Směrovaná léčiva a imunostimulace jen experiment nebo nové možnosti?

Blanka Říhová Směrovaná léčiva a imunostimulace jen experiment nebo nové možnosti? Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i.

FARMAKOLOGICKÝ VÝZKUM

Imunitní systém hostitele

Kčemu vlastně imunitní systém potřebujeme?

STATISTIKA 40 % žen mezi 40 50 lety má potenciální zhoubné nádory v prsu incidence je 1% 55% mužů mezi 50 60 lety má potenciální zhoubné nádory v prostatě incidence je 1% 90% populace ve věku 60 70 let má potenciální zhoubné nádory štítné žlázy incidence je 0.1%

Elimination (Cancer Immunosurveillance) Equilibrium γδ NK Genetic instability/ immune selection Protection

Effect of pulsed electromagnetic field (BEMER 3000) on the survival of mice bearing EL4 T cell lymphoma (nude mice injected with 15 mg of DOX equiv. of DOX-HPMA HYD ) 100 tum mor size (mm 3 ) 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 140 days 3,5 µt 10,5 µt 21 µt 35 µt B 732 controls

10-12 dní nádorové buňky léčivo+emf nádor Cancer Im mmunoediting Transformed MICA/B ULBP (Human) Elimination (Cancer Immunosurveillance) CD8 + CD4 + CD8 + Mφ Tumor antigens Rae-1 H60 (Mouse) Innate & Adaptive Immunity NKT γδ γδ IFNγ NK NK Perforin TRAIL Protection e.g p53 Danger : uric acid, ECM products Equilibrium γδ CD8 + Rb Ras NKT Carcinogens Radiation Chronic inflammation Inherited Viruses NK Galectin-1 Genetic instability/ immune selection CD8 + NK Escape CD8 + CD4 + CD25 + Treg IDO MHC-I IFNγ resporse CD4 + CD25 + Treg CD8 + smica/b NK Normal 4 měsíce nádor 6000 5000 nádorové buňky nádor velikost nádoru (mm 3 ) 4000 3000 2000 1000 0 0 10 20 30 40 50 dny

Máme způsoby jak Omezit působení léčiva na zdravé tkáně podávání není doprovázeno nepříjemnými vedlejšími účinky

Máme způsoby jak Zvýšit akumulaci léčiva v nádorové tkáni nádor je vystaven agresivnější terapii

Máme způsoby jak Zcela nebo podstatně omezit toxicitu vůči imunitnímu systému ten pak může pomoci při konečné likvidaci onemocnění

Paul Ehrlich a jeho kouzelná střela Psal se rok 1906 Studies in Immunity, Plenum Press, New York, 1906

OD VÝZKUMU K LÉČBĚ 50 000 nové látky 5 000 testy in vitro 500 testy in vivo 5 klinické testy 1 použití v klinické praxi

POŽADAVKY NA LÉČIVA NOVÉ GENERACE musí se akumulovat v cílové tj. nádorové tkáni - agresivnější léčba vedlejší účinky musí být minimální - podávání ambulantně cirkulace v krevním oběhu musí být prodloužená - podávání nemusí být tak časté léčivo nesmí být během cirkulace toxické - působení je omezeno jen na postiženou tkáň/orgán náklady nesmí být příliš vysoké

LÉČIVA NOVÉ GENERACE SE SCHOPNOSTÍ PASIVNÍ NEBO AKTIVNÍ AKUMULACE a b c nerozpustné liposomy rozpustné imunotoxiny vodorozpustné polymerní systémy

SMĚROVANÁ POLYMERNÍ LÉČIVA

POLYMERNÍ NOSIČE Dextrany Polygalakturonová kyselina Polyglutamová kyselina PEG Poly-L-lysin Blokové kopolymery N-(2-hydroxypropyl)metakrylamid (HPMA)

N-(2-hydroxypropyl)metakrylamid HPMA

HPMA NOSIČ neimunogenní nemitogenní netoxický neaktivuje komplement neukládá se v organizmu

Volné léčivo Směrované léčivo

volné léčivo směrované léčivo cílová buňka cílová buňka

KONFERENCE NIH/NCI-WASHINGTON ZÁŘÍ 2002 a aktivní směrování b pasivní směrování

SMĚRUJÍCÍ MOLEKULY Monoklonální i polyklonální protilátky IgG Lektiny Cukry Růstové hormony Transferin

