Kvasinky důležité mikroorganismy i kontaminanty mléka a mléčných výrobků

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Kvasinky důležité mikroorganismy i kontaminanty mléka a mléčných výrobků Diplomová práce Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Vypracovala: Bc. Romana Dobiášová Brno 2013

ZADÁNÍ DIPLOMOVÉ PRÁCE

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Kvasinky důležité mikroorganismy i kontaminanty mléka a mléčných výrobků vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. Dne: 30. dubna 2013 Podpis diplomanta:.

PODĚKOVÁNÍ Děkuji Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení, cenné rady a připomínky při zpracování mé diplomové práce i při mikrobiologických rozborech. Mé poděkování patří také celému Ústavu agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin. Ráda bych také poděkovala rodičům za psychickou a finanční podporu během celého studia.

ABSTRAKT Dobiášová, R. Kvasinky důležité mikroorganismy i kontaminanty mléka a mléčných výrobků. Diplomová práce. Brno, 2013. Diplomová práce v literární rešerši charakterizuje kvasinky, jejich taxonomii, vlastnosti, stanoviště, rozmnožování a v neposlední řadě jejich metabolismus. Práce se dále zabývá popisem využití kvasinek v mlékařství, charakterizuje vybrané rody kvasinek využívaných v mlékařství, kvasinkové kultury, kefírovou kulturu, výrobu kefíru, kumysu a sýrů, ve kterých se kvasinky uplatňují při jejich zrání. Práce popisuje vady mléka a mléčných výrobků, které jsou způsobeny kvasinkami. Poslední kapitola literární rešerše je věnována boji proti nežádoucím mikroorganismům. V praktické části byly u vybraných kefírových mlék pocházejících z obchodní sítě stanovovány kultivačními metodami následující skupiny mikroorganismů: celkový počet mikroorganismů, bakterie mléčného kvašení, kvasinky a plísně, a to v průběhu data použitelnosti a sedmý den po uplynutí data použitelnosti. Stanovené počty mikroorganismů byly porovnány s Vyhláškou č. 77/2003 Sb. v aktuálním znění. Dále byly ve vybraných kozích a ovčích sýrech zakoupených v obchodní síti stanovovány kultivačními metodami kvasinky a plísně. Stanovené počty mikroorganismů byly porovnány s ČSN 56 9609. Klíčová slova: kefírové mléko, sýry, bakterie mléčného kvašení, plísně.

ABSTRACT Dobiášová, R. Yeasts important microorganisms and contaminants in milk and milk products. Diploma thesis. Brno, 2013. In the literature review the diploma thesis characterizes yeasts, their taxonomy, properties, habitat, reproduction and ultimately their metabolism. The thesis further deals with the description of yeast application in dairying, characterizes selected yeast families used in dairying, the yeast culture, kefir culture, the production of kefir, kumiss and cheese where yeasts are involved in the ripening process. The work describes defects in milk and milk products that are caused by yeasts. The last chapter of the literature review is dedicated to the fight against undesirable microorganisms. In the practical part the following groups of microorganisms were determined using cultivation methods for selected kinds of kefir milk from commercial markets: the total number of microorganisms, lactic acid bacteria, yeasts and moulds. The research was conducted during the consumption period and the seventh day after the expiration date. The determined number of microorganisms was compared to the Decree No. 77/2003 Coll. in its current version. Furthermore, cultivation methods were used to determine yeasts and moulds in selected kinds of goat and sheep cheese purchased in the commercial market. The obtained numbers were compared to ČSN 56 9609. Key words: kefir milk, cheese, lactic acid bacteria, moulds.

OBSAH 1 ÚVOD... 10 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 11 2.1 Kvasinky... 11 2.1.1 Taxonomie kvasinek... 11 2.1.2 Vlastnosti kvasinek... 12 2.1.3 Stanoviště kvasinek... 12 2.1.3.1 Půda... 12 2.1.3.2 Voda... 13 2.1.3.3 Ovzduší... 13 2.1.3.4 Rostliny... 14 2.1.3.5 Živočichové... 14 2.1.3.6 Biofilmy... 14 2.1.4 Rozmnožování kvasinek... 14 2.2 Metabolismus kvasinek... 15 2.2.1 Zdroje uhlíku a energie... 15 2.2.2 Dýchací řetězec a oxidační fosforylace... 16 2.2.3 Glykolýza... 16 2.2.4 Fermentace... 17 2.2.5 Metabolické regulace... 17 2.2.6 Citrátový cyklus... 18 2.2.7 Zdroje dusíku... 18 2.3 Kvasinky v mlékařství... 18 2.3.1 Vybrané rody kvasinek využívané v mlékařství... 19 2.3.1.1 Rod Candida... 19 2.3.1.2 Rod Debaryomyces... 20 2.3.1.3 Rod Geotrichum... 20 2.3.1.4 Rod Kluyveromyces... 21 2.3.1.5 Rod Rhodotorula... 21 2.3.1.6 Rod Saccharomyces... 22 2.3.1.7 Rod Yarrowia... 22 2.3.2 Kvasinkové kultury... 23 2.3.3 Kefírová kultura... 23 2.3.4 Fermentované výrobky s bakteriální a kvasinkovou kulturou... 25 2.3.4.1 Kefír... 25

2.3.4.2 Kumys... 26 2.3.5 Sýry... 26 2.3.5.1 Měkké sýry zrající pod mazem... 26 2.3.5.2 Olomoucké tvarůžky... 28 2.3.5.3 Plísňové sýry s plísní na povrchu... 28 2.3.5.4 Plísňové sýry s plísní v těstě... 29 2.3.5.5 Tvarohovité sýry zrající bryndza... 30 2.4 Vady mléka a mléčných výrobků způsobené kvasinkami... 31 2.4.1 Vady syrového mléka... 32 2.4.2 Vady másla... 32 2.4.3 Vady zahuštěných mléčných výrobků... 32 2.4.4 Vady mražených mléčných výrobků... 33 2.4.5 Vady kysaných mléčných výrobků... 33 2.4.6 Vady sýrů... 34 2.5 Boj proti nežádoucím mikroorganismům... 36 2.5.1 Čištění... 37 2.5.2 Dezinfekce... 39 3 CÍL PRÁCE... 43 4 MATERIÁL A METODIKA... 44 4.1 Charakteristika materiálu... 44 4.2 Příprava laboratorních pomůcek... 51 4.3 Složení a příprava živných médií... 51 4.4 Mikrobiologická analýza... 53 4.4.1 Kefírová mléka... 53 4.4.2 Sýry... 53 4.5 Podmínky kultivace... 54 4.5.1 Kefírová mléka... 54 4.5.2 Sýry... 54 4.6 Vyhodnocení výsledků... 55

5 VÝSLEDKY A DISKUZE... 56 5.1 Kefírová mléka... 56 5.2 Kozí sýry... 63 5.3 Ovčí sýry... 68 6 ZÁVĚR... 73 7 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY... 75 8 SEZNAM TABULEK, OBRÁZKŮ A GRAFŮ... 83 8.1 Seznam tabulek... 83 8.2 Seznam obrázků... 84 8.3 Seznam grafů... 84

