Praha 2009 RNDr. Zdeněk Fišar, CSc.
OBSAH PŘEDMLUVA... 3 1. ÚVOD DO PROBLEMATIKY... 4 1.1. SYNAPTICKÝ PŘENOS NERVOVÉHO SIGNÁLU... 5 1.1.1. Neurony a chemické synapse... 5 1.1.2. Složení, stavba a struktura membrán... 6 1.1.3. Dynamika buněčných membrán... 9 1.1.4. Membránové receptory pro neurotransmitery... 10 1.1.5. Nitrobuněčné signální cesty... 12 1.1.6. Membránové přenašeče pro neurotransmitery... 16 1.1.7. Membránové lipidy a přenos signálu přes chemickou synapsi... 17 1.2. HYPOTÉZY PORUCH NÁLADY (AFEKTIVNÍCH PORUCH)... 21 1.2.1. Východiska hypotéz... 21 1.2.2. Serotoninové hypotézy... 22 1.2.3. Membránové (biofyzikální) hypotézy... 23 1.2.4. Postreceptorové hypotézy... 24 1.2.5. Biologické markery... 25 1.3. ANTIDEPRESIVA A STABILIZÁTORY NÁLADY... 27 1.4. MEMBRÁNOVÝ PŘENAŠEČ PRO SEROTONIN PŘI DEPRESI A JEJÍ LÉČBĚ... 31 1.5. INTERAKCE ANTIDEPRESIV S LIPIDOVÝMI MEMBRÁNAMI... 34 1.5.1. Modelové membrány (liposomy)... 34 1.5.2. Interakce antidepresivum-lipidová membrána... 35 1.5.3. Lokalizace antidepresiv v membráně... 37 2. SHRNUTÍ K SOUBORU PUBLIKOVANÝCH PRACÍ... 39 2.1. VAZBA IMIPRAMINU K FOSFOLIPIDOVÝM DVOJVRSTVÁM MĚŘENÁ METODOU VAZBY RADIOLIGANDU.39 2.2. INTERAKCE TRICYKLICKÝCH ANTIDEPRESIV S FOSFOLIPIDOVÝMI DVOJVRSTVAMI... 42 2.3. ROZDĚLENÍ ANTIDEPRESIV MEZI PLASMU A ČERVENÉ KREVNÍ BUŇKY... 45 2.4. VLIV ANTIDEPRESIV S RŮZNÝMI FARMAKOLOGICKÝMI ÚČINKY NA UPTAKE SEROTONINU DO KREVNÍCH DESTIČEK... 47 2.5. VLIV DLOUHODOBÉHO PODÁVÁNÍ ANTIDEPRESIV NA LIPIDOVÉ SLOŽENÍ MOZKOVÝCH MEMBRÁN... 49 2.6. UPTAKE SEROTONINU DO KREVNÍCH DESTIČEK U DOSUD NELÉČENÝCH DEPRESIVNÍCH PACIENTŮ PŘED A PO LÉČBĚ CITALOPRAMEM... 51 2.7. CELKOVÁ DISKUSE... 54 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK... 59 LITERATURA... 61 Citace: Fišar Zdeněk: Deprese, antidepresiva a membrány. Multimediální podpora výuky klinických a zdravotnických oborů :: Portál 1. lékařské fakulty Karlovy Univerzity v Praze [online] Dostupný z WWW: <http://portal.lf1.cuni.cz/clanek-850-deprese-antidepresiva-amembrany>. ISSN 1803-6619 2
Předmluva Není dosud jasné, co je primární příčinou vzniku většiny duševních poruch a jaké jsou molekulární mechanismy vedoucí k terapeutickým účinkům používaných psychofarmak. Pokrok v této oblasti je spojen s hlubším poznáním normálních funkcí mozku. Při formulaci a ověřování hypotéz o molekulárních mechanismech provázejících vznik nebo léčbu poruch nálady vycházíme hlavně z pozorování mechanismů účinků látek s antidepresivními účinky. Místem primárního účinku většiny antidepresiv je plazmatická membrána. Vzhledem k amfifilním vlastnostem těchto léčiv dochází nejen k vazbě na specifická vazebná místa membránových proteinů, ale i k významným interakcím s lipidovou částí buněčných membrán, průniku antidepresiv do buňky a interakcím s nitrobuněčnými elementy. Protože terapeutické účinky antidepresiv se projevují až po delší době jejich podávání, je nutné poznat i jimi vyvolané adaptivní buněčné změny vedoucí ke změnám funkce neurotransmiterových systémů v mozku. V současné době jsou primární biochemické účinky antidepresiv známy mnohem lépe, než jejich účinky dlouhodobé, což je to dáno složitostí buněčných systémů zahrnutých do mechanismů dlouhodobých účinků různých antidepresiv. Pokroky v pochopení těchto mechanismů umožňuje mezioborový výzkum využívající především biochemické, genetické, molekulárně biologické, biofyzikální a farmakologické modely a metody. Předložená publikace vznikla na základě mé habilitační práce Deprese, antidepresiva a buněčné a modelové membrány, kterou jsem obhájil na 1. lékařské fakultě Univerzity Karlovy v Praze v květnu 2006. V první části jsou shrnuty literární poznatky o depresi a její léčbě se zaměřením na interakce antidepresivech s membránami. V druhé části jsou shrnuty výsledky studia mechanismů účinků antidepresiv a jejich interakcí s modelovými i buněčnými membránami, které jsem publikoval v letech 2004-2006 v 6 rozsáhlejších vědeckých článcích. Praha, říjen 2009 Zdeněk Fišar 3
Zdeněk Fišar 1. ÚVOD DO PROBLEMATIKY Poznatky o molekulární podstatě poruch nálady (afektivních poruch) jsou získávány hlavně na základě studia mechanismů účinků antidepresiv, stabilizátorů nálady a jiných látek ovlivňujících náladu. Předpokládá se, že poruchy nálady jsou způsobeny narušením neurotransmise v mozku, především poruchami v přenosu signálu přes chemické synapse, a antidepresiva uskutečňují své terapeutické účinky specifickým ovlivněním funkce membránových a nitrobuněčných složek zapojených do tohoto přenosu. Synaptický přenos nervového signálu umožňují specifické membránové proteiny (receptory, iontové kanály, přenašeče, enzymy) a přímé i adaptivní účinky antidepresiv na jejich funkce jsou studovány jak in vitro na izolovaných membránách a buňkách, tak in vivo na zvířecích modelech nebo ex vivo na lidských krevních buňkách. Významnou úlohu mají v přenosu signálu i membránové lipidy a steroly, o nichž je známo, že netvoří pouze strukturní základ buněčných membrán, ale jsou substráty pro některé druhé posly, neurotransmitery a volné mastné kyseliny a ovlivňují aktivitu řady proteinů přes změnu jejich pohyblivosti v membráně nebo přes specifické interakce lipid-protein. Vzhledem k chemickým vlastnostem antidepresiv dochází nejen k jejich vazbě na specifická proteinová vazebná místa, ale i k jejich akumulaci v lipidové části buněčných membrán. Dosud nejsou známy všechny důsledky těchto interakcí pro účinnost nebo pro vedlejší účinky farmakoterapie. Interakce antidepresivum-membránové molekuly jsou proto studovány na modelových fosfolipidových dvojvrstvách, na rekonstituovaných systémech (proteoliposomech), na izolovaných membránách i na celých buňkách. Nepřímo lze interakce léčivo-buněčná membrána charakterizovat pomocí sekundárních reakcí, nebo přes ovlivnění procesů vyvolaných jinými biologicky aktivními látkami. Metody