Praktikum č. 6: Metody stanovení koncentrace bakterií. Metody určování citlivosti a rezistence bakterií k antibiotikům, chemoterapeutikům a dezinfekčním prostředkům. Průkaz β-laktamáz. Cíle: 1. Seznámit se s principy metod stanovení koncentrace bakterií ve vzorku (tělní tekutiny, tkáně, potraviny a pod). 2. Naučit se principy a zásady provedení metod stanovení citlivosti bakteriální kultury k antibakteriálním látkám. 3. Naučit se odečítat výsledky kvalitativního a kvantitativního stanovení citlivosti bakteriálních kmenů k antibakteriálním látkám a získané výsledky interpretovat.. Seznámit se s metodami screeningu antibakteriální rezistence (průkaz betalaktamáz). Určení počtu bakterií Obecně počty baktérií ve vyšetřovaných vzorcích stanovujeme přímými a nepřímými metodami. 1. Přímé metody: a) přímá mikroskopie nativních preparátů (lze použít speciálních postupů intravitálního barvení např. akridinovou oranží) b) kultivační průkaz - na pevných půdách zjišťujeme počet KTJ (kolonie tvořící jednotky) či CFU (colony forming units) viz. schéma. V tekutých půdách stanovujeme na základě statisticky ověřené pravděpodobnosti tzv. pravděpodobný počet baktérií MPN (most probable number). V tekutých vzorcích (např. voda), kde se předpokládá nízký počet baktérií v 1 ml, použijeme filtraci většího objemu (obvykle 100 ml) vzorku přes membránový filtr, který pak přikládáme na kultivační agarovou půdu. Po inkubaci počítáme kolonie na membránovém filtru a stanovíme počet CFU na přefiltrovaný objem tekutiny. 2. Nepřímé metody: a) měření zákalu na fotometru a koncentraci bakterií odečítáme z kalibrační křivky b) měření metabolické aktivity (vodivost, kolorimetrické metody) V praxi, zejména při očkování komerčně vyráběných mikrotestů pro identifikaci bakteriía při výrobě bakteriálních vakcín, se někdy využívá nefelometr (zákaloměr), kterým se měří intenzita zákalu rozptýlené bakteriální masy. Často se používá i subjektivní metoda porovnávání zákalu bakteriální suspenze se standardem, který obsahuje BaSO (McFarlandova zákalová stupnice). McFarlandova zákalová stupnice Pří smíchání roztoků chloridu barnatého a kyseliny sírové vzniká ve vodě nerozpustná sraženina síranu barnatého. Tato sloučenina se stala základem pro přípravu zákalové stupnice podle které lze přibližně stanovit koncentraci bakterií v neznámé suspenzi (viz. tabulka č. 3). 35
Tabulka č. 3: Příprava McFarlandovy zákalové stupnice Stupeň číslo 0,5 1 2 3 5 6 7 8 9 10 1,175% roztok chloridu barnatého (ml) 0,05 0,1 0,2 0,3 0, 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1% roztok kyseliny sírové (ml) 9,95 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9, 9,3 9,2 9,1 9,0 Přibližná koncentrace bakterií (x 10 8 /ml) 1,5 3 6 9 12 15 18 21 2 27 30 Zákalová řada se uchovává v temnu při laboratorní teplotě. Za těchto podmínek je stabilní 6 měsíců. Přibližné koncentrace neplatí pro všechny druhy bakterií, proto u růstově náročnějších druhů se musí ověřit kultivačně. V diagnostické bakteriologii se ptáme zpravidla výhradně na počet živých mikrobů (bakteriurie). Postupujeme tak, že materiál navážíme, homogenizujeme, ředíme ve sterilním pufrovaném fyziologickém roztoku někdy s příměsí peptonu. Pak jednotlivá ředění smísíme s vhodnou pevnou kultivační půdou, která byla sterilizována a následně temperována ve vodní lázni na 5 o C. Důkladně promícháme