1 ÚVOD Kvasinky jsou eukaryotní mikroorganismy, které jsou využívané již tisíce let pro výrobu piva, vína a chleba. Doklady o tom, že lidé vyráběli nápoje podobné dnešnímu pivu a vínu pocházejí ze sumerské a egyptské keramiky nebo mají písemnou podobu v piktografických záznamech pocházejících z Babylonu. V současné době se kromě již zmiňovaných potravin využívají kvasinkové kultury k výrobě lihu, pekařského droždí, krmné biomasy, při přípravě některých mléčných výrobků, k získávání ergosterolu jako prekurzoru vitaminu D. Slouží i jako zdroj komplexu vitaminů skupiny B, jsou využívány jako producenti některých enzymů. Kvasinky Saccharomyces cerevisiae a Schizosaccharomyces pombe se řadí mezi nejdůležitější modelové eukaryotní mikroorganismy, které napomáhají k rozvoji znalostí v oblasti biologie a biomedicíny. Některé kvasinky mohou být příčinnou kažení potravin nebo mohou způsobovat onemocnění lidí. Nicméně kvasinek, které mohou být patogenní pro člověka, je pouze několik. V mlékařství jsou kvasinky díky svým vlastnostem důležitými mikroorganismy, ale i kontaminanty. Uplatňují se při výrobě některých fermentovaných výrobků, jako jsou kefír, kefírové mléko, kumys a při zrání některých sýrů. U sýrů kvasinky rozkládají kyselinu mléčnou, deaminují aminokyseliny a uvolňují amoniak, čímž snižují ph a vytváří tak vhodné podmínky pro růst dalších bakterií zúčastňujících se zrání. Dále produkují růstové faktory pro bakterie, podílejí se i na tvorbě chuti a aroma sýrů. Jedná se především o kvasinky z rodů Candida, Debaryomyces, Geotrichum, Kluyveromyces, Rhodotorula, Saccharomyces, Yarrowia. Naproti tomu mohou způsobovat řadu vad mléka a mléčných výrobků, jako je tvorba plynu, změny konzistence, barvy, vůně a chuti. Využití kvasinek je velmi široké a patří mezi nejdůležitější mikroorganismy využívané člověkem. 10

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Kvasinky Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotní mikroorganismy, náležící mezi houby (Fungi). Český název dostaly pro schopnost většiny druhů zkvašovat monosacharidy a některé disacharidy, případně trisacharidy na ethanol a oxid uhličitý (Šilhánková, 2002). Dostupnost kyslíku je nezbytná pro množení všech kvasinek bez výjimky, není známá žádná obligátně anaerobní kvasinka, většina kvasinek patří mezi fakultativně anaerobní (Janderová, Bendová, 1999). Kvasinky jsou pravděpodobně nejstarší domestikované organismy, které byly používané k výrobě piva již asi 6000 př. n. l. v Sumeru a Babylonu. Současně byly kmeny Saccharomyces cerevisiae využívány při výrobě vína v Gruzii a pro kynutí těsta ve starém Egyptě (Feldman, 2010). Poprvé byly kvasinky spatřeny až A. van Leeuwenhoekem kolem roku 1680 jako malé kuličky v pivě. Kvasné procesy ve víně a pivě byly předmětem studia L. Pasteura, jehož práce na toto téma byly publikovány v letech 1866 a 1876 a který dokázal aktivní účast mikroorganismů na kvasném procesu. Nejznámější kvasinka však dostala svoje jméno až v roce 1837, kdy ji Theodor Schwann označil jako Zuckerpilz, cukernou houbu, od čehož je odvozeno i latinské pojmenování rodu Saccharomyces (z řeckého sacharos = cukr, mykes = houba). První čisté kultury Saccharomyces cerevisiae byly izolovány právě z piva E. Ch. Hansenem a z vína Műller-Thurgauem v letech 1883 1890 (Janderová, Bendová, 1999). 2.1.1 Taxonomie kvasinek Kvasinky botanicky náleží mezi houby (Fungi, Mycota), které tvoří samostatný oddíl mezi Plantae na jedné straně a Animalia na straně druhé (Cempríková et al., 1997). V systému hub (Fungi) patří kvasinky mezi Eumycota vlastní houby, a to do dvou velkých pododdělení: Ascomycotina vřeckovýtrusné houby a Basidiomycotina stopkovýtrusné houby. Anamorfní formy, tj. kvasinky, u nichž se neprokázalo sexuální rozmnožování, se zařazují do pomocného pododdělení Deuteromycotina. V rámci systému vřeckovýtrusných hub je velká skupina kvasinek zařazována do Endomycetes (Hemiascomycetes) (Janderová, Bendová, 1999). 11

Mezi rody tvořící askospory (Ascomycotina) se řadí podle Šilhánkové (2002) např. rod Saccharomyces, rod Kluyveromyces, rod Debaryomyces, rod Saccharomycopsis. K bazidiomycetním kvasinkám (Basidiomycotina) se řadí např. rod Filobasidium a rod Rhodosporidium. Mezi rody u nichž není známa tvorba pohlavních spor (Deuteromycotina) se řadí např. rod Geotrichum, rod Candida, rod Rhodotorula. 2.1.2 Vlastnosti kvasinek Kvasinky mohou růst v širokém rozmezí ph a až do 18 % ethanolu. Mnohé rostou v přítomnosti 55 60 % sacharózy (Jay et al., 2005). Teploty, při nichž mohou kvasinky růst, jsou v rozmezí asi -2 C až zhruba 48 C. Psychrofilní kvasinky, pomnožující se při teplotách -2 C až 20 C, se nemnoží při teplotách vyšších. Byly izolovány z vody či půdy v Antarktidě. Naprostá většina kvasinek patří mezi mezofilní, růst a množení se uskutečňuje při teplotách 0 48 C, v laboratorních podmínkách se běžně používají kultivační teploty 25 30 C. Termofilní kvasinky se nemnoží při teplotách nižších než 20 C. Obvykle se jedná o potenciální patogeny pro člověka či teplokrevné živočichy (Candida, Cyniclomyces). Maximální teplota, při které některé kvasinky přežívají, se pohybuje kolem 57 59 C (Janderová, Bendová, 1999). Kvasinky vyžadují pro svůj růst vzdušný kyslík. Mají schopnost přeměnit svůj metabolismus za anaerobních podmínek na fermentační a při silně omezeném růstu buněčné hmoty produkovat ethanol a CO 2 (Gőrner, Valík, 2004). V nárocích na obsah vody v prostředí nejsou mezi kvasinkami příliš výrazné rozdíly. Pouze málo kvasinek patří mezi xerotolerantní, tzn. ty, které tolerují relativně nižší vodní aktivitu prostředí a rostou i za zvýšeného osmotického tlaku prostředí. Nejvýznamnějšími zástupci této skupiny jsou kvasinky rodu Zygosaccharomyces, které se pomnožují hlavně v potravinách s vysokým obsahem cukru, maximální vodní aktivita, kterou tolerují je až a w = 0,62 0,67. Mezi další xerotolerantní kvasinky se řadí např. Debaryomyces hansenii, Hansenula anomala, Schizosaccharomyces pombe (Janderová, Bendová, 1999). 2.1.3 Stanoviště kvasinek 2.1.3.1 Půda Kvasinky se běžně vyskytují jak v orné půdě, tak i v půdě neobdělávané, v zeměpisných oblastech od tropů po arktické oblasti. Jejich populace 12