používané pro toto studium využívají často látky značené radionuklidy, jadernou magnetickou rezonanci, diferenciální skanovací kalorimetrii, elektronovou paramagnetickou rezonanci, neutronovou difrakci a v neposlední řadě fluorescenční spektroskopii. V našich experimentech jsme používali hlavně tritiem značená antidepresiva, neurotransmitery nebo fosfolipidy a fluorescenční sondy. Tento přístup nám umožnil studovat interakce membránaléčivo s minimálními vedlejšími efekty informačních molekul (sond, značek) na vlastnosti membrán. Tato práce je příspěvkem k poznání úlohy membránových lipidů a funkce membránového přenašeče pro serotonin při depresivní poruše a její léčbě. Vycházel jsem ze skutečnosti, že značná část makromolekul podílejících se na přenosu signálu je vázána v buněčných membránách a vyžaduje pro svou správnou funkci interakce s určitými membránovými lipidy. V úvodní části jsou stručně shrnuty hlavní poznatky o synaptickém přenosu nervového signálu a o synaptických membránách. Následují základní informace o biochemických hypotézách afektivních poruch a o mechanismech působení antidepresiv. Podrobněji jsou uvedeny dosud známé poznatky o úloze membránového přenašeče pro serotonin při depresi a její léčbě a možnosti studia interakcí antidepresiv s membránovými lipidy. Více infomací lze nalézt např. v monografii (Fišar a kol. 2009). Ve druhé části následuje stručné shrnutí k pracím, které jsem v poslední době publikoval na téma interakcí antidepresiv s modelovými i buněčnými membránami. Komentáře a shrnutí k jednotlivým publikacím jsou řazeny dle složitosti zkoumaných objektů, od modelových membrán ke krevním buňkám, laboratorním zvířatům a lidským subjektům; zakončeny jsou celkovou diskusí. 4
1.1. Synaptický přenos nervového signálu 1.1.1. Neurony a chemické synapse Neurony obsahují podobné buněčné složky jako jiné buňky, tj. plazmatickou membránu, jádro, jadérko, jadernou membránu, neuroplazmu a organely. Důležitou složku neuronů tvoří cytoskelet - heterogenní síť vláknitých struktur, kterou tvoří navzájem interagující a propojené sítě z mikrotubulů, neurofilament a mikrofilament. Jedná se o vysoce dynamický systém napojený na další buněčné struktury, především na membránu. Vzhledem k velké spotřebě energie nutné pro udržování transmembránových iontových gradientů jsou neurony zvláště bohaté na mitochondrie. Polyribosomy lokalizované na drsném endoplazmatickém retikulu poblíž jádra tvoří Nisslovu substanci, která produkuje specifické neuronové proteiny. Kromě běžných buněčných složek mají neurony morfologicky a funkčně odlišné oblasti, které se specializují na přenos signálu: axon, dendrity a synapse. Struktura a funkce neuronů je známa z buněčné biologie (Levitan and Kaczmarek 2002). Synapse jsou specializované oblasti buněčného kontaktu umožňující přenos informace z jednoho neuronu na druhý nebo mezi neurony a receptorovými nebo efektorovými buňkami. Jsou tvořeny presynaptickou částí (obsahující mimo jiné synaptické váčky s neurotransmitery) spolu s přilehlou postsynaptickou (obvykle dendritickou) membránou. Presynaptická a postsynaptická část jsou odděleny synaptickou štěrbinou (20-30 nm). V průměru vytváří každý neuron asi 1000 synaptických zakončení, ale počet synapsí na jednom postsynaptickém neuronu může dosahovat i několika desítek tisíc; pokrývají potom značnou část membrán dendritů i buněčného těla. Může docházet jak k velké konvergenci signálů na jeden neuron od stovek až tisíců presynaptických buněk, tak k divergenci signálu z jednoho presynaptického neuronu na desítky nebo stovky postsynaptických buněk. Účinky přenosu signálu na postsynaptickou část mohou být excitační nebo inhibiční; teprve jejich součet v daném čase určuje, zda vznikne akční potenciál nebo nitrobuněčná odezva. Neuroaktivní látky (mediátory, transmitery, působky) podílející se na přenosu nervového signálu lze dělit na neurotransmitery, neuromodulátory a neurohormony. Neurotransmitery jsou látky uvolňované z neuronu do synaptické štěrbiny a ovlivňující aktivitu (excitovatelnost) pouze jedné nebo několika prostorově blízkých buněk. Zajišťují tak mezibuněčný přenos nervového signálu. Z chemického hlediska se jedná především o monoaminy, aminokyseliny a peptidy. Neurohormony jsou hormony syntetizované a uvolňované nervovým systémem a poté přenášené krví ke vzdáleným cílovým buňkám, jejichž aktivitu ovlivňují. Klasickými neurohormony jsou oxytocin a vasopressin. Rozdělení na neurotransmitery a neurohormony lze považovat za zastaralé, neboť je známo, že řada neuropeptidů působí nejen dálkově jako neurohormony, ale i lokálně jako neurotransmitery. Podobně některé klasické neurotransmitery se mohou uvolňovat do krevního oběhu a působit jako hormony. Zvláštní skupinu látek podílejících se na mezibuněčném přenosu signálu tvoří růstové faktory, které stimulují proliferaci buněk a podporují jejich přežívání. Neurotransmisí se rozumí aktivní, časově omezený a nevratný proces, jehož výsledkem je přenos nervového signálu mezi neurony. Po příchodu depolarizační vlny na presynaptické zakončení je elektrický signál převeden (transdukován) na chemický (uvolnění neurotransmiteru), a ten může být v postsynaptické části převeden buď zpět na elektrický signál, nebo na nitrobuněčnou změnu. Sekrece neurotransmiteru z presynaptické části následuje po vstupu kalcia přes napěťově řízené Ca 2+ -kanály (Obr. 1). Množství uvolněného mediátoru přitom závisí na koncentraci nitrobuněčného kalcia. Všechny procesy související s přenosem signálu přes chemickou synapsi nejsou dosud známy. 5
