Možnosti použití syntetických polymerů při vývoji léčiv: od protinádorové ke genové terapii.

Transkript

1 Možnosti použití syntetických polymerů při vývoji léčiv: od protinádorové ke genové terapii. Projekt je řešen ve spolupráci ÚMH AV ČR s MBÚ AV ČR, University of Oxford a Krebsforschunginstitut Heidelberg

2 Obsah přednášky Úvod do problematiky polymerních nosičů biologicky aktivních molekul Polymerní konjugáty nízkomolekulárních léčiv Polymery pro diagnostiku Polymery při přípravě vektorů pro genové terapie Závěr a výhledy

3 Základní výzkum: Studium vztahu mezi strukturou, fyzikálně-chemickými a biologickými vlastnostmi makromolekul tvoří teoretický základ, ze kterého vycházíme při výběru konkrétní aplikace polymerů ve farmacii - návrhu struktur a syntéze nových generací léčiv (lékových forem) o jsou makromolekuly, syntetické polymery, jejich fyzikální a chemická struktura

4 Fyzikální a chemická struktura syntetických polymerů Lineární a větvená struktura Roubovaná struktura, polymerní síť a hvězdicová struktura makromolekul Kopolymery a terpolymery

5 Proč polymery? o umožní použití syntetických polymerů při přípravě léčiv a lékových forem? Klasické nízkomolekulární léčivo Polymerní formy léčiv řízené uvolňování Konc protrahovaný účinek čas [ hod] dny - rok řízené uvolňování cílený transport

6 Požadavky na ideální léčivo Biologicky aktivní látka (BAL, léčivo) je v lékové formě neaktivní, bez jakéhokoliv vlivu na organizmus (buňky imunitního systému, neukládá se v játrech, není vyloučeno ledvinami) v této formě je specificky dopraveno do místa požadovaného účinku (orgán, tkáň, buňka) aktivuje se pouze v místě požadovaného účinku, působí v požadované koncentraci působí po dobu optimální pro dosažení maximálního léčebného účinku léčivo, metabolity a všechny komponenty nosičového systému jsou po dosažení efektu eliminovány z organizmu

7 Vodorozpustné polymerní konjugáty s léčivy, polymerní diagnostika

8 Obecné schéma polymerního léčiva (H. Ringsdorf, Angewandte Macromoleculare hemie, 1975)

9 Schéma klasického polymerního léčiva (konkretizovaná struktura navržená J. Kopečkem) Léčivo (model Nap) Biodegradovatelná spojka (fosfát, cukr, oligopeptid, hydrolyticky štěpitelná spojka) Směrující struktura: sacharid, lektin, protilátka (IgG a fragmenty), hormon, specifický oligopeptid

10 Možnosti uvolňování léčiva z polymerního nosiče (b) (a) (c) évy a) Uvolnění v krevním řečišti b) Uvolnění ve tkáni po extravazaci c) Specifické uvolnění v cílových buňkách po endocytose évy

11 Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv Stabilita v průběhu transportu = chemická vazba léčiva na nosič Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) ílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

12 Schéma klasického konjugátu poly(hpma) s kancerostatikem doxorubicin (enzymatická aktivace léčiva) H2 O x O a H OH HO O O OH O O HO HO O OH O Enzymaticky degradovatelný oligopeptid: -GlyPheLeuGly- Místo enzymatického štěpení

13 Schéma hydrazonového konjugátu poly(hpma) s kancerostatikem doxorubicin (ph závislá hydrolytická aktivace léčiva) H2 O x O a H OH N H O OH N O H OH O H O OH H O 3 O O H H 3 2. Hl Jednoduchá vazba nebo spacer Místo hydrolytického štěpení

14 Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) ílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

15 Princip enzymaticky řízeného uvolňování léčiva z polymerního nosiče polymer Gly-Phe-Leu-Gly--- Spojka (oligopeptid) NAp Model léčiva, léčivo (DOX) P 4 P 3 P 2 P 1 P 1 P 1 P 2 P 3 Substrát (oligopeptid) S 4 S 2 S 1 S 2 S 3 S 3 S 1 Aktivní místo enzymu (proteázy) ENZYM