a druhová diverzita je v půdě nižší než u bakterií a plísní. Půda je pro kvasinky důležitým stanovištěm pro přežití nepříznivých podmínek. Toto přírodní stanoviště může být zdrojem šíření kvasinek do zařízení na zpracování potravin, a tudíž rozšiřování do potravin (Deák, 2008). Půda může být spíše rezervoárem pro dlouhodobé přežití mnoha kvasinek, než stanovištěm pro jejich růst. Počty kvasinek se v obdělávaných půdách pohybují kolem 10 000 kvasinkových buněk na gram půdy, kvasinky se vyskytují hlavně v horních aerobních vrstvách půdy (10 15 cm). Rody kvasinek izolované výhradně z půdy jsou např. Lipomyces, Schwanniomyces (Walker, 2011). 2.1.3.2 Voda Kvasinky jsou běžnou součástí sladkých i mořských vod, zahrnujících řeky, jezera, rybníky, ústí řek, oceánů a hluboká moře. Počet a hustota vyskytujících se druhů závisí na druhu a čistotě vody. Nízké populace kvasinek, asi 10 buněk/l, jsou typické pro otevřené vody oceánů, čistá jezera obvykle obsahují pod 100 buněk/l. Voda používaná pro rekreační účely obvykle obsahuje 500 1000 buněk/l. Běžné druhy vyskytující se v sladké vodě jsou Aureobasidium pullulans, Cryptococcus albidus, Cryptococcus laurentii, Debaryomyces hansenii, Rhodothorula mucilaginosa. Druhy, často izolované z mořské vody jsou Metschnikowia bicuspidata, Kluyveromyces nonfermentans a červené kvasinky (Deák, 2008). V silně znečištěných odpadních vodách lze zjistit až 10 5 2.10 8 buněk/l, v domovních odpadních vodách se vyskytují Saccharomyces exiguus, Hansenula anomala, Hanseniaspora uvarum, Kloeckera apiculata, Candida albicans jako indikátor fekálního znečištění (Janderová, Bendová, 1999). 2.1.3.3 Ovzduší Z povrchových vrstev půdy jsou kvasinky Cryptococcus, Rhodotorula, Sporobolomyces a Debaryomyces ssp. rozptylovány prouděním vzduchu. Několik životaschopných kvasinek lze očekávat v m 3 vzduchu (Walker, 2011). Vnitřní ovzduší, jehož součástí je prach, může obsahovat více než 10 4 buněk/g s dominantními druhy Cryptococcus albidus, Cryptococcus diffluens, Rhodothorula mucilaginosa a Debaryomyces hansenii. Kvasinky vyskytující se v prachu mohou působit jako mykogenní alergeny (Deák, 2008). 13

2.1.3.4 Rostliny Kvasinky se běžně vyskytují na povrchu nadzemních částí rostlin, v trávě, na stromech, listech, květech a ovoci (Deák, 2008). Během sezóny dochází ke značným změnám v kvantitativním zastoupení (maximum může dosáhnout hodnot až 10 6 10 7 buněk/g čerstvé váhy) i v proporcích zastoupení jednotlivých druhů (např. Rhodotorula, Sporobolomyces z 6% zastoupení v zimě na 92% zastoupení na podzim) kvasinek na listech (Janderová, Bendová, 1999). 2.1.3.5 Živočichové Několik nepatogenních kvasinek je spojováno s trávicím ústrojím a kůží teplokrevných živočichů. Některé kvasinky (např. Candida albicans) jsou oportunisticky patogenní pro lidi a zvířata. Mnoho kvasinek je spojováno s hmyzem, který je důležitým vektorem v rámci přirozeného rozšiřování kvasinek (Walker, 2011). 2.1.3.6 Biofilmy Ve většině přírodních stanovišť mikroorganismy neexistují jako jednotlivé volně žijící buňky, ale jsou vzájemně spojeny nebo připojeny k povrchu. Biofilmy jsou většinou tvořeny směsí bakteriálních a kvasinkových buněk a plísní. Komplexní struktury biofilmů se nachází na půdních částicích, na povrchu listů, tyto biofilmy tvoří běžné formy života mikroorganismů. Biofilmy vytvořené na sliznici, která pokrývá tělní dutiny, jsou hlavními zdroji infekce. Biofilmy se běžně vytváří na místech a v prostorách sloužících k zpracování potravin a jsou důvody kontaminace potravin (Deák, 2008). 2.1.4 Rozmnožování kvasinek Kvasinky se rozmnožují nepohlavně (vegetativně) pučením a pohlavně tvorbou askospor. Zástupci rodu Schizosaccharomyces se rozmnožují dělením. Mnohé kvasinky tvoří septované mycelium nebo pseudomycelium. Při vegetativním množení pučením mohou vzniklé buňky zůstat s mateřskou buňkou spojené a vytvořit pseudomycelium nebo se mohou od mateřské buňky oddělit (Gőrner, Valík, 2004). 14

Výsledkem pohlavního rozmnožování jsou pohlavní spory. Většina kvasinek tvoří jako pohlavní spory askospory, což jsou endospory, umístěné ve vřecku neboli asku. Tyto kvasinky řadíme mezi Ascomycotina. Některé rody kvasinek však tvoří pohlavní exospory, tj. spory umístěné vně sporotvorných buněk. Tyto rody řadíme mezi Basidiomycotina. Pohlavní rozmnožování je obecně charakterizováno spájením dvou haploidních buněk čili konjugací (nebo kopulací) a spájením jejich jader neboli karyogamií za vzniku diploidního jádra. Pak se diploidní jádro dělí meiózou, tj. redukčním dělením, ve čtyři haploidní jádra, která jsou buď základem pohlavních spor, nebo se dělí další mitózou a pak teprve vznikají spory. V životním cyklu kvasinek se tedy pravidelně střídá haploidní a diploidní fáze buněk (Šilhánková, 2002). 2.2 Metabolismus kvasinek V mikroorganismech, podobně jako v ostatních živých organismech, probíhá neustálá přeměna látek, která zajišťuje buňkám dostatečné množství energie a stavebního materiálu pro veškeré životní projevy. Intenzita této přeměny látek neboli metabolismus je u mikroorganismů silně ovlivněna vnějšími podmínkami (Šilhánková, 2002). Metabolismus má dvě nerozlučně spojené stránky látkovou a energetickou. Plní základní úkoly zajištění energie a stavebního materiálu a výrobu složek organismů. Tyto úkoly plní v organismu dva typy procesů: a) Procesy přijímající energii a stavební materiál a upravující je pro potřeby organismu. Jde vesměs o procesy rozkladné a označujeme je též jako děje katabolické. b) Biosyntézy (anabolismus, asimilace) vedoucí ke vzniku nových, chemicky složitějších látek, které tvoří součásti organismu. Jednoduchým látkám, které jsou stavebním materiálem při biosyntézách, říkáme prekurzory (Vodrážka, 1996). 2.2.1 Zdroje uhlíku a energie Jako chemoorganotrofní organismy, kvasinky získávají zdroje uhlíku a energie ve formě organických sloučenin. Sacharidy jsou široce využívány kvasinkami. Saccharomyces cerevisiae může využívat jako zdroj energie glukózu, fruktózu, mannózu, galaktózu, sacharózu a maltózu (Walker, 2011). Některé kvasinky produkují extracelulární enzymy, které jim umožňují hydrolyzovat také polysacharidy, jako 15