Zdeněk Fišar Obr. 1 Převod signálu přes chemickou synapsi (Fišar a kol. 2009) 1.1.2. Složení, stavba a struktura membrán Mnoho základních buněčných procesů, včetně zpracování informací, nitrobuněčného a mezibuněčného přenosu signálu, se odehrává v plazmatických membránách nebo jiných membránových strukturách. V této kapitole jsou uvedeny pouze základní informace o složení, stavbě a vlastnostech membrán s ohledem na jejich funkci při šíření nervového signálu a na úlohu lipidové dvojvrstvy. Buněčné membrány jsou tvořeny především lipidy, steroly, proteiny, glykolipidy a glykoproteiny. Mají jednotný organizační princip, tj. uspořádání většiny membránových lipidů do dvojné vrstvy (o tloušťce kolem 6 nm) s více či méně zanořenými proteiny (Obr. 2). Značná část buněčných proteinů se vyskytuje pouze v membránách, kde zajišťují řadu specifických procesů spojených s transportními a rozpoznávacími funkcemi membrán (pumpy, nosiče, iontové kanály, receptory, enzymy apod.). Umožňují udržování iontových a metabolických gradientů nezbytných pro většinu buněčných funkcí včetně přenosu nervového signálu. Obr. 2 Model buněčné membrány (Fišar a kol. 2009) 6
Lipidová část membrán je směsí fosfolipidů, glykolipidů, sfingomyelinu, kardiolipinu a cholesterolu (Obr. 3), přičemž zastoupení těchto složek je v různých membránách velmi odlišné. Hlavními lipidovými složkami buněčných membrán jsou glycerofosfolipidy, jejichž základem je sn-glycerol-3-fosfát esterifikovaný na uhlících C (1) (sn-1) a C (2) (sn-2) mastnými kyselinami a na fosforylové skupině další skupinou. Nejběžněji se vyskytující glycerofosfolipidy jsou fosfatidylcholin (lecitin), fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylinozitol, fosfatidylglycerol, difosfatidylglycerol (kardiolipin) a kyselina fosfatidová. Podstatnou složkou některých biomembrán jsou sfingolipidy odvozené ze sfingosinu, resp. z jeho N-acyl-derivátů, ceramidů. Nejčastější sfingolipidy jsou sfingomyeliny (sfingofosfolipidy), cerebrosidy (jednoduché sfingoglykolipidy, které nemají fosfátovou skupinu a obvykle ani náboj; v mozkových buňkách se hojně vyskytují galaktocerebrosidy) a gangliosidy (sfingoglykolipidy, které obsahují alespoň jeden zbytek kyseliny sialové; tvoří asi 6% mozkových lipidů a jsou lokalizovány v povrchové vrstvě membrány, kde mají receptorovou funkci). Významnou složkou živočišných membrán je cholesterol, který se vyskytuje hlavně v plazmatických membránách, méně v membránách organel. Cholesterol je hlavní membránový aktivní sterol, který může významně ovlivňovat buněčný růst a aktivitu membránových proteinů (receptorů, přenašečů, iontových kanálů apod.) jak přímými interakcemi, tak i nepřímo, přes změny struktury a fyzikálních vlastností lipidových dvojných vrstev. V mozku je neesterifikovaný cholesterol přítomen ve vysokých koncentracích v plazmatických membránách neuronů a glií. Protože cholesterol neprostupuje hematoencefalickou bariérou, je syntetizován v mozku. Jeho obrat má důležitou úlohu při opravě a přetváření neuronů. Obr. 3 Membránové lipidy a cholesterol (Fišar a kol. 2009) 7
Zdeněk Fišar Dle známého a stále upřesňovaného modelu tekuté mozaiky (Singer and Nicolson 1972) mají buněčné membrány tyto základní vlastnosti: strukturní základ membrány je tvořen lipidovou dvojvrstvou, v níž jsou zakotveny integrální a periferní proteiny; existuje heterogenita lipidového složení v rovině horizontální i vertikální; cholesterol je lokalizován mezi řetězci mastných kyselin; za fyziologických podmínek je lipidová dvojvrstva v tekutém stavu; translační a rotační pohyblivost membránových molekul umožňuje specifické procesy v membráně, např. transmembránový přenos signálu. Tento model byl doplněn o existenci nedvojvrstevných struktur v membránách a o výskyt mikrodomén ( raftů ) s odlišným zastoupením cholesterolu a určitých fosfolipidů (Mouritsen et al. 1995, Barenholz 2002). Integrální proteiny jsou v lipidové dvojvrstvě rozpuštěny prostřednictvím hydrofobních a elektrostatických interakcí a vodíkových vazeb. Specifické interakce lipid-protein jsou umožněny nejen vazebnými vlastnostmi proteinů, ale i polárními hlavičkami lipidů, zbytky nenasycených mastných kyselin v molekulách lipidů a asymetrií lipidové dvojvrstvy (na vnější straně jsou lokalizovány především fosfatidylcholin, sfingomyelin, galaktocelebrosid; na vnitřní straně hlavně fosfatidyletanolamin, fosfatidylserin, fosfatidylinozitol). Membránové lipidy netvoří jen strukturní základ membrány, ale jsou také substráty fosfolipáz, modulátory funkce řady membránových proteinů a podílejí se na biosyntéze jiných biologicky aktivních molekul, např. druhých poslů, volných mastných kyselin nebo endogenních kanabinoidů. Transportní mechanismy zahrnující receptory, iontové kanály, enzymy, přenašeče a pumpy jsou často regulovány membránovými lipidy a cholesterolem, samotnými i uspořádanými do lipidové dvojvrstvy (Shinitzky 1984, Srivastava et al. 1987, Scanlon et al. 2001, Cornelius 2001, Lee 2003). Celkově lze říci, že úloha membránových lipidů a mastných kyselin v buněčných funkcích není zdaleka poznána. Rovněž existence a úloha hustotních fluktuací nebo oblastí s nenáhodným lipidovým složením (mikrodomén) je teprve studována (Barenholz 2002, Fielding and Fielding 2003). Polární hlavičky membránových lipidů jsou obvykle tvořeny záporně nabitou fosfátovou skupinou s navázanými kladnými, zápornými, zwiterionickými nebo nenabitými skupinami (Obr. 3). Specifické ovlivnění funkcí membránových proteinů těmito polárními hlavičkami lze vysvětlit na základě elektrostatických interakcí, jejichž specificita je dána prostorovým rozložením náboje jak na povrchu proteinu, tak v polárních hlavičkách interagujících lipidů. Obtížnější je vysvětlení vysoké variability v délce a nasycenosti acylových řetězců, protože pro udržení struktury, uspořádanosti a určité fluidity lipidové dvojvrstvy není tato různorodost nezbytná. Pravděpodobným vysvětlením je možnost přizpůsobení se tvaru acylových řetězců hydrofobnímu povrchu membránových proteinů ( hydrophobic matching ), což umožňuje specificky ovlivňovat vlastnosti proteinů (Dumas et al. 1999). Proteiny vázající