16 Uvolňování DOX z polymerů při inkubaci PHPMA-X-DOX konjugátů se směsí lysosomálních enzymů -tritosomů GLFG GFLG GLG GFG GG % v o ln é h o DOX č as, h STRUKTURA % UVOLNĚNÉHO DOXORUBIINU V SÉRU 3 h 6 h 24 h -GFLG GLFG GG

17 Uvolňování DOX z hydrazonových polymerů inkubovaných ve fosfátových pufrech o různém ph ph DOX releas ed, % GFLG GLG Gly-Gly Gly Aminobenzoic Acap 20 ph Time, h

18 Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) ílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou) Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

19 Princip pasivního směrování akumulace polymerů v pevných nádorech (EPR efekt) (H. Maeda a kol.) Normální tkáň Nádorová tkáň Málo propustný endothel Porézní kapilární systém Fungující lymfatický systém Těsné kapiláry nebo chybějící lymfatický systém

20 Distribuce poly(hpma) v myších (EPR efekt), Sarkom 180 (melanom B16F10) (i.v. injekce polymeru) Accumulated Polymer, %/g of mice Tumour Spleen Kidney Mus cle Liver Skin Blood

21 Biodistribuce poly(hpma) nosiče v kryse (EPR) s prostatickým AT1 nádorem (h 0, M w = HPMA-131 I : D (h) 0, M w = HPMA-131 I : D

22 Konjugáty umožňující pasivní směrování do nádorů Nedegradovatelné polymerní nosiče (limit Mw ~ g/mol) Micelární nosiče léčiv PEG PEG PEG Multiblokové biodegradovatelné nosiče Biodegradovatelné vysokomolekulární polymerní nosiče

23 Struktura micel tvořených konjugátem PHPMA- DOX-oleyl ve vodě H 3 x H OH N y OH z* 5 5 M w (pol) = 32 kda I = 1.8 M w (mic) = 170 kda [DOX] = 7 wt% [oleyl] = 3.5 %mol d mic = 22 nm O O HO O OH OH O H O H H 7 7 O O 5 Hydrofobní substituent; oleyl, cholesteryl, etc. OH 3 + l

24 Polymerní micela na bázi kopolymeru poly(ethylenglykol-b-allylglycidylether) Vodorozpustný polymer vyloučitelný z organizmu, blokový kopolymer (hydrazid) (4-5 nm) DOX, ph ~7.4 ph ~ 5 Supramolekulární polymerní micela s hydrazonovou vazbou vázaným DOX (~ nm) O H 3 O n O O m OH S 2 H 3 O O n O OH m OH H O S H N N O OH ph senzitivní vazba O O OH O O OH 2

25 Syntéza roubovaných konjugátů s řízeným uvolňováním Dox a řízenou biodegradací x H OH y 5 N S S + x H OH Boc y 5 Gly Phe Leu Gly z A) G FL G Dox=N 2 G G FL Dox=N N=Dox N=Dox G FL G N=Dox Boc 2 x H OH S y 5 S N + x H OH Boc y 5 Gly Phe Leu Gly z B) 2 S S N=Dox S S N=Dox 2 N=Dox S S N=Dox Boc Dox=N Dox=N l SH 3

26 Eliminace polymerních léčiv z krevního řečiště a akumulace do nádoru u B/6 myší nesoucích myší lymfom EL4. Porovnání s volným léčivem. Eliminace z oběhu Akumulace v nádoru 20 Dox z injekované dávky (%) Dox 14 lineární 12 roubovaný 10 micela (chol) ug Dox / g nadoru Dox lineární roubovaný micela (chol) čas (h) čas (h)

27 Fluorescenční microscopie buněk myšího EL4 lymphomu inkubovaných s micelami HPMA-hydrazone-DOX, PEG- PAGE-DOX a roubovanými konjugáty, 10 μg DOX equiv/ml, 24 h, 37 º Micela, oleyl Micela, cholest Micela, PEG-AGE Lineární hydrazon Graft, Roub, S-S Roub, GFLG Micelle, PEG-AGE, Hoechst 33342

