Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta. Katedra buněčné biologie

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra buněčné biologie Imunogenní smrt nádorových buněk způsobená volným a na polymer navázaným doxorubicinem Diplomová práce Martina Kabešová Vedoucí práce: RNDr. Lubomír Kovář Ph.D. Mikrobiologický ústav AV ČR, v. v. i. Praha 2010

2 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem práci vypracovala samostatně s použitím uvedených zdrojů a pod vedením RNDr. Lubomíra Kováře, Ph.D. Souhlasím s jejím eventuálním zveřejněním v tištěné nebo elektronické podobě. V Praze dne 25. srpna Kabešová Martina Ráda bych poděkovala svému školiteli RNDr. Lubomíru Kovářovi, Ph.D. za odborné vedení, trpělivost a cenné rady. Dále děkuji celému kolektivu laboratoře nádorové imunologie na Mikrobiologickém ústavu AV ČR, v. v. i. za příjemné pracovní prostředí a poskytnutou pomoc. Velký dík patří také prof. Ing. Karlu Ulbrichovi, DrSc. a celé jeho laboratoři na Ústavu makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. za přípravu polymerních léčiv. Největší poděkování patří hlavně mé rodině a přátelům za podporu a pomoc během celého mého studia i mimo něj. 1

3 Abstrakt Imunogenní smrt nádorových buněk způsobená volným a na polymer navázaným doxorubicinem Polymerní vodorozpustné nosiče léčiv založené na N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA) byly vyvinuty tak, aby omezily nežádoucí vedlejší účinky volných, systémově působících cytostatických léčiv. Konjugáty na bázi HPMA se samy pasivně akumulují v nádorové tkáni díky efektu zvýšené propustnosti nově vznikajících cév a omezené tvorbě lymfatické drenáže v nádoru (EPR, Enhanced Permeability and Retention Effect). Aktivní akumulace můžeme docílit tím, že na polymerní kostru navážeme směrující strukturu, která rozpoznává nádorově specifický ligand. Konjugace volného doxorubicinu na polymerní nosič HPMA podstatně snižuje jeho nespecifické vedlejší účinky in vivo při zachování efektivního protinádorového účinku in vitro a in vivo. Mimo přímé cytotoxické účinky na nádorové buňky mají HPMA kopolymery s doxorubicinem i imunostimulační vlastnosti a dokážou navodit dlouhodobou protinádorovou imunitu u léčených myší Nedávné studie ukázaly, že volný doxorubicin indukuje v nádorových buňkách imunogenní apoptózu. Takto zabité buňky umírají buněčnou smrtí, která nese charakteristické znaky apoptózy, ale jsou schopny aktivovat imunitní systém a vyvolat tak protinádorovou imunitní reakci. Tento jev byl popsán jako klíčový pro rozvoj léčbou indukované protinádorové imunity. Zjistili jsme, že znaky imunogenní apoptózy jsou přítomny pouze u buněk vystavených působení volného doxorubicinu nebo konjugátu, který nese doxorubicin navázaný pomocí ph senzitivní hydrazonové vazby. Naproti tomu konjugát s doxorubicinem vázaným pomocí amidické enzymaticky štěpitelné vazby nevyvolává v nádorových buňkách imunogenní apoptotickou smrt. V pokusech in vivo jsou však oba typy konjugátů velmi efektivními induktory protinádorové imunity. Dále jsme pozorovali, že buňky byly více fagocytovány dendritickými buňkami, pokud byly předem inkubované jak s volným, tak i s na HPMA kopolymer navázaným doxorubicinem. Oba typy konjugátů dokážou tedy stimulovat protinádorovou imunitu, ačkoli pouze konjugát s doxorubicinem navázaným ph senzitivní vazbou vyvolává imunogenní apoptózu. Konjugát s amidicky vázaným doxorubicinem však mění sacharidové složení povrchových glykoproteinů nádorových buněk. Na buňkách inkubovaných s tímto konjugátem se objevuje ve větší míře molekula CD43 poskytující vazebné místo galektinu-1, který spouští v buňce apoptózu. Ukázali jsme, že buňky vystavené působení konjugátu s amidicky vázaným doxorubicinem jsou citlivější k apoptóze vyvolané galektinem-1 více než buňky, které byly vystaveny volnému doxorubicinu nebo konjugátu s hydrazonově navázaným léčivem. Klíčová slova: doxorubicin, polymerní léčiva, HPMA, imunogenní buněčná smrt, calreticulin, apoptóza, HMGB1, galektin-1 2