škrob, xylany nebo celulózu. Jako zdroj uhlíku mohou ovšem sloužit i další látky glycerol, laktát, ethanol, methanol, alkany apod. Zpracování jednotlivých zdrojů uhlíku a energie probíhá v kvasinkových buňkách známými metabolickými dráhami, u většiny kvasinek za aerobních podmínek glykolýzou a navazujícím Krebsovým cyklem, u převážně fermentujících kvasinek fermentační cestou (Janderová, Bendová, 1999). 2.2.2 Dýchací řetězec a oxidační fosforylace Většina heterotrofních organismů získává hlavní podíl (asi 90 %) energie, uložené ve struktuře molekul živin, během procesu zvaného respirace neboli dýchání. Metabolický děj respirace se skládá z vlastního transportu elektronů, označovaného jako respirační řetězec, a ze spřaženého procesu oxidační fosforylace, tj. výroby adenosintrifosfátu (ATP). Aerobní respirace spočívá v transportu elektronů z organických substrátů, jako jsou glukóza nebo mastné kyseliny, na molekulový kyslík, jako terminální akceptor za vzniku vody. Aerobní dýchací řetězec je lokalizován v buněčných organelách mitochondriích (Zehnálek, 1999). 2.2.3 Glykolýza Společný mechanismus pro metabolismus sacharidů kvasinkami je přeměna glukózy na pyruvát Embden-Meyerhof-Parnasovou dráhou, též nazývanou jako glykolýza (Deák, 2008). Glykolýza je hlavní cestou odbourávání glukózy. Všechny reakce probíhají v cytoplazmě a enzymy, které je katalyzují, nejsou vázány na buněčné struktury (Zehnálek, 1999). K hlavním reakcím glykolýzy patří postupná fosforylace hexóz až ve fruktóza-1,6- bisfosfát, jeho štěpení ve dva triózafosfáty a jejich oxidace v 1,3-bisfosfoglycerát. Tato oxidace, při níž se redukuje koenzym nikotinamidadenindinukleotid (NAD + ) v NADH + H +, je u některých mikroorganismů jediným zdrojem energie glykolýzy. Část takto získané energie se ihned uloží v ATP, další část se uvolní až po dalších reakčních stupních, tj. při přeměně makroergické sloučeniny fosfoenolpyruvátu v pyruvát za vzniku dalšího ATP. Protože při přeměně jednoho triózafosfátu vzniknou 2 ATP a tedy z celé hexózy 4 ATP a protože 2 ATP se spotřebují na fosforylaci hexóz ve 16

fruktóza-1,6-bisfosfát na počátku, je čistý zisk při odbourání jedné molekuly hexózy pouze 2 ATP (Šilhánková, 2002). 2.2.4 Fermentace Kvašení je pochod, který se při přeměně cukru projevuje vývojem oxidu uhličitého. Protože kvasinky nejsou úplně aerobní nebo anaerobní, ale jsou fakultativně anaerobní, probíhají u nich paralelně dýchací procesy s kvasnými. To se projevuje spotřebou kyslíku a vývojem oxidu uhličitého (Kocková Kratochvílová, 1957). Na rozdíl od respirace dochází při fermentaci k neúplnému rozkladu substrátu, a proto i množství uvolněné energie je nižší. Nejjednodušší přeměna pyruvátu na vhodnější akceptor vodíku je dekarboxylace na acetaldehyd, který se snadno redukuje na ethanol. Kvasinky obsahují enzym pyruvátdekarboxylázu, která dekarboxyluje pyruvát. Redukci dekarboxylací vzniklého acetaldehydu pak provádí alkoholdehydrogenáza (Zehnálek, 1999). Tím vznikají z jedné molekuly hexózy dvě molekuly ethanolu a dvě molekuly oxidu uhličitého za současného čistého zisku energie dvou molekul ATP (Šilhánková, 2002). 2.2.5 Metabolické regulace O tom do jaké míry kvasinky respirují či fermentují, rozhoduje řada faktorů. Je obecně známo, že za aerobních podmínek je využití cukru respirací energeticky nesrovnatelně výhodnější než fermentace (Janderová, Bendová, 1999). Pojem Pasteurův efekt souvisí s klesající účinností fermentace v přítomnosti kyslíku (Deák, 2008). Při alkoholovém kvašení kvasinkami nastává za dostatečného přístupu molekulárního kyslíku potlačení anaerobního pochodu. Kvasinky za aerobních podmínek nezkvašují cukr na ethanol a CO 2, vzniká CO 2, přičemž spotřeba substrátu klesne (Hampl, 1968). Pasteurův efekt se výrazně projevuje u kvasinek, u nichž převládá respirace (např. Candida) (Janderová, Bendová, 1999). Potlačení dýchání, v přítomnosti vysoké hladiny glukózy se označuje jako Crabtreeho efekt. Crabtreeho pozitivní kvasinky jako Saccharomyces cerevisiae jsou citlivé na zvýšenou koncentraci glukózy a při jejím nadbytku vyrábí ethanol za aerobních podmínek. Crabtreeho negativní kvasinky (např. C. utilis) nemají potlačený oxidativní metabolismus při zvýšené koncentraci glukózy (Deák, 2008). H. G. Crabtree poprvé popsal skutečnost, že přidání glukózy k buňkám respiračně využívajícím daný 17

substrát mělo za následek inhibici aerobní respirace a stimulaci glykolýzy. Pro kvasinkovou buňku je výhodnější využít nejprve cukru obsaženého v dostatečném množství v kultivačním médiu anaerobním mechanismem i za cenu toho, že se tím získá podstatně méně energie (Klaban, 1999). Regulace metabolismu sacharidů je zvláštní u kvasinek Dekkera a Brettanomyces. Jejich fermentace je inhibována anaerobiózou a fermentace glukózy na ethanol a octovou kyselinu probíhá pouze za aerobních podmínek (Custersův efekt) (Deák, 2008). U velké většiny fermentujících kvasinek je překvapivě konstatována neschopnost fermentace různých disacharidů. Tento jev byl nazván Kluyverovým efektem (Janderová, Bendová, 1999). 2.2.6 Citrátový cyklus V Krebsově cyklu se působením enzymu citrátsyntetázy kondenzuje dvouuhlíkatý acetylkoenzym A s oxalacetátem se čtyřmi uhlíky za tvorby citrátu. Ten se řadou dílčích reakcí opět přeměňuje na oxalacetát, který se pravidelně regeneruje, aby mohl vstoupit do dalšího cyklu. V soustavě enzymatických reakcí je tedy acetyl, zbytek kyseliny octové ve formě acetylkoenzymu A, postupně oxidován až na CO 2 + H 2 O. Zdrojem acetylu pro Krebsův cyklus je pyruvát vytvářený fermentací nebo glykolýzou sacharidů, hlavně hexóz (Klaban, 1999). Oxid uhličitý se uvolňuje dekarboxylacemi bez podstatné změny energie. Zdrojem energie jsou odebrané atomy vodíku, které vstupují do dýchacího řetězce. Energetická bilance odpovídá 12 ATP (Vodrážka, 1996). 2.2.7 Zdroje dusíku Nejsnáze využitelnými zdroji dusíku pro kvasinky jsou amonné ionty a aminokyseliny, zejména kyselina glutamová a glutamin. Pouze některé kvasinky umí využívat také dusičnany či dusitany, vždy však pouze za nepřítomnosti výhodnějších zdrojů dusíku v prostředí (Janderová, Bendová, 1999). 2.3 Kvasinky v mlékařství Díky schopnosti fermentovat cukry na ethanol a oxid uhličitý jsou kvasinky známé pro jejich důležitou úlohu při výrobě různých potravin a nápojů. Mléčné výrobky poskytují jedinečné podmínky pro růst kvasinek. Kvasinky uplatňující se v mlékařství 18