a necháme inkubovat. Po inkubaci počítáme vyrostlé kolonie (vybíráme misky s tím ředěním zkoumaného materiálu, které umožnilo nárůst počitatelných kolonií, t.j. 30-300). Jinou možností je, že připravenou suspenzi kapeme v odměřeném množství na hotovou agarovou půdu v Petriho misce, pak rozetřeme po povrchu a inkubujeme. Nakonec opět počítáme vyrostlé kolonie. Počty kolonií (CFU, KTJ) přepočteme na původní navážku vzorku. Existují ještě další testy, víceméně orientační, kterých se v bakteriologických laboratořích užívá informaci o počtu mikrobů. Je to např. TTC-test, založený na vlastnostech živých mikrobů redukovat TTC na červené formazany. STANOVENÍ CITLIVOSTI BAKTERIÍ K ANTIMIKROBIÁLNÍM LÁTKÁM Antimikrobiální látky jsou léčiva (antibiotika a chemoterapeutika), která potlačují množení, nebo mikroorganismy usmrtí. V tomto textu budeme používat jednotný termín antibiotikum pro obě skupiny látek, t.j. antibiotika (látky biologického původu) i chemoterapeutika (látky synteticky připravené). Základní vlastností antibiotik, která umožňuje jejich léčebné použití, je tzv. selektivní toxicita. Pro medicínskou praxi jsou totiž významná taková antibiotika, která při svém účinku na prokaryotické buňky nejsou toxická pro eukaryotické buňky hostitele. Spektrem účinnosti antibiotika se rozumí účinek na určitou skupinu bakteriálních druhů, rodů a podobně. Termín antibiotika se širokým spektrem účinku nevystihuje v současnosti postavení jednotlivých druhů antibiotik, proto se spíše nedoporučuje jeho užívání. 36
Antibiotika s úzkým spektrem účinku jsou velmi účinná na určité druhy/skupiny bakterií. Výstižněji se označují jako antibiotika s cíleným účinkem. Účinek antibiotik lze na základě jeho mechanismu dělit na bakteriostatický a bakteriocidní. Antibiotika s bakteriostatickým účinkem zastavují množení jednotlivých bakteriálních buněk v organismu hostitele, přitom je neničí. Antibiotika s baktericidním účinkem ničí bakteriální buňky in vitro a in vivo. Baktericidní efekt mohou mít i bakteriostatická antibiotika ve větších dávkách. Bakteriální buňky, na které má antibiotikum baktericidní nebo bakteriostatický účinek, se označují jako citlivé, ostatní jako rezistentní. Kvantitativní vyšetření citlivosti na různé dávky antibiotika určí jeho nejmenší účinnou koncentraci, tzv. minimální inhibiční koncentraci (MIC). MIC vyjadřuje množství antibiotika (g x ml -1 nebo mg x litr -1 ), které úplně potlačí růst kultury bakterií (testované inokulum pěstované in vitro). Za citlivou se považuje kultura, jejíž MIC je 2x až x menší než koncentrace dosahovaná terapeuticky v krvi (klinický breakpoint). Za rezistentní se považuje kultura, která se množí při koncentraci antibiotika výrazně vyšší než je průměrná MIC u kultur téhož druhu. V tomto případě se jedná o získanou rezistenci. Primární rezistence vyjadřuje stav, kdy antibiotikum je primárně neúčinné na daný mikrobní druh. VÝZNAM MIKROBIOLOGICKÉHO VYŠETŘENÍ PRO LÉČBU ANTIBIOTIKY Výběr a použití antibiotik se spojuje s určitým mikrobem, a to buď dokázaným v laboratoři, a nebo předpokládaným na základě typických klinických příznaků infekčního onemocnění. Proto je třeba původce onemocnění rychle a spolehlivě izolovat a určit. Materiál pro mikrobiologické vyšetření je nutné odebrat ještě před započetím antibiotické léčby. Podle výsledků vyšetření je možné zvolit antibiotikum pro terapii. Pokud již terapie probíhá a selhává, je možno ji na podkladě výsledků upravit. V laboratořích se určuje citlivost na větší počet antimikrobiálních látek. Tím jsou dány i předpoklady pro volbu správného léčiva. V nutných případech je možno stanovit i koncentraci antibiotika v tělních dutinách. 37