28 Aktivní směrování internalizace polymerních léčiv v buňkách Uvolnění léčiva (a) hydrolýza v endosomech, (b) enzymolýza v sekundárních lysosomech lysosom primární endosom ph 5-6 Jádro sekundární lysosom, ph 5, enzymy

29 Schéma klasického protilátkou směrovaného konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace) H2 O x O a O b H OH HO O O OH O O HO HO O OH O Oligopeptid -GlyPheLeuGly-

30 Schéma hvězdicového protilátkou směrovaného konjugátu doxorubicinu (enzymatická aktivace) S- --- H OH Gly Phe Le u Gly DOX X

31 FAS analýza protilátkou směrovaných konjugátů Směrování (a) Nespecifickou protilátkou (b) Specifickou protilátkou BL1 cells + higg-p-dox BL1 cells + B1 mab-p-dox classic structure BL1 cells + B1mAb-P-Dox star structure 3813 cells + higg-p-dox RL34 mab-p-dox classic structure 3813 cells + RL34 mab-p-dox star structure

32 Hlavní požadavky kladené na polymerní nosiče léčiv Stabilita v průběhu transportu (chemická vazba léčiva na nosič) Řízené uvolnění léčiva z nosiče (chemická hydrolýza, enzymolýza) ílený transport k nádoru, nádorovým buňkám (pasivní směrování pomocí EPR efektu, aktivní směrování směrující strukturou Eliminace nosiče z organizmu (degradovatelný nosič, micelární nosič)

33 Schéma degradace roubovaného konjugátu (degradace v reduktivním prostředí buňky) 2 DOX= N S S S S 2 N S S =DOX Degradace v cílové buňce DOX DOX N =DOX N =DOX DOX DOX =N HN H 2 N Vysokomolekulární léčivo s akumulací v pevném nádoru Nížemolekulární fragmenty vyloučitelné z organizmu

34 Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou GFLG po inkubaci s kathepsinem B c(kathepsin B) = mol/l Degradace roubovaného PHPMA konjugátu se spojkou -S-S- po inkubaci s glutathionem c(glutathion) = mol/l M w (x10-3 ) Vylučovací mez polymeru ledvinami Mw (x10-3 ) time (h) time (h)

35 In vivo aktivita polymerních léčiv studovaná na modelových nádorech u myší (růst nádoru, doba přežití, váha) (a) ochranný režim aplikace léčiva (aplikace 1,3,5,7,9 den po inokulaci nádoru) (b) terapeutický režim aplikace léčiva ( první aplikace po vytvoření nádoru, nejčastěji po 8 11 dnech od inokulace)

36 Směrované PHPMA-DOX konjugáty, výsledky in vivo testů (Balb/c myši, BL1 leukemie i.p., léčba i.v.), terapeutický režim podání a) jedna dávka 5mg/kg, (hv 11 den) b) dvě dávky 11 a 14 den, 2x5mg/kg (kl) Therapeutický režim, doba přežití 100 % přežívajících m yší Kontrola 40 PHPMA-Dox-IgG 20 PHPMA-DOX-mAb kl PHPMA-Dox-mAb hv DEN

37 Léčba 3H/HeN myší s 3813 lymfomem (1x10 5, s.c.) doxorubicinem (5x2.5 mg/kg) nebo polymer-dox konjugáty (ekvivalent 5 mg/kg DOX) aplikovanými 8 a 11 den (terapeutický režim podání) 600 Tumor size [mm sq.] ontrol Dox P-Dox lassical ad71 [2mAb] Surviving of experimental mice (%) ontrol Dox P-Dox lassical ad71 [2mAb] Days Days

38 Lineární konjugáty PHPMA-DOX s hydrazonovou vazbou: výsledky in vivo testů, nesměrovaný lineární konjugát - terapeutický režim podání Myší T-buněčný lymfom EL4, myši 57BL/6, léčba i.p. 10 nebo 10 a 20 den Hydrolyticky štěpitelná vazba, ph závislá rychlost štěpení veliko st n ád o ru ( mm2) Růst nádoru dny % přežívajících myší Přežívání myší 0 20 dny Kontrola B531-25mgDox/kg x1 B mgdox/kg x2 B mgdox/kg x1