sdílejí řadu fyziologických a biochemických vlastností jako je fermentace nebo asimilace laktózy či galaktózy, vysoká proteolytická a lipolytická aktivita, využívání mléčné nebo citronové kyseliny, růst při nízkých teplotách a tolerance k vysoké koncentraci soli. Poměrně menší počet kvasinek se vyskytuje v mléčných výrobcích, jako je mléko, smetana, jogurt, máslo, převládající jsou v sýrech a kefírech. Výskyt kvasinek v sýrech je důležitý pro jejich kvalitu, protože kromě toho, že umožňují růst bakterií tím, že upravují ph, mají klíčovou úlohu v textuře výrobků a tvorbě vonných látek při zrání. Nadměrný růst některých kvasinkových druhů může být důležitým faktorem při kažení mléčných výrobků. Typické vady, které způsobují kvasinky, jsou tvorba plynu, kvasnicová chuť a další nežádoucí příchutě, změny barvy a textury (Jacques, Casaregola, 2008). 2.3.1 Vybrané rody kvasinek využívané v mlékařství 2.3.1.1 Rod Candida Rod Candida zahrnuje nekvasící druhy i druhy se silnými kvasnými schopnostmi. Na vhodných půdách tvoří pseudomycelium až pravé mycelium. Druhy rodu Candida, u nichž byly zjištěny pouze kulovité až elipsoidní buňky, byly dříve zařazovány do rodu Torulopsis. Dnes však je známo, že tvorba pseudomycelia a pravého mycelia může být výsledkem mutace určitých genů, a proto nemůže sloužit jako jediný znak rozlišující dva rody. Proto byl rod Torulopsis zrušen (Šilhánková, 2002). (Označení Torulopsis se používá ve starší literatuře, ale stále i v současné literatuře, a je z tohoto důvodu citován v této práci.) Některé druhy jsou zapojeny do procesu kvašení kakaových bobů, jsou součástí kefírových zrn a mnoha dalších produktů, včetně piva a ovocných šťáv (Jay et al., 2005). Candida kefyr (dříve označována jako C. pseudotropicalis nebo C. sphaerica) využívá laktózu, je imperfektním stadiem druhu Kluyveromyces marxianus (Šilhánková, 2002). Některé druhy rodu Candida jsou významnými patogeny způsobujícími onemocnění kůže, nehtů, sliznic (Vlková et al., 2009). Candida albicans je druh kvasinky, který je nejvíce patogenním druhem kandid. Je typickým druhem střevní a ústní mikroflóry. Za normálních okolností u 80 % populace neškodí. Když se však nadmíru přemnoží, způsobuje kandidózu. Kandidóza je často diagnostikována u osob se sníženou imunitou, kde je častou příčinou nemocí a úmrtí. Dalšími významnými 19

patogenními zástupci jsou C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata, C. guilliermondii, C. zeylanoides (Sládková, Hlaváčová, 2011). 2.3.1.2 Rod Debaryomyces Rod Debaryomyces je jedním ze dvou nejrozšířenějších kvasinkových rodů v mléčných výrobcích. Je schopen růstu při 24% koncentraci NaCl a aktivitě vody (a w ) 0,65. Způsobuje kažení koncentrátů pomerančové šťávy a mléčných výrobků (Jay et al., 2005). Vytváří bílé povlaky na povrchu láků, nálevů a sýrů (Vlková et al., 2009). Kvasné schopnosti jsou velmi slabé, některé druhy dokonce cukry ani nezkvašují. Většina druhů tohoto rodu roste dobře v přítomnosti 50 % glukózy (Šilhánková, 2002). Debaryomyces hansenii je běžným druhem ve všech typech sýrů, včetně měkkých sýrů a polotvrdých a tvrdých sýrů ze solných nálevů. Hlavní vlastnosti rodu Debaryomyces zahrnují toleranci k soli, schopnost produkovat proteolytické a lipolytické enzymy, které mohou metabolizovat mléčné bílkoviny a tuky, a schopnost růstu při nízkých teplotách a nízké vodní aktivitě. Navíc bylo zjištěno, že D. hansenii v solných roztocích inhibuje klíčení nežádoucích mikroorganismů jako je Clostridium butyricum a C. tyrobutyricum. V sýrech s mazem na povrchu je vývoj vhodné bakteriální flóry na povrchu závislý na metabolismu kyseliny mléčné kvasinkami, zejména D. hansenii. D. hansenii poskytuje důležité růstové faktory pro bakterie, jako například vitaminy, aminokyseliny, dále složky aroma a lipolytické a proteolytické enzymy přispívající k procesu zrání. Debaryomyces hansenii syntetizuje těkavé kyseliny, alkoholové a karbonylové sloučeniny. D. hansenii a další kvasinky zúčastňující se zrání sýrů mohou syntetizovat S-methylthioacetát, což je těkavá sloučenina síry a methional, který se nachází, například v Čedaru a Camembertu (Breuer, Harms, 2006). 2.3.1.3 Rod Geotrichum Geotrichum podle Jay et al., (2005) bylo dříve známé jako Oidium lactis a Oospora lactis). Geotrichum tvoří přechod mezi kvasinkami a vláknitými houbami. Někdy se řadí mezi mlékárenské plísně (G. candidum), protože se podílí na vzniku specifické chuti a aroma u některých typů sýrů. V mléčných produktech se ale tento rod vyskytuje 20

také jako nežádoucí kontaminant (Vlková et al., 2009). Geotrichum candidum se může vyskytovat v různých mlékárenských výrobcích, např. tvarohu, tvarohových sýrech, v másle i samotném mléce. Tvoří ve značném množství lipolytické a proteolytické enzymy a proto rozkládá různé tukové a bílkovinné substráty. Je saprofytem, ale v současné době se již také pokládá za fakultativního patogena schopného za příznivých okolností vyvolat mykotické onemocnění člověka, tzv. geotrichózu (Klaban, 1999). Geotrichum nemá kvasné schopnosti. Vyskytuje se jako častá kontaminace mléčných výrobků, hlavně tvarohů a jogurtů (Šilhánková, 2002). V potravinářských závodech se vyskytuje na povrchu nedostatečně sanitačně ošetřených strojích, odtud pochází anglické pojmenování maschine mould (Gőrner, Valík, 2004). G. candidum vyrábí a vylučuje d-3-fenyloctovou kyselinu a d-3-indolmléčnou kyselinu, tyto kyseliny inhibují růst Listeria monocytogenes (Boutrou, Guéguen, 2005). 2.3.1.4 Rod Kluyveromyces Kvasinky rodu Kluyveromyces produkují β-galaktosidázu (laktáza) a fermentují cukry včetně laktózy. Kluyveromyces marxianus nyní zahrnuje kvasinky dříve označované jako K. fragilis, K. lactis, K. bulgaricus, Saccharomyces lactis a S. fragilis. Kluyveromyces marxianus je jednou ze dvou nejrozšířenějších kvasinek v mléčných výrobcích (Jay et al., 2005). Kluyveromyces marxianus se svými dvěma variantami, a to var. marxianus (dříve K. marxianus a K. fragilis) a var. lactis (dříve K. lactis), zkvašují laktózu a jsou součástí tzv. kefírových zrn, tj. konglomerátu kvasinek a bakterií, používaného při výrobě kefíru (Šilhánková, 2002). Kvasinky rodu Kluyveromyces se využívají pro výrobu laktázy ze syrovátky a fermentaci syrovátky za účelem produkce krmných kvasnic (Vlková et al., 2009). Laktáza se průmyslově využívá při výrobě kondenzovaného mléka, neboť znemožňuje krystalizaci laktózy (Šilhánková, 2002). Jak uvádí Šustová, Sýkora (2013) Kluyveromyces lactis slouží k výrobě tzv. mikrobiálních neboli vegetariánských syřidel. 2.3.1.5 Rod Rhodotorula Název rodu Rhodotorula napovídá, že se jedná o kvasinky oranžové až červené barvy, protože obsahují karotenoidní barviva. Ta je chrání před účinkem ultrafialové složky slunečního záření, a proto se také mohou ve větším množství vyskytovat 21