METODIKY ZJIŠŤOVÁNÍ CITLIVOSTI A KONTROLY ANTIBIOTICKÉ TERAPIE IN VITRO Používané metody spočívají ve zjištění schopnosti růstu za přítomnosti antibiotika. Antibiotikum se přidává do tekuté nebo tuhé půdy a podle uspořádání vyšetření lze hodnotit výsledek kvalitativně nebo kvantitativně. Jedná se o následující metody: 1. Kvalitativní/semikvantitativní disková difusní metoda 2. Kvantitativní a) zřeďování testované antibakteriální látky v bujónu b) zřeďování testované antibakteriální látky v agaru c) Epsilonmetr test (E test) ad 1) Disková difúzní metoda (Kirby-Bauerův test) využívá agarového média v Petriho misce. Jedná se o Mueller-Hinton agar, který ve srovnání jinými agarovými půdami neobsahuje inhibitory sulfonamidů. Pro vyšetření gramnegativních bakterií se používá tento agar bez úpravy, grampozitivní bakterie se testují na stejném médiu s přídavkem ovčí krve. Suspenze vyšetřované kultury musí být v takové kvantitě (přibližně 10 6 bakterií x ml -1 ), aby po nanesení 2 ml a odsátí přebytku s povrchu agaru rostly kolonie v těsném dotyku (polosplývavý růst). Po zaschnutí inokula se na povrch agaru přiloží disky nasycené standardním množstvím antibiotika (množství je určeno střední citlivostí kmenů, vzhledem ke koncentraci antibiotika dosažitelné v krvi a difúzní konstantou antibiotika). Po inkubaci do druhého dne dochází u citlivé kultury kolem disku s účinným antibiotikem ke vzniku inhibiční zóny. V praxi se pro vyjádření citlivosti stanoví určitá šířka minimální inhibiční zóny v milimetrech. Za dodržení přesných podmínek, tzn. kvality agaru, ph, koncentrace iontů, velikosti inokula jsou průměry inhibičních zón srovnatelné s hodnotami MIC (semikvantitativní metoda). Mezi šířkou inhibiční zóny a MIC hypotetického antibiotika existuje nepřímá závislost (viz. tabulka č. ). ad 2a) Do řady zkumavek s kultivačním médiem o různé koncentraci antibiotik dosažené dvojnásobným zřeďováním (např. v rozmezí od 128 mg/litr do 0,125 mg/litr) se očkuje standardizované inokulum testované kultury. Po inkubaci se určí zkumavka ve vzestupné řadě, v níž již nedošlo k pomnožení (růstu) kultury, tzn. nedošlo ke vzniku zákalu. Nejnižší koncentrace antibiotika, při které došlo k inhibici se označuje jako MIC (minimální inhibiční koncentrace) (viz. schéma na obrázku č. 7). 38
Technika stanovení MIC antibiotik přechází postupně na mikrometody: na destičce s 12 x 8 jamkami lze v objemu 0,1 ml provést 8 vyšetření. Význam mikrometod spočívá v efektivnosti provedení. Vyočkováním ze zkumavek nebo jamek se zábranou růstu na agar lze získat tzv. minimální baktericidní koncentraci - MBC. Ve zkumavkách se zábranou růstu mohou být i bakterie jen částečně devitalizované, které po vyočkování na kultivační půdu bez antibiotika dále rostou (viz. obrázek č. 9). V případě baktericidních antibiotik se hodnota MIC rovná MBC. ad 2b) Do řady misek se vylije agarová půda s přídavkem antibiotika v různých koncentracích (opět dvojnásobných). Na jednu misku lze naočkovat až 20 kmenů (obrázek č. 8). Tabulka č. : Příklady breakpointů vybraných antibakteriálních látek Antibakteriální látka Breakpoint (mg. L -1 ) Ampicilin 16 Oxacilin 12 Cefaklor 8 Ceftazidin 16 Erytromycin Gentamicin 8 Tetracyklin 8 Vankomycin 16 Hodnoty zjištěné u posuzované kultury Výsledné hodnocení (účinný/neúčinný) Poznámky: 39