fosfolipidy jsou důležitou složkou přenosu buněčných signálů, přenosu molekul a metabolismu (Hurley et al. 2000). Saturované a mononenasycené mastné kyseliny mohou být syntetizovány v těle de novo, avšak esenciální polynenasycené mastné kyseliny jsou syntetizovány z potravních prekursorů, linolové kyseliny (18:2) pro n-6 skupinu a α-linolenové kyseliny (18:3) pro n-3 skupinu mastných kyselin. V neuronech se vyskytují především arachidonová kyselina (20:4, n-6) a dokosahexaenová kyselina (22:6, n-3) vázané v pozici sn-2 glycerolového základu fosfolipidů. Arachidonát je uvolňován 1. hydrolýzou fosfolipázou A 2, 2. kombinovaným působením fosfolipázy C, diacylglycerolkinázy a fosfolipázy A 2, 3. hydrolýzou diacylglycerollipázou. Většina arachidonátu je inkorporována ve fosfatidylcholinu, fosfatidylinozitolu a fosfatidyletanolaminu. V mozku tvoří arachidonát až 10% z celkových mastných kyselin. Od kyseliny arachidonové jsou odvozeny také endogenní kanabinoidy, jako 8
anandamid (N-arachidonoyletanolamid) a 2-AG (sn-2-arachidonoylglycerol), které jsou uvolňovány z membránových fosfolipidů v odezvě na synaptickou depolarizaci nebo aktivaci receptorů (Fišar 2009). Úloha cholesterolu, fosfolipidů a esenciálních nenasycených mastných kyselin je již dlouho diskutována v některých biochemických hypotézách afektivních poruch, které vycházejí z předpokladu, že pro správný vývoj a funkci mozkových struktur je nezbytný normální neuronální lipidový metabolismus (viz kap. 1.2). Mechanismy působení n-3 a n-6 nenasycených mastných kyselin při normální nebo patologické funkci neuronální aktivity nejsou dostatečně známy, ale je zřejmé, že dokosahexaenová kyselina je hlavní n-3 mastná kyselina v mozku a že eikosapentaenová kyselina má významnou úlohu jako protizánětlivý prekursor (Peet and Stokes 2005, Young and Conquer 2005). Kyselina arachidonová je u lidí prekursorem prostaglandinů, prostacyklinů, tromboxanů a leukotrienů (Jiang et al. 1998). Obecně mohou být nenasycené mastné kyseliny spojeny s mnoha aspekty funkce neuronů, včetně neurotransmise, fluidity membrán, regulace receptorů, přenašečů a iontových kanálů a genové exprese. 1.1.3. Dynamika buněčných membrán Malé membránové molekuly jsou za fyziologických podmínek vysoce pohyblivé v rovině lipidové dvojné vrstvy (podélná, laterální difúze). Se snížením teploty dochází k uspořádávání membránových molekul a ke snížení jejich laterální i rotační pohyblivosti. Přechod lipidové dvojné vrstvy z fluidního do zatuhlého stavu je přirovnáván k přechodu ze stavu tekutého krystalu do stavu tuhého gelu (Obr. 4). Teplota, při níž dochází k přechodu membrány, nebo její části, ze stavu gelového do stavu fluidního se nazývá teplota fázového přechodu. Na tekutost, resp. fluiditu lipidové dvojné vrstvy má kromě teploty vliv také přítomnost cholesterolu (snižuje tekutost membrán), stupeň nenasycenosti zbytků mastných kyselin, přítomnost glykolipidů a dále řada fyzikálních a chemických činitelů. Příčná difúze (flip-flop, překlápění), tj. přesmyk lipidové molekuly z vnější části dvojné vrstvy do vnitřní nebo naopak, je velmi pomalá (poločas několik dnů); v buňkách může být toto překlápění katalyzováno flipázami. Rovněž nepolární zbytky mastných kyselin v lipidech jsou za fyziologických podmínek vysoce pohyblivé. Celkový tvar molekul membránových lipidů, je určen hlavně konformací jejich uhlovodíkových řetězců. Změny prostorového uspořádání jsou přitom umožněny relativně volnými rotacemi kolem jednoduchých vazeb C C. Dvojné vazby nenasycených mastných kyselin mají cis (Z) konfiguraci, což způsobuje rigidní ohyb o 30 v uhlovodíkovém řetězci. Větší zastoupení dvojných vazeb potom vede k velmi složitým tvarům molekul. Vyšší obsah zbytků nenasycených mastných kyselin nebo nižší obsah cholesterolu zvyšují pohyblivost molekul v membráně. Obr. 4 Fázový přechod lipidové dvojné vrstvy (Fišar a kol. 2009) 9
Zdeněk Fišar K pozorovatelným změnám v distribuci molekul v rovině membrány dochází během milisekund, k rotační reorientaci malých molekul nebo částí makromolekul dochází během nanosekund. Heterogenita membrán způsobuje, že laterální pohyblivost molekul v rovině membrány je menší, než by odpovídalo jejich rotační pohyblivosti. Experimentálně je však často sledován jen jeden typ difúzního pohybu molekul v membráně. Nejčastěji se pro tato měření používají spektroskopické metody (elektronová spinová rezonance, jaderná magnetická rezonance, fluorescence, Ramanův rozptyl). Tyto metody jsou založeny na měření určitého signálu (rezonanční absorpce energie vysokofrekvenčního magnetického pole, fluorescenční nebo rozptýlené záření apod.) molekul, skupin či atomů lokalizovaných v membráně. Tyto zpravodajské skupiny jsou buď membráně vlastní, nebo jsou do ní vneseny (spinové sondy, radionuklidem značené molekuly, fluorescenční sondy a značky, rezonanční značky pro Ramanův rozptyl atd.); jedná se o molekuly citlivé na vlastnosti mikrookolí, které samy výrazně neovlivňují sledovaný systém, ale umožňují detekovat změny jeho vlastností. V prvním přiblížení se lze dívat na vnitřek lipidové dvojvrstvy biologické membrány jako na homogenní neasociovanou izotropní nestlačitelnou kapalinu, jejíž vlastnosti jsou charakterizovány jedinou konstantou. V analogii s mechanikou kontinua je tato konstanta označována jako viskozita nebo fluidita, resp. tekutost. V případě lipidových dvojvrstev bylo zavedeno označení mikroviskozita. Protože viskozitu vnitřního prostředí dvojvrstvy nelze měřit přímo, je experimentálně určován parametr, který je s ní v přímé souvislosti. Je jím obvykle difúzní konstanta, korelační čas nebo relaxační čas. Ve druhém přiblížení bereme biologické membrány jako částečně anizotropní tj. pohyb v membráně je omezený a rozlišujeme pohyb v rovině lipidové dvojvrstvy a kolmo k ní. Stanovení změn fluidity membrán na základě měření anizotropie ustálené fluorescence vhodné sondy je pro svou jednoduchost velmi rozšířeno. Vzhledem k anizotropii buněčných membrán, ztrácí ale pojem fluidity či mikroviskozity membrán původní fyzikální význam a v těchto měřeních se jedná pouze o kvalitativní postižení změn uspořádání mikrookolí sondy a její pohyblivosti v membráně. Pomocí časově rozlišené fluorescence bylo potvrzeno, že anizotropie fluorescence určená stacionární metodou v sobě obsahuje jak informaci o pohyblivosti membránových molekul, tak informaci o jejich průměrném uspořádání. Podrobnější informace o možnostech fluorescenční spektroskopie při studiu dynamiky buněčných membrán publikoval autor na internetu (FIŠAR, Zdeněk. Fluorescenční spektroskopie v neurovědách [online]. c2003. Dostupný z WWW: <http://psych.lf1.cuni.cz/fluorescence/default.htm>). 