4 Abstract Immunogenic cancer cell death triggered by free and polymer-bound doxorubicin Water-soluble polymeric drug carriers based on N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide (HPMA) have been developed to avoid undesirable side-effects of systemically active cytostatic drugs. Conjugates based on HPMA copolymer passively accumulate in tumor tissue of solid tumors due to the effect of enhanced vascular permeability and retention effect (EPR effect). Active accumulation can be achieved by binding of targeting structure recognising tumor-specific receptors to the polymeric carrier. Conjugation of free doxorubicin to HPMA polymeric carrier significantly reduces its nonspecific side effects in vivo by maintaining effective antitumor activity in vitro and in vivo. Besides direct cytotoxic effect on tumor cells, HPMA conjugates with bound doxorubicin possess immunostimulatory properties and induce long-lasting anti-tumor immunity in cured mice. Recent studies have shown that free doxorubicin induce immunogenic apoptosis in tumor cells. Those cells are dying by cell death which possesses characteristic markers of apoptosis but these cells are able to activate the immune system and thus induce effective anti-tumor immune response. This phenomenon has been described as crucial for a development of treatment-induced antitumor immunity. We found that the immunogenic characteristics of apoptosis are present only in cells exposed to free doxorubicin or conjugate which doxorubicin bound via hydrasone, ph-sensitive bond. By contrast, conjugate with doxorubicin bound to HPMA carrier via enzymatically degradable, amide bond does not induce immunogenic apoptosis in tumor cells. However, in in vivo experiments are both types of conjugates very effective inducers of antitumor immunity. Furthermore, we observed that cells were more phagocytosed by dendritic cells when incubated with both free or HPMA copolymer bound doxorubicin. That means that both types of HPMA conjugates are able to stimulate antitumor immunity, although only the conjugate with doxorubicin bound ph-sensitive bond can induce immunogenic apoptosis. On the other hand conjugate containing amide bound doxorubicin changes saccharide composition of surface glycoproteins on cancer cells. Cells incubated with this conjugate express increasing level of CD43 molecule, providing a binding site for galectin-1, which triggers cell apoptosis in tumor cell. Thus we have also shown that cells exposed to conjugates with amide bound doxorubicin are more sensitive to apoptosis induced by galectin-1 than the cells exposed to free or hydrazone bound doxorubicin. Key words: doxorubicin, HPMA, polymeric drug, immunogenic cell death, apoptosis, calreticulin, HMGB1, galectin-1 3

5 OBSAH OBSAH ÚVOD LITERÁRNÍ PŘEHLED Nádorová onemocnění a role imunitního systému Imunoterapie Klasická chemoterapie s nízkomolekulárními léčivy Chemoterapie s využitím vysokomolekulárních nosičů léčiva Syntetický polymerní nosič N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) Polymerní HPMA konjugáty s navázaným antracyklinovým léčivem doxorubicinem HPMA konjugáty amidicky navázaným doxorubicinem HPMA konjugát s hydrazonově navázaným doxorubicinem Vliv HPMA homo a kopolymeru na imunitní systém Imunostimulační vlastnosti antracyklinů Imunostimulační vlastnosti doxorubicinu vázaného na kopolymer HPMA Imunogenní apoptotická smrt nádorových buněk Calreticulin Heat-shock proteiny HMGB ATP MATERIÁL A METODY Roztoky Volný doxorubicin a polymerní konjugáty Příprava léčiv pro inkubaci in vitro Aplikace léčiv in vivo Protilátky Protilátky použité pro imunoblot Protilátky použité pro analýzu buněk na průtokovém cytometru Buňky a experimentální zvířata Buněčné linie Kultivace buněčných linií Pasážování buněk

6 3.4.4 Inkorporace [ 3 H] tymidinu Experimentální zvířata Nesterilní izolace splenocytů Sterilní izolace splenocytů pomocí Histopaque Izolace dendritických buněk ze slezinných buněk pomocí pozitivní magnetické separace Značení buněk CFSE Izolace proteinů z buněčného homogenátu Izolace proteinů z buněčného supernatantu Izolace membránových proteinů Izolace komponent plasmatické membrány pro HPAEC-PAD analýzu sacharidů Stanovení množství proteinu pomocí kitu BCA Detekce molekul pomocí western blotu Příprava polyakrylamidových gelů Elektroforéza SDS PAGE Western blot Imunoblot Průtoková cytometrie Životnost EL4 buněk po inkubaci s léčivy Analýza vazby lektinů Analýza vazebné aktivity galektinu Analýza buněčné smrti indukované galektinem Detekce povrchových molekul buněk po inkubaci s volným doxorubicinem či HPMA konjugáty Fagocytóza nádorových buněk a splenocytů in vitro Fagocytóza nádorových buněk EL4 in vivo VÝSLEDKY Vliv doxorubicinu a HPMA konjugátů na proliferaci a životnost nádorových EL4 buněk Změny na plazmatické membráně buněk inkubovaných s volným doxorubicinem či HPMA konjugáty Přítomnost calreticulinu na povrchu buněk Přítomnost proteinu ERp57 na povrchu EL4 buněk