Obrázek č. 7: Určení hodnoty MIC antibiotika zřeďováním v bujónu Čerstvá kultura Zředění 6 10 CFU/ml 0,125 0,25 0,50 1 2 Koncentrace antibiotika (mg/l) 8 0,06 0,125 0,25 0,5 1 2 6 Jeden mililitr suspenze testovaného bakteriálního kmene 10 CFU/ ml se přidá do zkumavek obsahujících 1 ml bujónu s vyředěným testovaným antibiotikem (8 až 0,125 mg/ l), tím dojde k dalšímu ředění antibiotika. Hodnota MIC je v našem případě 1 mg/ l (nejnižší koncentrace testovaného antibiotika, která zabránila množení testovaného kmene). 0
Obrázek č. 8: Určení hodnoty MIC antibiotika zřeďováním v agaru Suspenze kmene A 6 Z testovaného bakteriálního kmene se připraví suspenze o hustotě 10 CFU/ ml. Jednotlivé testované kmeny (A, B, C...) se nanesou kalibrovanou kličkou na povrch agarů s různou koncentrací testovaného antibiotika. 0 0,25 0,50 1 2 Koncentrace antibiotika (mg/l) A B C A B C A B C A B C A B C D E F D E F D E F D E F D E F A B C D E F 0 0,25 0,50 1 2 Po 18 hodinách inkubace při 37 C se odečtou hodnoty MIC. V našem případě je hodnota MIC testovaného antibiotika 2 mg/l pro kmeny A a C, mg/l pro kmen B, 1 mg/l pro kmen D a 0,5 mg/l pro kmeny E a F. 1
Obrázek č. 9: Určení minimální baktericidní koncentrace (MBC) 1 ml 1 ml 6 1 ml testované bakteriální kultury (10 CFU/ ml) se přidá k 1 ml bujónu s vyředěným antibiotikem (6 - mg/ l). Kontrola 6 32 16 8 0 Kontrola 6 32 16 8 0 Zkumavky nyní obsahují ve 2 ml 5 Z kontrolní zkumavky je vyředěného antibiotika 5 x 10 provedena subkultivace CFU/ ml testovaného kmene. na agar na ověření počtu bakterií v inokulu 0,5 ml 0,001 ml Inkubace přes noc Jsou zaznamenány zkumavky se zákalem a ze zkumavek bez zákalu je vyočkováno 0,1 ml na živný agar. 6 32 16 8 0 MIC = 16 mg/ l 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml 5 250 CFU = 5 x 10 na ml živých bakterií v kontrolní zkumavce. 250 CFU Inkubace přes noc 7 CFU Odečtení výsledků po kultivaci ze zkumavek bez zákalu. 7 CFU = 70 CFU/ ml ve zkumavce obsahující 16 mg antibiotika na ml. 70 CFU/ ml > 0,1% z původního 5 inokula (5 x 10 CFU/ ml). MBC = 32 mg/ l 2
Tabulka č. 5 : Přehled antibiotik a interpretačních kritérií pro posouzení výsledků diskové difusní metody (upraveno pro výuku) Antibiotikum/ koncentrace v disku v μg zkratka R (rezistence) I (intermediální) S (citlivost) Chloramfenicol/30 C 12 13-17 18 Ampicilin/10 AMP 11 12-13 1 Amoxicilin+ kys. AMC 19 20-2 25 klavulonová/30 Gentamicin/10 CN 12 13-1 15 Neomycin/30 N 12 13-16 17 Tetracyclin/30 TE 1 15-18 19 Streptomycin/10 S 11 12-1 15 Sulphamethoxazol SXT 10 11-15 16 trimethoprim Cephalothin/30 KF 1 15-17 18 Kolistin CT 8 9-10 11 Apramycin APR 11 12-1 15 Nalidixinová kys. NA 13 1-18 19 Sulphonamidy (směs) S3 12 13-16 17 Zapište průměry inhibičních zón u posuzovaných bakteriálních kultur a posuďte citlivost. Antibakteriální látka/ bakt. kmen č. Č. kmene Č. kmene Č. kmene Č. kmene zóna hodnocení zóna hodnocení zóna hodnocení zóna hodnocení 3