1.1.4. Membránové receptory pro neurotransmitery Receptor je makromolekula specializovaná na přenos informace. Lze jej definovat jako specifické vazebné místo s funkčními vztahy. Funkčními vztahy se při synaptickém přenosu nervového signálu rozumí procesy vyvolané vazbou neurotransmiteru nebo jeho agonisty, které vedou ke změně propustnosti synaptické membrány pro určité ionty nebo k jiným specifickým změnám vlastností cílových buněk, jako je regulace obecného metabolického stavu, syntézy, ukládání a uvolňování neurotransmiterů, senzibility receptorů, organizace a struktury cytoskeletu, genové exprese apod. Receptory jsou dynamické systémy, které se mohou přizpůsobovat vnějším podmínkám a vyrovnávat tak např. změny v dostupnosti neurotransmiterů; může být regulován jak počet receptorů, tak jejich vlastnosti. Neurotransmiterové receptory buď obsahují interní iontový kanál, nebo se jedná o receptorový komplex zahrnující kromě proteinu se specifickým vazebným místem i transdukční prvek (obvykle G protein) a efektorový systém (iontový kanál, adenylátcykláza, fosfolipáza C), který zajišťuje buněčnou odezvu. 10
Obr. 5 Struktura receptorů spojených s G proteiny (Fišar a kol. 2009) Pro určitý neurotransmiter existuje obvykle více podtypů receptorů, které mohou nebo nemusí mít stejný nebo podobný transdukční prvek a efektorový systém. Na synapsích se mohou vyskytovat postsynaptické i presynaptické receptory, což umožňuje zpětnovazebné a křížové ovlivňování přenosu signálu. Více informací o vlastnostech, klasifikaci a funkci receptorů umožňujících synaptický přenos signálu lze nalézt např. v monografii Fišar a kol. (2009). Interakce neurotransmiteru se specifickým receptorem nastává na jednom nebo více aktivních (specifických) rozpoznávacích místech a vede k aktivaci receptorového systému. Různá léčiva soutěží s neurotransmiterem o obsazení těchto rozpoznávacích míst (kompetitivní látky). Působení některých psychofarmak může být úplně nebo částečně identické jako u fyziologického ligandu; hovoříme o úplných nebo částečných (parciálních) agonistech. Podobně u inhibitorů mluvíme o úplných nebo parciálních antagonistech. Inverzní agonisté vedou k opačnému efektu než plní agonisté. Nehledě ke kompetici, vytvářejí některé látky ireverzibilní vazby se skupinami v rozpoznávacích místech - jsou označovány jako blokátory. Látky, které se vážou k vazebným místům na receptorovém komplexu, tak že nedochází ke kompetici s neurotransmiterem, jsou označovány jako nekompetitivní. Konformační změny vyvolané vazbou nekompetitivních látek však mohou ovlivnit jak vazbu neurotransmiteru k receptoru, tak přenos signálu o jeho vazbě. Biochemické hypotézy afektivních poruch (Fišar 1998) se nejčastěji zabývají narušením přenosu signálů v mozku vyvolaném aktivací receptorů a napojeném na G proteiny a systémy druhých poslů (cyklické nukleotidy, metabolity fosfatidylinozitolu a kyseliny arachidonové, kalcium, oxid dusnatý). Dvě základní přenosové cesty nejčastěji uvažované v patofyziologii afektivních poruch a jejich léčbě jsou adenylátcyklázová a fosfoinozitidová (Fišar and Hroudová 2009). Adenylátcyklázový systém je aktivován nebo inhibován těmito typy a podtypy receptorů (Fišar a kol. 2009): adrenergními α 2 a β, serotoninovými 5-HT 1,4,6,7, dopaminovými D1 až D5, GABA B, metabotropními glutamátovými mglu 2,3,4,6,7,8, histaminovými H 2,3, muskarinovými acetylcholinovými M 2,4, opioidními a dalšími peptidovými. Receptorem aktivovaná hydrolýza fosfoinozitidů se uskutečňuje přes receptory serotoninové 5-HT 2, adrenergní α 1, dopaminové D2, metabotropní glutámátové mglu 1,5, histaminové H 1, muskarinové acetylcholinové M 1,3,5 a řadu peptidových. Část přenosové cesty, která se uskutečňuje v plazmatické membráně, může být přímo ovlivněna membránovými lipidy. V receptorových studiích (Bennett and Yamamura 1985) je vazba ligandu k membránovým vazebným místům charakterizována zdánlivou disociační konstantou, K d, a 11
Zdeněk Fišar vazebnou kapacitou, B max. Disociační konstanta je základní veličina pro charakterizaci vztahu struktura-funkce při interakcích neurotransmiteru nebo léčiva se specifickým receptorem. Lze ji použít i pro charakterizaci interakcí léčivo-lipidová dvojvrstva, kdy je však poněkud odlišný způsob interpretace. Vyšší afinita intramembránového vazebného místa může být způsobena jak vhodnější strukturou ligandu vzhledem k požadavkům vazebného místa, tak vyšší koncentrací nebo vhodnější konformací a orientací ligandů lokalizovaných v lipidové dvojvrstvě (Schwyzer 1991, Mason et al. 1991). Pro výpočet parametrů saturovatelné specifické vazby k intramembránovým místům je tedy vhodnější použít koncentraci léčiva v dvojvrstvě místo koncentrace volného ligandu. Spočtená efektivní disociační konstanta potom odpovídá zdánlivé disociační konstantě korigované na akumulaci ligandu (Heirwegh et al. 1992). Vynásobením zdánlivé disociační konstanty hodnotou rozdělovacího koeficientu je ovšem provedena jen velmi hrubá korekce, neboť distribuce léčiva v membráně je nerovnoměrná - v určitých oblastech lipidové dvojvrstvy mohou vznikat mnohem vyšší koncentrace ligandu, než odpovídá průměrné hodnotě. Na druhou stranu nemusí být vazebná místa zanořena v dvojvrstvě stejně hluboko, jako je lokalizována většina léčiva (Mason et al. 1991). Nesmíme však zapomenout, že uvedené korekce platí jen pro vazbu k intramembránovým místům, neboť pro vazebná místa na povrchu membrány (přístupná přímo z vodného prostředí) může mít akumulace léčiva v lipidové dvojvrstvě opačný efekt a projevit se jako úbytek dostupného volného ligandu; disociační konstanta takových míst je nepřímo vztažena k rozdělovacímu koeficientu léčiva v membránách (Boer et al. 1989). 