7 4.2.3 Fosforylace eukaryotického translačního faktoru eif2α Změny povrchové glykosylace vyvolané působením HPMA konjugátů Sacharidové složení povrchu buněk Kvalitativní změny povrchových glykoproteinů po inkubaci EL4 buněk s HPMA konjugáty Změny exprese povrchových glykoproteinů po inkubaci EL4 buněk s HPMA konjugáty Vazba galektinu-1 na EL4 buňky inkubované s HPMA konjugáty Galektinem-1 vyvolaná apoptóza EL4, Jurkat buněk a splenocytů vystavených HPMA konjugátům Exprese povrchové molekuly CD47 u EL4 buněk Uvolňování HMGB1 do supernatantu Analýza fagocytózy dendritickými buňkami Fagocytóza buněk in vitro Fagocytóza nádorových EL4 buněk in vivo DISKUZE SOUHRN PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY PŘÍLOHY

8 Seznam použitých zkratek ABC ATP-binding cassette, ABC transportér ADCC antigen dependent celular cytotoxicity APC allofykocyanin APC buňka antigen prezentující buňka APS persíran amonný ASC apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain ATCC American Type Culture Collection ATP adenosin trifosfát Bap31 B-cell receptor-association protein 31 BCA bicinchoninová kyselina Bcl-2 B-cell lymphoma 2 protein BSA bovine serum albumin, hovězí sérový albumin CCL ligand CC rodiny chemokinů CD cluster of differentiation CFSE karboxyfluorescein sukcinimidyl ester CRT calreticulin Da Dalton D-MEM Dulbecco s modified Eagle s medium DMSO dimethylsulfoxid Dox doxorubicin DTT dithiotreitol EGTA ethylenglykol-di-(2-aminoethylether)-tetraoctová kyselina eif2α eukaryotický translační iniciační faktor 2α EPR efekt enhanced permeability and retention effect, efekt zvýšené propustnosti a zádrže ER endoplazmatické retikulum ERK extracellular signal-regulated kinases ERp57 protein p57 endoplazmatického retikula FACS fluorescence-activated cell sorting, fluorescenční průtoková cytometrie FasL Fas ligand FcR Fc receptor FCS fetal calf serum, fetální telecí sérum GADD 34 growth arrest and DNA damage inducible gene 34 HACBP high-affinity calcium-binding protein HEPES kyselina 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonová HMGB1 high-mobility group box 1 protein HPAEC-PAD high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detection HPMA N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid HRP horseradish peroxidase, křenová peroxidáza HSP heat shock protein, proteiny tepelného šoku IFN interferon Ig imunoglobulin IL interleukin JNK Jun N-terminal kinase, c-jun N-terminální kináza LAK lymphokine-activated killers, lymfokiny aktivované zabíječské buňky LRP1 LDL-receptor-related protein 7

9 mab monoklonální protilátka MDR multidrug resistance, mnohočetná léková rezistence MHC major histocompatibility complex Na 2 EDTA sodná sůl kyseliny ethylendiamin-n,n,n',n'-tetraoctové NK natural killer NKG2D aktivační receptor NK buněk NLRP3 NOD-like receptor 3 OXP oxaliplatina P2RX7 P2X purinoceptor 7 PBS phosphate buffered saline, fosfátový pufr PDI protein disulfid izomeráza PERK endoplasmic reticulum-sessile kinase PMSF fenylmethansulfonyl fluorid PP1 protein fosfatáza 1 PPR pattern recognition receptor RAP recombinant receptor associated protein RPMI Roswell Park Memorial Institute medium SDS dodecyl sulfát sodný SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis sirna small interfering RNA SIRPα signal-regulatory protein alpha SNAP23/25 synaptosome-associated protein of 23/25 kda SREC-I scavenger receptor expressed by endothelial cells-i TBS tris-(hydroxymethyl)-aminomethan pufr TEMED N, N, N, N - tetramethylethylendiamin TGF transforming growth factor, transformující rustový faktor TIL tumor infiltrating lymphocyte, nádor infiltrující lymfocyty TLR Toll-like receptor TNF tumor necrosis factor, nádory nekrotizující faktor TRAIL TNF-related apoptosis inducing ligand VAMP1 vesicle-associated membrane protein 1 Z-VAD-fmk carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-[o-methyl]-fluoromethylketone, inhibitor kaspáz 8