METODY PRŮKAZU BETALAKTAMÁZ Některé bakterie produkují enzymy, které porušují beta-laktamový kruh beta-laktamových antibiotik, která se pak stávají neúčinná. Širokospektré beta-laktamázy vznikají následkem jednobodových mutací v genových Sekvencích kódujících betalaktamázu. Jsou schopné rozkládat širokospektrá betalaktamová antibiotika jako cefalosporiny vyšších generací (cefotaxim, ceftazidim, ceftriaxon, cefepim a cefpirom) a monobaktamy. Zkráceně se označují ESBL (z angl. extended-spectrum betalactamases). Zvýšená aktivita těchto enzymů k širokospektrým cefalosporinum má však za následek i snížení citlivosti k inhibitorům betalaktamáz. Selekční tlak a nadměrné užívání nových betalaktamových antibiotik má za následek vznik nových variant betalaktamáz, kterých dnes rozlišujeme více než 150 druhů. Testy založené na přímém průkazu betalaktamáz Rozlišujeme 3 typy testů pro přímou detekci betalaktamáz, a to chromogenní, jodometrické a acidimetrické. Testy jsou založeny na průkazu hydrolýzy antibiotika, která nastává v případe přítomnosti betalaktamázy. Pozitivní reakce se projeví jako barevná změna. Chromogenní metody Pro průkaz betalaktamáz chromogenními metodami se užívá chromogenních cefalosporinů, mezi které řadíme nitrocefin, PADAC a CENTA. Při hydrolýze jejich betalaktamového kruhu účinkem betalaktamázy produkované testovaným mikrobem prodělávají barevnou změnu. Nejužívanější je nitrocefin, což je světle žlutá látka, jejíž hydrolýza účinkem betalaktamázy způsobí posun elektronu v molekule, který má za následek vznik tmavě červeného produktu obvykle do 30 minut. Nitrocefin je možné použít ve formě roztoku nebo jako komerčně dodávané disky a proužky napuštěné touto látkou, vyšetřovaná bakterie se testují rozetřením přímo na tento disk. Acidimetrické a jodometrické testy K detekci přítomnosti kyseliny penicilinové, která vzniká hydrolýzou penicilinu účinkem betalaktamázy, se používají také kolorimetrické indikátory. Substrátem při acidimetrických reakcích je penicilin s navázaným citrátem a k detekci reakce se užívá červený fenolový indikátor. Vzrůst ph v přítomnosti kyseliny penicilinové způsobí barevnou žmenu z červené na žlutou. Při jodometrické metodě se používá penicilin s navázaným fosfátem a komplex škrobu s jódem. V přítomnosti penicilinové kyseliny dochází k redukci jódu na jodid a k jeho uvolnění z komplexu se škrobem, což má za následek odbarvení. Zkumavková metoda: do 0,1 ml roztoku penicilínu (6mg/ml) ve zkumavce se vmíchá hustá suspenze zkoumané kultury. Po 30 minutách se přidají dvě kapky škrobového roztoku, poté Lugolův roztok. Dojde k modrému zabarvení, které se v pozitivním případě po promíchání obsahu do 5 minut odbarví. Diskový difuzní test s inhibitorem betalaktamázy Jedním z prvních testů pro průkaz širokospektrých betalaktamáz byl test známý pod názvem double-disk synergy test (DDS test). Inokulum testovaného mikroba se nanese na MH agar. Do středu misky se umístí disk obsahující kombinaci kyseliny klavulanové s amoxicilinem a disk s cefalosporinem 3. generace (nejcasteji s ceftazidimem) se umístí 30 mm od prvního disku. Kyselina klavulanová difunduje agarem a inhibuje betalaktamázu v okolí disku s cefalosporinem. V pozitivním případe dochází k typickému rozšíření inhibiční zóny kolem disku s cefalosporinem směrem k disku s kombinací amoxicilinu a kyseliny klavulanové. Citlivost testu vzroste, sníží-li se vzdálenost mezi disky na 20 mm. Kromě ceftazidimu se v těchto testech začal užívat také cefpodoxim a cefotaxim.