1.1.5. Nitrobuněčné signální cesty Nitrobuněčné signální kaskády jsou hlavními cestami komunikace mezi plazmatickou membránou a řídícími procesy v různých nitrobuněčných složkách. Poznání nových signálních cest v neuronech, nebo objev nových složek a propojení u cest známých, lze považovat za nezbytný základ pro nalezení molekulárně biologických příčin vzniku neuropsychiatrických onemocnění. Signální cesty zahrnuté v patogenezi deprese jsou primárně aktivované především serotoninem, noradrenalinem, dopaminem, glutamátem a kyselinou γ-aminomáselnou (GABA), tj. jsou spojeny s procesy v adenylátcyklázovém nebo fosfoinozitidovém systému a změnami v koncentracích nitrobuněčných iontů, především kalcia. Vzhledem k přímému i zpětnovazebnému propojení různých signálních cest uvnitř neuronu je pozornost věnována signálním cestám spojeným jak s receptory pro monoaminové neurotransmitery, tak s receptory s interním kalciovým kanálem, receptory pro neurotrofiny a Wnt receptory. Podrobnější popis signálních cest lze nalézt např. na webových stránkách http://www.sabiosciences.com/pathwaycentral.php, nebo v literatuře (Fišar and Hroudová (2010). Vzájemné propojení různých signálních cest je uskutečňováno především proteinkinázami, proteinázami a molekulami regulujícími jejich aktivitu. Reverzibilní fosforylace proteinů je pravděpodobně nejdůležitějším molekulárním mechanismem, kterým mimobuněčné signály realizují biologickou odezvu v cílových neuronech. Významná je hlavně fosforylace iontových kanálů, receptorů, enzymů zahrnutých do syntézy neurotransmiterů, proteinů spojených se synaptickými váčky (synapsinů), cytoskeletálních proteinů, inhibitorů fosfatáz a transkripčních faktorů. V biologické psychiatrii je největší pozornost věnována proteinkinázám typu A (PKA) závislým na cyklickém adenozinmonofosfátu (camp), proteinkinázám typu C (PKC) aktivovaným diacylglycerolem (DAG) a protenkinázám závislým na vápníku a kalmodulinu (PKCaM). Vzhledem k účinkům dlouhodobého podávání antidepresiv a stabilizátorů nálady a vzhledem k předpokládané úloze přežívání, plasticity a metabolismu neuronů v duševních a neurodegenerativních onemocněních jsou intenzivně studovány také proteinkinázy typu B (PKB, Akt), glykogensyntázakináza-3 (GSK-3) a složky 12
regulující programovou buněčnou smrt (apoptózu), především rodina proteinů Bcl-2 a různé mitochondriální faktory. Adenylátcyklázová cesta Mechanismus aktivace adenylátcyklázového systému po aktivaci příslušného receptoru zahrnuje tyto kroky (Obr. 6): 1. ligand se naváže na receptorové vazebné místo; 2. receptor interaguje s G s proteiny a aktivuje je; 3. Gα s podjednotky (a zřejmě také Gα olf ) se vážou k adenylátcykláze (též označována jako adenylylcykláza) a tím ji přímo aktivují; rovněž volné βγ komplexy aktivují určité podtypy adenylátcykláz; 4. aktivovaná adenylátcykláza katalyzuje změnu ATP na camp (reakce vyžaduje Mg 2+ ), dokud nedojde k inaktivaci příslušných podjednotek G proteinu; 5. camp aktivuje proteinkinázy závislé na camp (proteinkinázy A, PKA), které fosforylují prakticky všechny typy neuronových proteinů; 6. působení camp je ukončeno jeho hydrolýzou na 5 -AMP enzymem fosfodiesterázou (reakce vyžaduje Mg 2+ ). Předpokládalo se, že inhibice adenylátcyklázového systému po aktivaci příslušných receptorů probíhá analogicky jako výše popsaná stimulace, s tím rozdílem, že jsou receptorem aktivovány G i proteiny, jejichž Gα i podjednotky přímo inhibují adenylátcyklázu. To se však dosud nepodařilo přesvědčivě prokázat, takže se pozornost věnuje možnosti, že βγ komplexy uvolněné z G i mohou přímo inhibovat adenylátcyklázu nebo mohou ovlivňovat její aktivitu nepřímo přes vazbu volných Gα s podjednotek v membráně. Obr. 6 Adenylátcyklázová signální cesta (podle Fišar and Hroudová 2010) GPCR receptor spřažený s G proteiny, ATP adenozintrifosfát, ADP - adenozindifosfát, camp cyklický adenozinmonofosfát, PDE fosfodiesteráza, AMP - 5 -adenozinmonofosfát, PKA - proteinkináza A, PKC - proteinkináza C, CREB transkripční faktor, BDNF mozkový neurotrofní faktor Guanylátcyklázová cesta Guanylátcykláza (GC, též ozn. jako guanylylcykláza) katalyzuje tvorbu cyklického guanozinmonofosfátu (cgmp) z guanozintrifosfátu (GTP) za přítomnosti Mg 2+. Vyskytuje se jak vázaná v membránách, tak volná v cytosolu. Membránově vázaná forma GC je aktivována peptidovými hormony; rozpustná forma GC je aktivována oxidem dusnatým (NO), který je 13