STRUKTURA PROLÉČIV PROLÉČIVA PRO AKTIVNÍ SMĚROVÁNÍ PROLÉČIVA PRO PASIVNÍ SMĚROVÁNÍ

STRUKTURA DOX-HPMA-Ig DOX Vazba štěpitelná katepsinem B Štěpení katepsinem B

STRUKTURA PROLÉČIV PROLÉČIVA PRO AKTIVNÍ SMĚROVÁNÍ PROLÉČIVA PRO PASIVNÍ SMĚROVÁNÍ

Struktura nesměrovaného DOX-HPMA (PK1) DOX Štěpení katepsinem B

a) Normální tkáň intaktní endotel lymfatická drenáž b) Maligní tkáň diskontinuální endotel omezená lymfatická drenáž

TESTOVÁNÍ In vitro prokazuje přímý cytotoxický efekt na nádorové buňky In vivo kromě přímého cytotoxického efektu na nádorové buňky se účastní ještě další systémy (imunitní, nervový, hormonální..)

in vivo veritas

EXPERIMENTÁLNÍ MODELY

A Přežívání myší PRIMÁRNÍ LÉČBA Dox-HPMA HYD B Přežívání myší RETRANSPLANTACE Dox-HPMA HYD Vyléčené myši byly retransplantovány controls 1x75 mg/kg Dox 1x25 mg/kg

Immunostimulatory side effects of HPMA-based anticancer drugs 1 2 3 4 5 6 7 Re-transplantation Nu/nu immunocompromized mice Winn s assay DC phagocytosis in vitro DC phagocytosis in vivo Metastatic infiltration of LN Chronic x acute cancer

Ochrana před sekundární nádorovou atakou

Systemická resistence proti nádoru, kterou navozuje léčba polymerními cytostatiky, záleží na dávce času imunitním systému hostitele

Agresivnější léčba nižší protinádorová resistence

Přežití po léčbě den 3, 6, 9, 12 nebo 15 100 počet myší (% %) 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 dny den 3 den 6 den 9 den 12 den 15 kontroly

vakcinační okno léčba započatá příliš brzy, příliš agresivně nebo příliš agresivně nebo příliš pozdě vyvolává pouze omezenou protinádorovou resistenci

Léčba začíná příliš brzy (nebo příliš gresivně) imunitní system není vystaven dostatečnému množství nádorových antigenů (nádorových buněk) Léčba začíná příliš pozdě efektorové mechanismy imunitního systému jsou vyčerpány

Konvenční myši (B/6) mají dokonale vyvinutý imunitní systém s funkční vrozenou i získanou imunitou Imunodefektní (nu/nu) myši nemají, v důsledku vrozeného postižení, získanou imunitu

Survival of mice bearing EL4 T cell lymphoma and treated with hyperbranched conjugate B HYD or linear conjugate Dox-HPMA AM - conventional mice su urviving mice (% %) 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 days Hyperbranched B/15mg Hyperbranched B/10mg Linear/15 mg Linear/10 mg Dox Controls

Survival of mice bearing EL4 T cell lymphoma and treated with hyperbranched conjugate B HYD or linear conjugate Dox-HPMA AM - nu/nu mice su urviving mice (% %) 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 days Hyperbranched B/15mg Hyperbranched B/10mg Linear/15 mg Linear/10 mg Dox Controls

Konvenční myší až stoprocentní resistence Imunokompromitované [(nu/nu) myši] žádná resistence

Testování protinádorového léčiva konvenční myši s poškozenou myši imunitou

makrofág (APC) dendritická buňka NK buňka (LAK buňka) CD4 Th lymfocyt CD8 CTL plasmatická buňka sekretující protilátky protilátka

Winn s assay 100 100 % surviving mice 80 60 40 20 % surviving mice 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 control day 11, no therapy days 0 0 20 40 60 80 control day 21, no therapy day 21, Dox-HPMA-HuIg

Winn s assay 120 100 survival % 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 days. naive cells DOX-HPMA AM -HuIg, tumor progression DOX-HPMA AM -HuIg, tumor regression Doxorubicin, tumor regression

Při léčbě vznikají nádorově specifické paměťové buňky, vznikající z populace CD8 + cytotoxických lymfocytů

Metastatic infiltration to lymph nodes after treatment with free doxorubicin a HPMA conjugates 70 P+/GFP-cells ratio 60 50 40 30 20

Acute Acute x chronic cancer chronic mice were injected once with a lethal dose of cancer cells (1x10 5 EL4 mouse T cell lymphoma) mice were injected 5 times with a low dose of cancer cells (1x10 4 EL4 mouse T cell lymphoma) 8 10 days a palpable tumor without palpable tumor 6 th injection of a low dose of cancer cells In 10 14 days a palpable tumor