39 Vysokomolekulární roubované polymerní konjugáty DOX (Hydrazon) In vivo protinádorová aktivita 10 5 buněk T-buněčného lymfomu EL4 inokulovaných myším B/6 v den 0. Léčba: den 11. i.v., jednoduchá dávka 15 mg DOX ekv./kg přežívání myší, % onjugate A onjugate B linear ontrol dny A konjugát s enzymatickou degradací B konjugát s reduktivní degradací

40 Vysokomolekulární micelární konjugáty PHPMA-DOX Doba přežití B/6 myší s inokulovaným EL-4 T-buněčnýmlymfomem(s.c.) léčených 8 (a příp. 12) den po inokulaci jednou nebo dvěma dávkami léčiva Přežití B/6 myší počet myší % Dny Oleyl 1x10 Oleyl 2x5 holesteryl 1x10 holesteryl 2x5 linear 1x15 ontrols 0

41 Přežití 57BL/6 myší s retransplanovanými buňkami (10 5 ) myšího lymfomu EL-4, bez následné léčby Původní léčba: hydrazonový konjugát 120 % přežívajících myší ontrol 25 mg/kg 2 x 25 mg/kg 75 mg/kg Dny

42 Kombinovaná radio a chemoterapie

43 Kombinovaná radio a chemoterapie Dunningova AT1 nádoru prostaty u krys. Podání volného Dox, polymerního Dox (PK1) a protilátkou (IgG) směrovného polymerního konjugátu Dox bylo kombinováno s radioterapií (2 Gray/dávka) Samotná chemoterapie Kombinovaná radiochemoterapie

44 Kombinovaná radio a chemoterapie Dunningova AT1 nádoru prostaty u krys. Podání volného Dox, polymerního Dox (PK1) a protilátkou (IgG) směrovného polymerního konjugátu Dox bylo kombinováno s radioterapií (2 Gray/dávka) Kombinovaná terapie Váha krys v průběhu terapie

45 Využití rozpustných polymerních konjugátů v diagnostice

46 Konjugát gadolinia pro diagnostiku (angiografii) magnetickou resonancí Hmotová spektroskopie: H OH (5.19±0.28) %váh. Gd Kontrastní látka: MW: 24.8 kda H H OH 0.5 M (78 mg/ml Gd) M w /M n : 1.92 H OH OH OH Gd Komplex je stabilní (neuvolňuje Gd) minimálně po dobu 2 měsíců inkubace

47 ytotoxicita konjugátů gadolinia (lidské fibroblasty, trypan blue, kontrola Gd-DTPA (Magnevist) od firmy Schering) Doba inkubace 50,00 Dead human fibroblast cells (MSU) [%] 45,00 40,00 24 hodin 48 hodin 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 1 Kontrola PHPMA-Gd Gd-DTPA (1mM) (0.1mM) 0,00 Kontrola PHPMA-Gd Gd-DTPA (1mM) (0.1mM) 1

48 MR-Angiografie, komplex poly(hpma)-gd Krysa, 1.5 T MR scanner: 0.02 mmol/kg HE45

49 MR-Angiografie u krysy, porovnání komplexu poly(hpma)-gd s Gd-DTPA, 1.5 T MR scanner: 0.02 mmol/kg poly(hpma)-gd Magnevist firmy Schering *

50 ZÁVĚRY I. Vodorozpustné polymerní nosiče léčiv mohou najít významné uplatnění při přípravě na nádor směrovaných kancerostatik. Polymerní cytostatika mají minimální vedlejší účinky, nepoškozují imunitní systém jako klasická cytostatika a vykazují, na rozdíl od klasické chemoterapie, kromě výrazně zlepšeného chemoterapeutického efektu i efekt imunostimulační. Tento efekt se uplatňuje u různých typů nádorů (u myší i u lidských pacientů). Kombinací chemoterapie s radioterapií je možné terapeutický účinek polymerních léčiv zvýšit. Polymerní nosičové systémy mají širokou škálu použití i v jiných oblastech medicíny, např. v diagnostice (MR zobrazení).