Zdeněk Fišar produkován např. v odezvě na zvýšené koncentrace nitrobuněčného kalcia. cgmp působí jako regulátor vodivosti iontových kanálů, glykogeneze a apoptózy. Fosfoinozitidová cesta Ve fosfoinozitidovém přenosovém systému je stimulován obrat fosfolipidů obsahujících inozitol v těchto krocích (Obr. 7): 1. ligand se naváže na receptorové vazebné místo; 2. receptor interaguje s G proteiny (většinou G q, někdy také G o nebo G i ) a aktivuje je; 3. podjednotky Gα aktivují fosfolipázu C specifickou pro fosfoinozitidy (PI-PLC; jedná se o fosfodiesterázu), především formu PLC-β; 4. aktivovaná PLC katalyzuje hydrolýzu fosfatidylinozitol-4,5-bifosfátu (PI(4,5)P 2, PIP 2 ) a vznikají druzí poslové inozitoltrifosfát (IP 3 ) a diacylglycerol (DAG); 5. DAG aktivuje proteinkinázy C (PKC), které fosforylují enzymy a jiné buněčné proteiny, čímž je aktivují či inhibují; 6. IP 3 se váže k nitrobuněčným receptorům, což vede k uvolnění Ca 2+ z nitrobuněčných zásob v endoplazmatickém retikulu; 7. Ca 2+ aktivuje proteinkinázy a proteinázy závislé na vápníku a kalmodulinu. Obr. 7 Fosfoinozitidová signální cesta (podle Fišar and Hroudová 2010) GPCR receptor spřažený s G proteiny, PLC - fosfolipáza C specifická pro fosfoinozitidy; PIP 2 - fosfatidylinozitol-4,5-bifosfát; IP 3 - inozitol-1,4,5-trifosfát; DAG - diacylglycerol; PKC - proteinkináza C, CaM kalmodulin, CREB transkripční faktor, BDNF mozkový neurotrofní faktor Neurotrofní cesty Neurotrofní (tyrozinkinázová) cesta je aktivována růstovými faktory; není přímo aktivována neurotransmitery, ale napojuje se na řadu signálních cest, včetně výše uvedených (Obr. 8). Neurotrofiny aktivují různé mitogenem aktivované proteinkinázové (MAPK) signální cesty, podle toho, zda působí na buněčném těle nebo na axonovém zakončení. MAPK jsou rodina kináz, které přenášejí signál z buněčné membrány do jádra v odezvě na řadu podnětů včetně stresu. Existují čtyři hlavní skupiny MAPK: ERK ( extracellular signal-regulated kinases ), p38, JNK ( c-jun NH2-terminal kinases, známé také jako stresem aktivované proteinkinázy) a ERK5 (též ozn. jako BMK1, big-mitogen activated kinase 1 ). Každá tato MAPK cesta obsahuje třístupňovou kinázovou kaskádu tvořenou MAPKKK (kináza kinázy MAPK), MAPKK (kináza MAPK) a MAPK (Wada and Penninger 2004). Aktivované MAPK fosforylují specifické substráty na jejich serinových nebo threoninových zbytcích. Vazba neurotrofinu k trk receptoru vede (Obr. 8) 14
1. k fosforylaci fosfolipázy C (PLC) trk receptorem; PLC potom katalyzuje štěpení fosfatidylinozitol-4,5-bifosfátu (PIP 2 ) na diacylglycerol (DAG) a inozitoltrifosfát (IP 3 ); DAG může aktivovat fosfatidylinozitol-3 kinázu (PI3K) nebo různé proteinkinázy C (PKC); IP 3 uvolňuje kalcium z nitrobuněčných zásob a to aktivuje na něm závislé proteinkinázy (PKCaM); 2. k aktivaci molekuly Ras, což vede k aktivaci dvou alternativních cest mitogenem aktivovaných kináz (MAPK), kdy jsou stimulovány kinázy regulované mimobuněčným signálem ERK1,2 nebo ERK5; 3. ke stimulaci PI3K heterodimerů, které aktivují kinázu PDPK1 a ta aktivuje proteinkinázu Akt; Akt např. stimuluje transkripční faktory, inhibuje proapototický faktor BAD a glykogensyntázukinázu-3 (GSK-3). Obr. 8 Neurotrofní signální cesty (podle Fišar and Hroudová 2010) Wnt cesta Wnt signální cesta aktivovaná růstovými faktory Wnt zahrnuje procesy mající úlohu v embryogenezi, nádorových onemocněních, ale i v normálních fyziologických procesech (Lie et al. 2005, Clevers 2006, Fuerer et al. 2008). Wnt signály jsou přenášeny přinejmenším třemi nitrobuněčnými cestami, nejlépe je prostudována tzv. kanonická Wnt cesta, která primárně reguluje buněčný osud během vývoje. V poslední době byla tato cesta spojena s terapeutickými účinky lithia při léčbě poruch nálady, pravděpodobně přes aktivaci transkripčních faktorů β-kateninem (Obr. 9). Je studována úloha Wnt cesty také ve vzniku Alzheimerovy nemoci, neboť aktivací Wnt receptoru (WntR) je inhibován enzym GSK-3β, který aktivuje apoptózu a fosforylaci tau proteinu. 15
Zdeněk Fišar Obr. 9 Kanonická Wnt signální cesta (podle Fišar and Hroudová 2010) 1.1.6. Membránové přenašeče pro neurotransmitery Pro funkci chemické synapse mají významnou úlohu membránové přenašeče (transportní proteiny, transportéry, carriers ), které zajišťují vychytávání neurotransmiterů ze synaptické štěrbiny a jejich přenos do presynaptického zakončení (transportní proteiny závislé na Na + a Cl - ) nebo do gliových buněk (transportní proteiny závislé na Na + ); další typ přenašečů (závislých na ph) umožňuje ukládání neurotransmiterů do zásobních váčků. Transportní proteiny závislé na Na + a Cl - slouží k přenosu serotoninu (5-hydroxytryptamin, 5-HT), noradrenalinu, dopaminu, γ-aminomáselné kyseliny (GABA), prolinu, glycinu, taurinu, betainu a kreatinu; přenašeče závislé na Na + transportují glutamát a aspartát (Obr. 10). Obr. 10 Membránové přenašeče pro neurotransmitery (Fišar a kol. 2009) 16
Předpokládá se, že zpětné vychytávání (reuptake) neurotransmiterů pomocí přenašečů má 3 základní důsledky: 1. koncentrace neurotransmiteru ve štěrbině je snižována rychleji, než při pouhé difúzi, což umožňuje lepší časové rozlišení následných dějů; 2. účinky neurotransmiteru jsou omezeny na menší plochu, což dovoluje funkci anatomicky blízkých chemicky identických ale funkčně odlišných synapsí; 3. neurotransmiter může být po přenosu do presynaptického zakončení znovu použit. Předmětem studia jsou při duševních poruchách především transportní proteiny pro noradrenalin (NET), dopamin (DAT) a serotonin (SERT, 5-HTT) které se oproti ostatním přenašečům vyznačují vysokoafinní vazbou kokainu (inhibice reuptake dopaminu), amfetaminů, metylendioxymetamfetaminu (extáze), metamfetaminu (indukce obráceného transportu serotoninovým a dopaminovým přenašečem) a fencyklidinu (mimo jiné inhibuje uptake 5-HT). NET, SERT nebo oba tyto přenašeče jsou inhibovány řadou různých antidepresiv (viz kap. 1.3). Inhibice zpětného přenosu (reuptake) neurotransmiteru vede ke zvýšení jeho mimobuněčné koncentrace, takže receptory mohou být aktivovány déle a na větší vzdálenost od synapse. Citlivost membránových přenašečů na ionty a napětí může určovat rychlost transmembránového přenosu (uptake) neurotransmiterů. V případě SERT se Na +, Cl - a protonovaný 5-HT + vážou k přenašeči a tvoří komplex, který poté podléhá konformační změně, při níž dochází k přenosu přes membránu a uvolnění neurotransmiteru a iontů do cytoplazmy (Obr. 11). Poté se nitrobuněčné K + váže k SERT a podporuje jeho reorientaci tak, aby byl připraven na další transportní cyklus. Nitrobuněčné K + tedy urychluje vtok 5-HT. Vazba antagonistů k SERT je rovněž závislá na mimobuněčném Na +, např. pro vazbu imipraminu vyžaduje SERT přítomnost 2 iontů Na + na 1 molekulu imipraminu. Preferovaný stav SERT v živých buňkách je homo-oligomerní forma ze 4 molekul. Obr. 11 Funkce membránového přenašeče pro serotonin. 1.1.7. Membránové lipidy a přenos signálu přes chemickou synapsi Klasické schéma přenosu signálu přes chemickou synapsi zahrnuje tyto kroky: 1. metabolismus, syntéza a ukládání neurotransmiteru v presynaptickém zakončení; 17