Survival of mice suffering from acute or chronic cancer (mouse EL4 T cell lymphoma) Dox-HPMA HYD Non-cleavable dendrimer % of surviving mice 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 controls acute cancer 10 mg Dox-HPMA HYD - acute cancer days controls chronic cancer 10 mg Dox-HPMA HYD - chronic cancer

Polymerní léčiva na bázi HPMA cytotoxická imunomodulační složka

Cytotoxicita a imunomodulace dvojí útok na nádorovou buňku při léčbě polymerními cytostatiky

Pacient nevyčerpaný imunitní systém vyčerpaný imunitní systém léčba je účinná účastní se obě složky polymerního léčiva léčba má omezenou účinnost účastní se pouze cytotoxická složka polymerního léčiva

VÝHODY SMĚROVANÝCH LÉČIV NA BÁZI HPMA 1 2 3 4 5 6 7 8 Definovaná vazba léčiva na nosič Kontrolované uvolňování léčiva z nosiče Aktivní akumulace specificky směrovaného léčiva v cílové tkáni Pasivní akumulace léčiva v nádorové tkáni EPR efektem Snížená imunogenicita směrující bílkoviny Prodloužená cirkulace v krevním řečišti Snížená toxicita vůči zdravým orgánům Snížená imunotoxicita

Happy tumor cells hidden and growing in defenceless environment Treatment with HPMA-based polymeric conjugates......has not only a direct cytotoxic effect on cancer cells but also causes their unmasking and exposing to effector mechanisms of immune system

HPMA polymer Nádorové buňky citlivé S nebo rezistentní R na polymerní proléčivo S S S R R R R SR R S S S S S polymerní proléčivo obsahující doxorubicin Imunogení buněčná smrt a uvolnění nádorových antigenů Navození protinádorové immunity (aktivace dendritických buněk, přirozených zabíječů, T a B lymfocytů) Převzato z: Říhová a spol., Trends in Biotechnology 27, 11-17, 2009

Poděkování Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i. Karel Ulbrich Tomáš Etrych Martin Hrubý Petr Chytil Hana Krakovičová Daniela Plocová Robert Pola Jiří Strohalm Martin Studenovský Vladimír Šubr

Poděkování Mikrobiologický ústav AV ČR, v.v.i. Jaroslav Betka Jan Bouček Ondřej Hovorka Helena Chmelová Markéta Ibrahimová Martina Kabešová Jiřina Kovářová Marek Kovář Lubomír Kovář Veronika Pakanová Milada Šírová Jakub Tomola David Větvička

Děkuji vám!

PRVNÍ ZKUŠENOSTI S PODÁNÍM U LIDSKÝCH PACIENTŮ

TAA pacientka č. 6 cytokeratin cytokeratin

NK A LAK AKTIVITA A ABSOLUTNÍ POČET NK BUNĚK U PACIENTKY Č. 6 80 700 % zabí íjených cílových buně ěk 70 60 50 40 30 20 10 K 562 Daudi Raji NK abs 600 500 400 300 200 100 abs. počet NK 0 0 0 20 40 60 80 100 120 dny 1. dávka 2. dávka 3. dávka 1. dávka 2. dávka 3. dávka

Aktivita NK buněk u pacientů podání den E.G. J.K. K.R. K.H. 1 0 24 23 9 11 3 45 21 19 33 2 0 22 10 10 11 3 27 25 16 12 3 0 23 10 8 13 3 42 12 6 18 zdravý dárce 24 24 NK % zabitých buněk linie K562

Koncentrace léčiva v krvi pacientky E.G. po podání Dox-HPMA-HuIg (% injikované dávky) den doxorubicin 1. podání 1 69* 3 11 7 6 14 1 21 0.6 2. podání 1 N.D. 3 25 7 4 14 3 21 2 * % podané dávky

PŘEDBĚŽNÉ VÝSLEDKY U PACIENTŮ a podávání není doprovázeno nepříjemnými vedlejšími účinky b není nutná hospitalizace, léčivo se podává ambulantně c léčivo přetrvává v oběhu výrazně déle d je dosahováno dlouhodobé stabilizace onemocnění e kostní dřeň a imunitní systém nejsou poškozeny f část laboratorních testů včetně nádorových znaků je upravena dočasně nebo trvale, další část vykazuje významné zlepšení

