno příslušné osoby f. Description (Popis): Veškeré doplňující informace g. Date (Datum): Datum běhu h. Read Type (Typ interpretace): Zvolte párovaný konec i. Cycles Read 1/2 (Interpretace cyklu 1/2): Obě hodnoty by měly být 151 j. FASTQ Only Workflow-Specific Settings (Nastavení pracovního pokusu FASTQ): Žádné políčko není zaškrtnuté Strana 16 ze 17
6. Na obrazovce Sample Sheet (List se vzorky) je nutné uvést pouze 1 řadu. Zkopírujte název pokusu použitý v kroku 5 do pole Sample ID (ID vzorku). Klikněte na Finish (Dokončit). Soubor FASTQ bude pojmenován podle údaje zadaného v poli Sample ID (ID vzorku) (např.: Školení_6led16_QUAIL). 7. Uložte soubor CSV s názvem projektu (Project name) na příslušné místo v MiSeq. Strana 17 ze 17