Zdeněk Fišar 2. exocytóza neurotransmiteru (v odezvě na vtok Ca 2+ po depolarizaci presynaptické membrány); 3. difúze neurotransmiteru v synaptické štěrbině, jeho interakce s receptorem; 4. aktivace receptoru vedoucí k otevření iontového kanálu, nebo k aktivaci G proteinu, vnitřní guanylátcyklázy nebo vnitřní tyrozinkinázy; 5. metabolismus nebo zpětný přenos neurotransmiteru. Nověji je přenos signálu přirovnáván k 3-dimenzionální síti, v níž se podráždění v jednom bodě přenese do všech dalších a v níž existuje řada kladných i záporných zpětných vazeb. Receptory s tyrozinkinázovou aktivitou se na synaptickém přenosu nepodílejí přímo; jejich agonisty jsou růstové faktory, cytokiny a některé hormony. Nové metody a zdokonalující se přístroje umožňují získávání nových poznatků o převodu (transdukci) signálu z úrovně elektrické (depolarizace membrány) na chemickou (neurotransmitery) a zpět na elektrickou (membránový potenciál) nebo nitrobuněčnou (fosforylace proteinů a související procesy). Tyto nové poznatky lze využít při hledání molekulárních mechanismů vzniku duševních poruch a účinků psychofarmak. Pozornost je věnována nejen buněčným proteinům (neutransmiterovým receptorům a přenašečům, iontovým kanálům, enzymům, transkripčním faktorům), ale i úloze membránových lipidů a cholesterolu. Je známo, že značná část molekul podílejících se na přenosu signálu je lokalizována v buněčných membránách. Jedná se nejen o receptory, iontové kanály a transportní proteiny, ale i o G proteiny, adenylátcyklázy, fosfolipázy a další enzymy. Na funkci těchto membránových proteinů mají značný vliv vlastnosti lipidové dvojvrstvy tvořené především fosfolipidy, glykolipidy a steroly. Integrální proteiny jsou v membránách obaleny vrstvou tzv. anulárních lipidů, na jejichž vazbě k proteinu se podílejí jednak hydrofobní a van der Waalsovy síly uvnitř membrány, jednak Coulombovy interakce a interakce ion-indukovaný dipól mezi nabitými a polárními skupinami v povrchové části membrány. Obecně je vliv lipidů na membránové proteiny dán jednak specifickými interakcemi lipidprotein podmiňujícími aktivitu řady enzymů, jednak nespecifickým ovlivněním dostupnosti vazebných míst (ovlivněním vertikálního pohybu proteinů) nebo vzájemných interakcí jednotlivých podjednotek vícesložkových systémů (změnami pohyblivosti těchto složek v rovině membrány) (Obr. 12). Byla popsána úloha fyzikálního stavu membrány (charakterizovaná fluiditou) ve funkci řady membránových receptorů, enzymů a iontových kanálů. Maximální receptorová odezva závisí nejen na hustotě vazebných míst, ale i na jejich přístupnosti pro agonisty rozpuštěné ve vodné fázi a na rychlosti, s níž může docházet ke vzájemným interakcím mezi jednotlivými membránovými složkami podílejícími se na přenosu signálu. 18
Obr. 12 Vliv lipidové dvojné vrstvy na funkci membránových proteinů (podle Shinitzky 1984) Dostupnost i pohyblivost membránových integrálních proteinů závisí jak na fluiditě lipidové dvojné vrstvy, tak na existenci nehomogenit v jejím složení (mikrodomény) a stavbě (nedvojvrstevné struktury). Např. část membránových přenašečů pro noradrenalin se vyskytuje v lipidových raftech (Matthies et al. 2009). Chronické podávání antidepresiv ovlivňuje přenos nervového signálu také zabráněním kumulace Gα s v lipidových raftech bohatých na cholesterol a spojených s cytoskeletem (Donati and Rasenick 2005). Vliv cholesterolu, lipidového složení a dynamických vlastností (mikroviskozity) membrán byl popsán jak pro vlastnosti neurotransmiterových receptorů (acetylcholinových, serotoninových, α 1 - a β-adrenergních, peptidových, GABA a dalších), tak pro aktivitu řady membránových enzymů a přenašečů (různých ATPáz, proteinkináz C, fosfolipáz C, membránového přenašeče pro serotonin) (Lee 2003, Scanlon 2001, Pfrieger 2003) podílejících se na přenosu nervového signálu. V aktivaci iontových kanálů a různých enzymových a receptorových systémů hrají významnou roli především kyselé fosfolipidy (Tsakiris a Deliconstantinos 1984, Rando 1988, Bernik et al. 1991, Sandermann a Duncan 1991, Gelbmann and Müller 1992, Cohen a Müller 1992, Lee 2009). Rovněž metylace fosfolipidů v synaptických membránách nebo podávání fosfolipidů in vivo může zřejmě ovlivnit adaptaci receptorů na chronické podávání antidepresiv (Sulser et al. 1983, Racagni and Brunello 1984). Tabulka 1 Membránové lipidy a aktivita membránových proteinů (Fišar a kol. 2009) membránový protein lipid nebo parametr modulují aktivitu proteinu Na + K + -ATPáza fosfatidylserin β-hydroxybutyrátdehydrogenáza fosfatidylserin proteinkináza C diacylglycerol, fosfatidylserin fosfolipáza C fosfatidylinozitol-4,5-bifosfát serotoninový přenašeč (SERT) cholesterol tyrozinkináza sfingomyelin, fosfatidylcholin receptory, iontové kanály fluidita iontové kanály kyselé fosfolipidy Membránové fosfolipidy se podílejí na přenosu nervového signálu nejen jako strukturní základ membrány, ale i jako substráty fosfolipáz C, D, A 2, tj. jako zdroje některých neurotransmiterů (endokanabinoidů) a druhých poslů - diacylglycerolu (DAG), 19
Zdeněk Fišar inozitoltrisfosfátu (IP 3, I(1,4,5)P 3 ) a volných mastných kyselin (především kyseliny arachidonové). Předpokládá se např., že poruchy v interakcích lipid-protein způsobené nadměrnou aktivitou fosfolipázy A 2 mohou vést ke vzniku afektivních poruch. 20