v ovzduší (Klaban, 1999). Rod Rhodotorula nezkvašuje žádné cukry (Šilhánková, 2002). Mlékárenský průmysl používá při výrobě sýrů několik druhů kvasinek. Tyto kvasinky patří do rodů Geotrichum, Kluyveromyces, Debaryomyces, a v menší míře i Rhodotorula. Rhodotorula glutinis má vysoký obsah karotenoidů a toho se používá pro zbarvení některých sýrů (např. Čedaru) (Gabier et al., 2005). Kvasinky z rodu Rhodotorula bývají zdrojem kontaminace sýřeniny během výroby sýru. Jsou přítomny v prostředí závodu, na pracovních plochách, v láku a na rukách a zástěrách zaměstnanců (Yeeh, 1999). 2.3.1.6 Rod Saccharomyces Rod Saccharomyces patří k značně rozšířeným kvasinkám v přírodním prostředí, často se používá jako modelový organismus k různým fyziologickým a genetickým výzkumům. Kvasinky tohoto rodu se vyznačují silnými fermentačními schopnostmi a mají použití např. v pivovarnictví, pekařství, lihovarnictví a vinařství (Klaban, 1999). Kvasinky z rodu Saccharomyces zkvašují glukózu, sacharózu, maltózu, galaktózu a částečně nebo úplně trisacharid rafinózu (Šilhánková, 2002). Saccharomyces boulardi je probiotikum, které blokuje růst patogenů včetně Clostridium difficale, indukuje tvorbu sekrečního IgA ve sliznici trávicího traktu a zvyšuje zde aktivitu disacharidáz v podobě laktázy a maltázy (Vlková et al., 2009). Označení probiotikum se užívá pro mikroorganismy, které splňují přísná kritéria (musí být přítomna přirozeně ve střevní mikroflóře, musí odolat trávícím šťávám a enzymům žaludku a tenkého střeva, nesmí být závadná lidskému zdraví a další). Jestliže je mikroorganismus (kmen) označen jako probiotikum, může být používán do potravin. Takovéto potraviny mají pro konzumenta pozitivnější zdravotní dopad, protože tyto mikroorganismy (kmeny) v tlustém střevě snižují (okyselují) ph a tím potlačují růst negativních bakterií (snižují riziko rakovinného bujení, pouze preventivně), snižují emise škodlivých plynů (methan, amoniak), zvyšují imunitu střev, resp. celého organismu, atd. (Šustová, Sýkora, 2013). 2.3.1.7 Rod Yarrowia Rod Yarrowia je poměrně nově vytvořený rod kvasinek, kam patří zejména druh Yarrowia lipolytica, dříve zvaný Saccharomycopsis lipolytica nebo Candida lipolytica (Klaban, 1999). Yarrowia lipolytica je jedním z častých druhů kvasinek spojovaných 22

s mléčnými výrobky a díky její enzymatické aktivitě může být používána při zrání sýrů. Y. lipolytica má důležitou úlohu pro organoleptické vlastnosti sýrů, vzhledem k tomu, že produkuje aromatické sloučeniny a jejich prekurzory, jako jsou methylketony, alkoholy, laktony a estery (Suzzi et al., 2001). 2.3.2 Kvasinkové kultury Fermentační vlastnosti kvasinek zkvašujících laktózu se využívají v mlékárenském průmyslu. Používají se při výrobě: - kysaných mléčných výrobků (kefír, kumys), - v sýrařství (odkyselování kyselé sýřeniny, lipolýza), - v máslařství (jakost a trvanlivost másla z kysané smetany). Podle použití v mlékárenském průmyslu se rozlišují kvasinkové kultury: - máslařské, - pro výrobu sýrů rokfortského typu, - tvořící část mazové kultury pro výrobu měkkých sýrů, - a kultury, které jsou součástí kefírové kultury a jiných nápojových kultur. Máslařské kvasinkové kultury obsahují druhy Torulopsis candida a Cryptococcus laurentii. Úlohou těchto kvasinek je zlepšování jakosti a prodlužování trvanlivosti másla (Gőrner, Valík, 2004). Máslařské kvasinky omezují v másle oxidaci tuku, brání rozkladu organických kyselin, tím zabraňují tzv. žluknutí másla, potlačují rozvoj plísní a brání rozmnožování koliformní a peptonizující mikroflóry (Zadražil, 2002). 2.3.3 Kefírová kultura Kefírová kultura má zvláštní postavení mezi čistými mlékařskými kulturami. K její přípravě se používá buď originálních kefírových zrn, nebo se ve speciálních závodech na výrobu čistých mlékařských kultur uměle sestavuje z mikroorganismů příslušného druhu. Složení kefírových kultur nebývá proto jednotné (Teplý et al., 1968). Základem mikrobiální kultury na výrobu kefíru a kefírových mlék jsou kefírová zrna. Jsou to květáku podobné hrudky žlutobílé barvy velikosti hrachu až ořechu vzniklé nahromaděním příslušných mikroorganismů a produktů jejich látkové přeměny v mléku (Gőrner, Valík, 2004). Kefírová zrna se liší ve velikosti a v průměru měří od 0,5 do 3,5 cm. Zrna jsou nerozpustná ve vodě a po namočení ve vodě bobtnají. Mikroflóra kefírových zrn je složitá a velmi variabilní (Vedamuthu, 2006). 23

Během fermentačního procesu vytvářejí bakterie mléčného kvašení mléčnou kyselinu, zatímco kvasinky zkvašující laktózu vytvářejí ethanol a CO 2 (Hylmar, 1986). Typická mikroflóra kefírových zrn používaných k fermentaci mléka by měla obsahovat Lactobacillus kefir, Lactococcus spp., Leuconostoc spp., Acetobacter spp., kvasinky zkvašující laktózu (např. K. marxianus spp.) a kvasinky nezkvašující laktózu (S. unisporus, S. cerevisiae a S. exignus) (Wszolek et al., 2006). Podobné složení uvádí také Gőrner, Valík, (2004), z laktokoků jsou to převážně Lactococcus lactis ssp. lactis a Lactococcus lactis ssp. cremoris, z laktobacilů jsou to Lactobacillus delbrueckii (dříve Lactobacillus caucasicus), Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei a Lactobacillus kefir a z mléčných kvasinek jsou to Kluyveromyces fragilis, Torulopsis kefir (Candida kefir) a jiné. Uměle sestavená kefírová kultura je obvykle složena z mikroorganismů Streptococcus lactis (nově Lactococcus lactis), Lactobacillus caucasicus a Saccharomyces fragilis, popř. Torulopsis kefir. Uměle sestavená čistá kefírová kultura má ve srovnání s kulturou získanou ze zrn tu výhodu, že při správném ošetření a používání nemá vady, které často mívá kultura připravená z originálních kefírových zrn (ta má charakter přírodního zákysu, a proto je u ní také nebezpečí nestandardní jakosti) (Teplý et al., 1968). V tabulce č. 1 jsou uvedeny kultury používané k výrobě kefíru a kefírového mléka podle Vyhlášky č. 77/2003 Sb. v aktuálním znění. 24

Tab. 1: Druhy živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích (upraveno podle Vyhl. č. 77/2003 Sb. v aktuálním znění) Druh výrobku Použité mikroorganismy Mléčná mikroflóra výrobku v 1 g Kefír Kefírové mléko zákys připravený z kefírových zrn, jehož mikroflóra se skládá z kvasinek zkvašujících laktózu Kluyveromyces marxianus i nezkvašujících laktózu Saccharomyces unisporus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces exignus a dále Leuconostoc, Lactococcus a Aerobacter, rostoucí ve vzájemném společenství zákys skládající se z kvasinkových kultur rodu Kluyveromyces, Torulopsis nebo Candida valida a mezofilních a termofilních kultur bakterií mléčného kvašení v symbióze bakterie mléčného kvašení 10 6 a kvasinky 10 4 bakterie mléčného kvašení 10 6 a kvasinky 10 2 2.3.4 Fermentované výrobky s bakteriální a kvasinkovou kulturou Ve výrobcích se smíšenou kulturou mléčných bakterií a kvasinek probíhá rozklad laktózy mléčným kvašením za vzniku kyseliny mléčné a současně i alkoholovým kvašením za vzniku ethanolu a oxidu uhličitého, který dodává výrobkům našlehanější konzistenci a mírně štiplavou chuť. Mezi tyto výrobky patří tradiční nápoj z oblasti Kavkazu kefír, vyráběný z kravského, ale i buvolího mléka, ve střední Asii kumys, vyráběný převážně z mléka kobylího (Šustová, Sýkora, 2013). 2.3.4.1 Kefír Kefír se vyrábí buď pomocí tzv. kefírového zrna, které se přidá do mléka o teplotě 16 20 C a nechá při této teplotě 1 3 dny fermentovat. Tato tzv. domácí výroba kefíru je v mlékárnách většinou nahrazena, a to tak, že kefírové zrno se použije k přípravě tzv. matečného zákysu, který se použije k výrobě provozního zákysu a teprve tento zákys je použit k fermentaci mléka na kefír. Novější technologie používají koncentrované kultury bakterií a kvasinek, které jsou přidány rovnou do mléka ve fermentačním uzravači (Šustová, Sýkora, 2013). Mléko se inkubuje 1 až 4 % speciálního zákysu a při teplotě 18 22 C mléko zraje v tancích do titrační kyselosti 25