51 Syntetické polymery jako součást vektorů pro genovou terapii

52 Požadavky na systém pro dopravu genu účinný v in vivo podmínkách 1. Stabilita v krevním řečišti, minimální interakce s buňkami imunitního systému 2. Extravazace do cílové tkáně 3. Interakce s receptory cílových buněk 4. Endocytoza 5. Únik z endosomu do cytoplasmy 6. Transport k buněčnému jádru 7. Účinná transfekce a produkce aktivního proteinu

53 Systémy pro in vivo dopravu genu Biodegradovatelné nanočástice Kationtové liposomy Kationtové lipidy (lipoplexy) Interpolyelektrolytové (polykationtové) komplexy DNA (polyplexy) Virální systémy: retroviry, polymerem modifikované rekombinantní adenoviry

54 Interpolyelektrolytové komplexy (IPE) polykationtů s DNA plasmidy (polyplexy)

55 Tvorba komplexu polykation-dna /- = 1 : /- > /- >> Agregace částic Izolované komplexy Směs polymeru s komplexem +

56 Polykationty použité pro přípravu IPE a) Primární amíny b) Terciární amíny c) Kvarterní ammoniové soli O O ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 N N H 3 N H 3 N 2 H 3 H 3 l - l - MAEDA 2 DMAEM DMAEMam TMAEM TMAEMam ( ) 6 HN H MAGEDA 2 MAGGHMDA 2 PLL

57 Multifunkční polykationtový vektor pro dopravu genu připravený kondensací DNA s blokovými kopolymery polykationtů a hydrofilních polymerů plasmid ph 7,4 stabilní při dopravě Fusogení molekula (peptid) Směrující jednotka Hydrolyticky labilní vazba (při ph < 6) Uvnitř buňky při ph < 6 se plasmid uvolní z endosomu

58 Stabilizace komplexů DNA/PLL hydrofilním polymerem Blokový nebo roubovaný kopolymer + +/- = 1 : 1 DNA plamid poly(tmaem-b-hpma) Biodegradovatelná spojka: oligopeptid, hydrazon, disulfid

59 Stabilita polykationtového komplexu DNA stabilizovaného hydrofilním PHPMA kopolymerem při inkubaci s DNAzou (fosfátový pufr, ph 7.4, 37 ) 0,08 změna absorbance (260 nm) 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0, čas, min DNA DNA/roub DNA/blok

60 Asociace polymerem (phpma) modifikovaného komplexu pll/plasmid DNA s myšími peritoneálními makrofágy v 50% telecím séru Fluorescence ,5 1,5 3 Doba inkubace (h) DNA/PLL DNA/PLL/pHPMA1 DNA/PLL/pHPMA2

61 Povrchová úprava IPE pomocí HPMA kopolymeru, využití pro cílenou dopravu IPE pomocí aktivních proteinů nebo oligopeptidů 2 2 ONp ONp ONp ONp ONp ONp 2 2 ONp 2 2 ONp ONp 2 + ONp 2 protein (IgG, transferin) oligopeptid

62 Průnik do buněk K562 (lidská leukemie) a účinnost transfekce komplexů pll/dna (gen kódující ß-Gal). Směrování transferinem. Průnik PL/DNA komplexu do buněk, vliv směrování Účinnost přenosu genu v in vitro podmínkách průnik do buněk, % svět. jednotky čas, min pll/dna phpma-pll/dna phpma-tf-pll/dna 0 pll/dna phpma-pll/dna phpma-tf-pll/dna

63 Virální systémy, rekombinantní adenoviry

64 Adenovir: Potenciální vektor pro nádorovou genovou terapii Požadavky na intravenozní aplikaci: Virus se nesmí vázat na erythrocyty a neutrofily Nesmí napadat makrofágy a buňky RES Nesmí docházet k neutralizaci protilátkami a komplementem Nesmí docházet k záchytu viru v jaterních buňkách Musí být schopen specifického směrování k vybraným buňkám (retargeting) Receptory: coxsackie a adenovirus receptory (AR), receptory pro fibre knob ligandy