Apoptosis immunogenic cell death non-immunogenic cell death

Imunogenní buněčná smrt

CRT is a Ca2+ - binding lectin chaperone that is mostly present in the ER lumen

Phagocytosis, processing, maturation, cross-presentation Translocation of CRT to cell surface Anthracyclins, GADD/PP1 inhibitors P elf2α elf2α PS turnover, apoptosis

HMGB1 = high mobility group box 1

(a) Immature DC (b) TLR4 Engulfed tumor cell in phagosome (c) MHC Class I Phagocytosis Scavenger receptors HMGB1 TLR4 Antigen processing and presentation Binding of HMGB1 to TLR4 MHC Class II Mature DC Tumor cell Released HMGB Cell surface -CRT Anthracyclines Dying tumor cell Anthracyclines

Expression of calreticulin (CRT) and heat shock protein (HSP) 110 on mouse EL4 T cell lymphoma a Expression induction local/systemic sample of anti-cancer immune response CRT HSP 110 Dox - HPMA HYD + - + Dox - HPMA AM - + + free Dox + - + c /- d

HuIg představuje nejlevnější, nejsnazší a všeobecně použitelné směrování. Proč?

HuIg - obsahuje přirozené protilátky, z nichž některé mohou reagovat s receptory nádorů - stimuluje produkci IL-12 a dalších protinádorových a anti-angiogenních cytokinů - zvyšuje aktivitu NK buněk - zvyšuje MW konjugátu (EPR efekt, pasivní akumulace)

Apoptóza je fyziologický proces. Předpokládá se, že u lidí takto hyne každý den několik milionů buněk

STRUKTURA PROLÉČIV ENZYMATICKY AKTIVOVANÉ PROLÉČIVO ph-senzitivní PROLÉČIVO CH 3 CH 3 H 2 C C H 2 C C C NH O CH 2 HC OH CH 3 x H 3 C HO C O Gly Phe Leu Gly NH y CH 3 CH 3 H 2 C C H 2 C C C NH O x CH 2 HC OH O OH CH 3 C O X NH N C y CH 2 OH O HO O OH O OMe OMe O OH H O O CH 3 OH CH 2 OH CH 2 OH O OH NH 2.HCl

Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg) day velikost nádoru velikost nádoru day velikost nádoru velikost nádoru conjugate A conjugate B conjugate A conjugate B 8 288 256 11 726 600 600 320 600 172 726 550 320 600 256 500 256 320 320 320 550 864 405 288 600 500 550 288 221 256 405 550 550 196 15 600 196 18 550 126 600 75 486 32 352 108 1080 14 196 172 600 14 365 787 446 108 446 14 1268 787 1186 14 75 0 75 196 6 0

Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg) day velikost nádoru velikost nádoru day velikost nádoru velikost nádoru conjugate A conjugate B conjugate A conjugate B 22 2025 405 25 3324 1352 1080 4 3726 0 1080 4 2304 14 1080 3240 1960 0 2025 172 5566 4400 256 0 2890 864 1080 0 1437 0 4 0 14 0 28 6534 1368 31 6613 2890 5400 256 9216 600 6050 0 8438 0 3468 0 12393 0 10571 6912 12152 9375 2816 2176 4050 3078 5292 0 10816 0 126 0 1099 0

Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg) day velikost nádoru velikost nádoru day velikost nádoru velikost nádoru conjugate A conjugate B conjugate A conjugate B 35 7497 650 38 10571 0 9464 0 8750 6613 12166 0 9688 0 6534 3564 2432 1014 1470 6200 ex 0 6050 0 ex 0 10140 0 ex 11300 ex ex ex ex 42 5808 0 45 17100 0 17298 0 7142 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 2601 ex 3179 ex 15857 ex ex ex 10206 ex ex ex ex ex ex

Růst nádoru (EL4) po léčbě konjugáty A a B (dávka 5 mg/kg) day velikost nádoru velikost nádoru day velikost nádoru velikost nádoru conjugate A conjugate B conjugate A conjugate B 49 10571 0 52 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 6613 ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex 56 ex 0 59 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex 0 ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex ex

Základní pravidla - během dvou - tří dnů po léčbě nádory přestávají růst - první náznaky jejich zmenšení jsou patrné během 5 6 dnů po léčbě - pokud nádory do deseti dnů nezaniknou nebo se alespoň nezmenší, už na léčbu reagovat nebudou a musí se uvažovat o další dávce

DC phagocytosis in vitro 300 250 * * * % of Control 200 150 100 50 0 EL-4 Spleen

6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 DC phagocytosis in vivo % of CFSE+Dendritic Cells