40 SH. Pak se vychladí pod 10 C a plní do spotřebitelských obalů (Grieger, Holec, 1990). Kefír se nejčastěji vyrábí jako kefírové mléko s obsahem do 3,5 % tuku. Výrobek je příjemně kyselý, osvěžující oxidem uhličitým a nepatrným množstvím ethanolu (Lukášová et al., 2001). Kefír má v 1 g obsahovat bakterie mléčného kvašení v koncentraci 10 6 a kvasinky v koncentraci 10 4. Kefírové mléko má v 1 g obsahovat bakterie mléčného kvašení v koncentraci 10 6 a kvasinky v koncentraci 10 2 (Dragounová, 2003). 2.3.4.2 Kumys Kumys se původně vyráběl z kobylího mléka. Dnes se průmyslově vyrábí kumys z mléka kravského s přídavkem nebo bez přídavku cukru. Kumys se vyrábí z odtučněného mléka, jehož tukuprostá sušina nesmí klesnout pod 8,1 % (Hylmar, 1986). Mléko se pasteruje při 95 C po dobu 20 sekund, po vychlazení na 26 28 C se očkuje kulturou sestávající z kmenů Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Kluyveromyces marxianus var. marxianus nebo Kluyveromyces marxianus var. lactis. Zrání probíhá do titrační kyselosti 30 SH a dosahuje kolem 0,7 % ethanolu (Lukášová et al., 2001). Při rozmíchávání zralé směsi se vmíchá hodně vzduchu, což umožní pomnožení kvasinek a tvorbu ethanolu a CO 2. Po vychlazení se plní do obalů (Grieger, Holec, 1990). Chuť kumysu je čistě mléčně kyselá, osvěžující s lehkou příchutí po kvasinkách (Hylmar, 1986). 2.3.5 Sýry Sýr je mléčný výrobek vyrobený vysrážením mléčné bílkoviny z mléka působením syřidla nebo jiných vhodných koagulačních činidel, prokysáním a oddělením podílu syrovátky (Vyhláška č. 77/2003 Sb. v aktuálním znění). 2.3.5.1 Měkké sýry zrající pod mazem Na rozdíl od čerstvých sýrů probíhá u těchto sýrů zrání mazovou kulturou od povrchu dovnitř. Zrání probíhá do značné hloubky v trvání několika dnů až týdnů. Jedná se o široký sortiment sýrů, lišících se tvarem a hmotností (Gajdůšek, 2002). Do této skupiny patří sýry Romadur, Limburský, Dezertní, Krkonošský pivní. 26

Kromě základní mezofilní kultury bakterií mléčného kvašení se při jejich výrobě používá tzv. mazová kultura. Mazová kultura bývá složená z proteolytických, halofilních bakterií Brevibacterium linens a kvasinek, např. Geotrichum candidum, Debaryomyces hansenii apod. (Gőrner, Valík, 2004). Technologický proces sýrů zrajících pod mazem lze rozdělit na tři fáze. V první fázi se uplatňují bakterie, které jsou součástí zákysové kultury, konkrétně se jedná o druhy Lactococcus lactis ssp. lactis a Lactococcus lactis ssp. cremoris. První fáze trvá asi 24 hodin a probíhá při teplotě 20 C. Musí být včas ukončena, aby nedošlo k přílišnému překysání těsta, čímž by byl znemožněn rozvoj proteolytických bakterií. Následuje druhá fáze, která probíhá po dobu 3 6 dnů při stejných teplotách jako první fáze. Na povrchu sýrů se rozvíjejí kvasinky Candida vini, Candida krusei, Candida lipolytica, Debaryomyces hansenii a Geotrichum candidum a vytvářejí bílý až našedlý povlak (Vlková et al., 2009). Kvasinky odkyselují povrch sýrů rozkladem kyseliny mléčné na CO 2 a H 2 O, deaminují aminokyseliny a produkují NH 3, což vede ke zvýšení hodnoty ph na povrchu sýrů a vytvoření příznivějších podmínek pro růst bakterií. Kvasinky produkují látky, které stimulují růst bakterií mazové flóry. Jsou to vitaminy syntetizované kvasinkami (např. pantothenová kyselina, niacin, riboflavin) (Sheehan, 2007). Kvasinky rozkládají kyselinu mléčnou, čímž zvyšují hodnotu ph až na 5,5, což je hodnota vhodná pro rozvoj bakterií třetí fáze, tedy bakterií s proteolytickou aktivitou (Vlková et al., 2009). Jedná se o bakterie druhu Brevibacterium linens, Arthrobacterium spp., Micrococcus spp. a Corynebacterium spp., které vytvářejí na povrchu sýrů oranžový maz (Gőrner, Valík, 2004). Sýry zrají 10 14 dnů při 14 16 C, relativní vlhkosti 95 % (Lukášová et al., 2001). Očkování zformovaných sýrů mazovými bakteriemi a k nim příslušných kvasinek je dvojího druhu. Jeden způsob spočívá v tzv. omývání sýrů. Při tomto způsobu se vyformované a už zrající sýry utírají textilní utěrkou namáčenou do 5% roztoku soli (NaCl). Mazové bakterie s příslušnými kvasinkami rostou na sýrech z počátku v koloniích, které se omýváním se slanou vodou roztírají po celém jejich povrchu. Při tomto způsobu očkování sýrů mazovou kulturou je nebezpečí přenosu případných přítomných choroboplodných bakterií, např. Listeria monocytogenes. Při druhé metodě očkování sýrů se mazová kultura na sýry rozstřikuje ve formě vodné suspenze. Očkování postřikem sýrů se provádí po jejich solení (Gőrner, Valík, 2004). 27