65 Povrchová modifikace viru hydrofilním polymerem Aminoskupina Reaktivní esterová skupina + Semitelechelický monovalentní polymer Virus + Klasický multivalentní polymer se směrující skupinou Modifikovaný virus

66 Osud povrchově modifikovaného viru v cílové buňce Extracelární prostředí Přesměrovaný virus Ochranný polymer Prostředí v buňce endosom adenovirová kapsida ph < 6 GSH Směrující struktura Degradovatelné vazby Buněčná membrána Uvolnění DNA

67 Příklad HPMA kopolymerů určených pro povrchovou úpravu virálních nosičů genu O O ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 H OH N H OH N l l ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 S S Reduktivně štěpitelná vazba (v cytoplasmě) S S S S ( ) 2 ( ) 2 ( ) 2 N S S N S S EGF

68 Modifikace virů kopolymerem HPMA obsahujícím směrující skupinu Nemodifikovaný virus Polymerem modifikovaný virus

69 Množství nemodifikovaných a polymerem modifikovaných virů v krvi po 30 min od aplikace (% vstupní dávky, myši BALB/) % Input Dose x10E9 Virus 1x10E10 Virus 1x10E11 Virus 4x10E11 Virus 6x10E11 Virus 1x10E9 pcvirus 1x10E10 pcvirus 1x10E11 pcvirus 4x10E11 pcvirus 6x10E11 pcvirus Modifikace viru polymerem a vhodná dávka vede ke snížení poměru počtu virů v játrech vers. krev z poměru >2000 na <1.

70 Polymerem modifikovaný nesměrovaný adenovirus Ad5-GFP ztrácí schopnost účinně infikovat buňky (A549 plicní nádor), připojením směrující struktury se aktivita specificky obnoví Nemodifikovaný virus Polymerem modifikovaný virus Virus retargetovaný pomocí bfgf Asociace s buňkami (FAS) Transgenní exprese genu Ad5-GFP

71 Retargeting adenoviru (Ad5-luc) pomocí EGF (epidermální růstový faktor) Vaginální nádor A431 Ovariální nádor SKOV Luciferase (RLU) Luciferase (RLU) virus pc-virus EGF-pc-virus 100 virus pc-virus EGF-pc-virus

72 Exprese polymerem modifikovaného viru Ad5-GFP směrovaného humanizovanou protilátkou herceptinem Buňky Virus PHPMA modifikovaný virus Herceptinem retargetovaný virus SKOV3 Ovariální nádor K562 Lidská leukemie

73 Závěry II Polykationty tvoří dostatečně malé a stabilní komplexy s DNA a plasmidy Stabilitu polykationt/dna komplexu je možné ovlivňovat strukturou polykationtu a modifikací povrchu komplexu hydrofilním polymerem Účinnost transfekce IPE komplexů může být ovlivňována změnami struktury komplexu a zavedením funkčních molekul (směrování) Modifikace adenoviru hydrofilním HPMA kopolymerem vede k prodloužené cirkulaci viru v krvi a až k 1000 násobné redukci exprese genu (poklesu nespecificke infektivity). Expresi genu je možné obnovit specifickým směrováním polymerem modifikovaného viru pomocí specifických oligopeptidů i proteinů (transferin, herceptin). Specifita směrování virálního vektoru je výrazně závislá na struktuře směrující molekuly IPE i polymerem modifikované viry jsou slibnými vektory s potenciálním využitím v genové terapii

74 Poděkování Všem spolupracovníkům Oddělení biolékařských polymerů, ÚMH AV ČR (návrhy struktur, syntéza všech konjugátů a jejich fyzikálně chemická charakterizace) MBÚ AV ČR, kolektivu vedenému prof. RNDr. B. Říhovou, DrSc., (biologické vlastnosti polymerních směrovaných léčiv) Krebsforschunginstitut Heidelberg, kolektivu Dr. P. Peschkeho (biologické hodnocení polymerních diagnostik a terapeutik) University of Oxford, kolektivu prof.l.w. Seymoura (virální a nevirální vektory pro genovou terapii) Poděkování GA ČR, AV ČR, grantu EU a firmě ZENTIVA a.s. za finanční podporu výzkumu

75

76