2.3.5.2 Olomoucké tvarůžky Tvarůžky tvoří samostatnou skupinu měkkých sýrů zrajících pod mazem (Lukášová et al., 2001). Olomoucké tvarůžky se vyrábí v podobě koláčků s průměrem 45, resp. 55 mm a výškou 8, resp. 12 mm, jakož i tyčinek s průměrem 20 mm a délkou 100 mm (Drdák et al., 1996). Tvarůžky jsou jediným kyselým sýrem vyráběným z tvarohu o sušině 32 %, charakteristické je zrání prostřednictvím Brevibacterium linens, který vytváří na povrchu zlatohnědý maz a typické aroma. Kyselý tvaroh se nasolí, plní do beček, udusá, zde zraje několik týdnů i půl roku. Pak se uzrálý tvaroh smíchá s čerstvým, přidá se jedlá soda nebo CaCO 3 regulátory kyselosti. Hmota se promíchá, prohněte a sekají se z ní tyčinky, kolečka či věnečky (Šustová, Sýkora, 2013). Sušením (2 4 dny, 25 32 C, relativní vlhkost 50 90 %) se dosáhne žádaného obsahu sušiny 36 38 % a požadované povrchové proteolytické mikroflóry (Kalhotka et al., 2012). Sušení umožňuje rozvoj oxidačních kvasinek z rodů Torulopsis a Candida (Gőrner, Valík, 2004). Kvasinky zoxidují nadbytečnou kyselinu mléčnou na CO 2 a vodu, čímž je v povrchových vrstvách snížená kyselost a je umožněn rozvoj proteolytických bakterií. Po dosažení ph povrchu 6,4 jsou sýry omývány, aby byly odstraněny kvasinky (Vlková et al., 2009). Až po praní se začne uplatňovat vlastní proces zrání tvarůžků, což trvá při teplotách 15 20 C 4 8 dní. Zrání způsobuje aerobní proteolytická mikroflóra mazových bakterií, zejména Brevibacterium linens. Přitom se na tvarůžkách tvoří zlatožlutý až oranžový maz a sýry dostávají typickou chuť a vůni (Gőrner, Valík, 2004). Tvarůžky se balí dozrálé do 1/3 na řezu s obsahem sušiny min. 34 % a soli max. 5,5 %. Zabalené balíčky se po kontrole dopravují do chladírenského skladu. V průběhu skladování a expedice tvarůžky dále dozrávají. Expedují se týden po zabalení (Kalhotka et al., 2012). 2.3.5.3 Plísňové sýry s plísní na povrchu Mezi sýry s plísní na povrchu řadíme sýry typu camembert. Jedná se o měkké sýry vyrobené srážením pomocí syřidla bez dohřívání sýřeniny a lisování s povrchem porostlým ušlechtilou plísní Penicillium camemberti (Vlková et al., 2009). Typickými představiteli jsou Camembert, nebo větší De Brie, Hermelín a Kamadet (Gajdůšek, 2002). V České republice se tyto sýry vyrábí s hmotností 120 g ve tvaru nízkého válce (výška 3 cm, průměr 9 cm). Obsah sušiny je 45 %, obsah tuku 28

v sušině 45 % a obsah chloridu sodného 1,5 3 % (Hermelín a Encián). Sýry camembert a brie jsou francouzského původu; brie má však tvar nízkého bochníku a hmotnost 1,2 až 1,5 kg (Grieger, Holec, 1990). Před sýřením se přidává do mléka smetanový zákys, sýří se při 31 33 C 30 min., zrání zajišťuje plísňová kultura Penicillium camemberti a nástřikem Geotrichum candidum (Šustová, Sýkora, 2013). Po prokysání a vysrážení syřidlem se sýřenina formuje do požadovaného tvaru pomocí forem a syrovátka se nechá odkapat do druhého dne (Vlková et al., 2009). Přičemž teplota nemá klesnout pod 25 až 20 C. Odkapaná sýřenina má mít hodnotu ph 4,8 až 4,6. Prokysání sýřeniny na toto maximum je pro výrobu velmi důležité, neboť umožňuje započetí růstu kvasinkové a bakteriální mikroflóry, která se uplatňuje v počátečních stádiích zrání sýrů s plísní na povrchu (Gőrner, Valík, 2004). Během odkapávání se asi čtyřikrát obracejí. Odkapané sýry se krátce solí v solné lázni nebo kontinuálně nástřikem jemné suché soli na vlhký povrch sýru. Po oschnutí zrají při 12 C a relativní vlhkosti 90 % 10 dní (Čurda, 2002). Při zrání se uplatňují dvě fáze zrání. Během první fáze zrání, kvasinky (Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces lactis), Geotrichum candidum a Penicillium camemberti zvyšují ph konzumací laktátu, který využívají pro svůj růst. Při nárůstu ph nad 5,8 nastává druhá fáze zrání (Spinnler, Leclerq-Perlat, 2007). V průběhu sekundárního aerobního zrání se značně mění konzistence sýrů. Sýry měknou v důsledku rozkladu kaseinu enzymy ušlechtilé plísně. Dochází také ke štěpení kyseliny mléčné a uvolňování amoniaku po deaminaci aminokyselin. Plísně rodu Penicillium mají také značný lipolytický účinek. Při hydrolýze tuku během zrání obou typů plísňových sýrů dochází k uvolňování mastných kyselin a jejich následné oxidativní dekarboxylaci za vzniku methylketonů. Tyto látky dodávají plísňovým sýrům charakteristickou chuť a aroma (Vlková et al., 2009). 2.3.5.4 Plísňové sýry s plísní v těstě Tato skupina sýrů se vyznačuje v nákroji typickým mramorovaným porostem modré nebo modrozelené plísně Penicillium roqueforti (Gajdůšek, 2002). Představitelem této skupiny sýrů je Roquefort, který se vyrábí z ovčího mléka, dalšími zástupci jsou Niva, Danablue, Stilton a Gorgonzola (Čurda, 2002). Tyto sýry se vyrábějí s vyšším obsahem tuku (45 60 % t. v. s.), který je nezbytný pro zachování celkového charakteru a typické chuti (Gajdůšek, 2002). 29

Sýry roquefortského typu se vyrábí značně slané, u nás s obsahem 4 % NaCl, ale v zahraničí až 8 % NaCl (Gőrner, Valík, 2004). Kvasinky a plísně metabolizují kyselinu mléčnou a hydrolyzují bílkoviny, uvolňují amoniak a aminokyseliny. Tato metabolická aktivita vede ke zvýšení ph. Charakteristická kvasinková flóra rozvíjející se na Roquefortu zahrnuje Debaromyces hansenii, Candida ssp. a Kluyveromyces lactis (Jhonson, 2001). Kmeny kvasinek se uplatňují při tvorbě chuti a vůně plísňových sýrů v symbióze s ušlechtilými plísněmi kmene Penicillium roqueforti, tvorbou aromatických esterů. Oxid uhličitý, vznikající při růstu kvasinek, vytváří v těstě dutinky, které umožňují lepší prorůstání plísní v těstě. Základ kultur tvoří kmeny Saccharomycopsis lipolytica a Kluyveromyces marxianus var. lactis. Úprava mléka je standardní, vhodná je homogenizace smetany s ohledem na lipolytické procesy během zrání. Plísňová kultura se přidává obvykle do mléka před sýřením a příp. i do sýrového zrna (Zadražil, 2002). Sýry se solí do těsta před vypuštěním syrovátky. Formované sýry prokysávají při teplotách 23 26 C. Sýry se solí 3 dny po sobě na sucho nebo v solné lázni 2 dny. Důležité pro růst plísní je dosažení vhodné konzistence s dutinkami a propichování sýrů. Sýry zrají při nízkých teplotách 12 14 C a dozrávají při 8 10 C. Celková doba zrání je 5 týdnů (Lukášová et al., 2001). 2.3.5.5 Tvarohovité sýry zrající bryndza Slovenská bryndza je přírodní bílý, jemně roztíratelný zrající sýr s ojedinělými krupičkami, vyrobený tradičním způsobem mletím uzrálého ovčího hrudkového sýru nebo směsi ovčího a kravského hrudkového sýru. Obsahuje přirozené široké spektrum mikroorganismů zejména z rodů: Lactobacillus, Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus, Kluyveromyces marxianus, Geotrichum candidum (Kopáček, 2010). Na Slovensku se tradičně vyrábí jako Liptovská bryndza jen z ovčího hrudkového sýru, plnotučná letní bryndza ze směsi ovčího a kravského hrudkového sýru, plnotučná zimní bryndza ze směsi skladovaného a soleného ovčího hrudkového sýru a kravského hrudkového sýru. Jejich obsah sušiny je podle druhu 44 55 %, tuku v sušině 38 53 % a obsah soli 2,5 3 %. Každý směsný druh bryndzy musí obsahovat nejméně 50 % ovčího hrudkového sýru počítaného na sušinu. 30