10 1 ÚVOD Nemocí, která ročně zabije nejvíce lidí po celém světě, je nádorové bujení. Velká část výzkumné práce v ČR i ve světě se proto zaměřuje na léčbu nádorových onemocnění. Neustále jsou vyvíjeny nové a nové možnosti odstranění nádorových buněk pomocí chemoterapie, vylepšuje se technika v oblasti lokální terapie jako je chirurgická léčba a radioterapie. Hledají se nejvhodnější kombinace těchto terapeutických postupů s cílem co nejúčinněji odstranit primární nádor i metastázy s minimálním dopadem na celkové zdraví onkologického pacienta a kvalitu jeho života. Přes veškeré úsilí a moderní techniky není možno vyléčit všechny onkologické pacienty. Dalším problémem zůstává jak zabránit relapsu nádoru, kdy se pacient zdá být i dlouhá léta vyléčen, ale po čase se objeví nádor a metastázy znovu. Již dlouho je známo, že imunitní systém hraje důležitou roli při vzniku, rozvoji i odstranění nádorového onemocnění. Právě aktivace imunitního systému a jeho přirozené schopnosti rozpoznávat a ničit transformované buňky může být významným přínosem v léčbě nádorů, které neodpovídají na klasickou léčbu, nebo může přispět k odstranění posledních zbytkových nádorových buněk a zabránit tak relapsu onemocnění. Bohužel klasická léčba chemoterapeutiky využívá především systémově působící cytostatická léčiva mající celou řadu závažných negativních účinků, které vedou ke snížení obranyschopnosti organizmu. Volná nízkomolekulární léčiva často cytotoxicky působí na všechny rychle se dělící buňky, včetně buněk imunitního systému. Řešením může být navázání léčiva na vysokomolekulární nosič, který se sám o sobě specificky akumuluje v solidním nádoru pasivně díky zvýšené propustnosti nádorových cév a omezené lymfatické drenáže nádorové tkáně (EPR efekt). Pro aktivní směrování těchto léčiv se může na nosič kromě léčiva navázat i směrující struktura, která je vybrána tak, aby rozpoznávala specifické molekuly na nádorových buňkách. Léčivo je tak dopraveno nádorové tkáně a díky intratumorálně degradovatelné vazbě mezi nosičem a léčivem je léčivo specificky uvolněno v nádorových buňkách. Vysokomolekulární nosiče léčiv musí být pochopitelně biokompatibilní a neimunogenní. Tyto vlastnosti a funkce splňují syntetické vodorozpustné polymery založené na N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA). Antracyklinové léčivo doxorubicin navázané na polymerní nosič HPMA má výrazně nižší negativní vedlejší účinky a lepší terapeutický efekt než samotný doxorubicin díky cílenému působení pouze v nádorové tkáni. Vedle přímých cytotoxických účinků proti nádoru vykazují HPMA konjugáty doxorubicinu také významný imunomodulační účinek. Tyto konjugáty doxorubicinu nejen, že nepoškozují imunitní systém pacienta, ale zároveň dokážou stimulovat protinádorovou imunitní reakci. Dlouho nebylo známo jaký mechanizmus za tímto imunostimulačním účinkem HPMA konjugátů stojí. Možné vysvětlení přinesly publikace, které popisují imunogenní vlastnosti buněk vystavených působení antracyklinových cytostatik, oxaliplatiny (OXP) nebo ionizujícímu záření (gama nebo ultrafialové C záření). Diplomová práce je zaměřena na analýzu imunogenních vlastností nádorových buněk po inkubaci s volným nebo na polymer HPMA vázaným doxorubicinem. V práci jsou charakterizovány účinky dvou hlavních zástupců polymerních HPMA léčiv s doxorubicinem, které se liší ve způsobu navázání doxorubicinu a také mechanizmem působení uvnitř nádorových buněk. 9

11 Cíle diplomové práce Detekce molekul asociovaných s imunogenní apoptotickou buněčnou smrtí (calreticulin, ERp57 a CD47) na povrchu buněk inkubovaných s: - volným antracyklinovým léčivem doxorubicinem - kopolymerem HPMA nesoucí doxorubicin navázaný amidickou a/nebo hydrazonovou vazbou - samotným homopolymerem HPMA - HPMA kopolymerem nesoucí postranní oligopeptidické spojky Detekce molekuly HMGB1 asociované s imunogenní buněčnou smrtí u nádorových buněk inkubovaných s volným doxorubicinem nebo s doxorubicinem amidicky nebo hydrazonově vázaným doxorubicinem na HPMA nosič Charakterizace změn sacharidového složení plazmatické membrány nádorových buněk po inkubaci s doxorubicinem navázaným na HPMA nosič amidickou vazbou a vliv těchto změn na tyto buňky Analýza fagocytózy nádorových a nenádorových buněk inkubovaných s volným nebo na HPMA nosič vázaným doxorubicinem in vitro a in vivo dendritickými buňkami 10

12 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Nádorová onemocnění a role imunitního systému Role imunitního systému při vývoji nádorového onemocnění a jeho léčbě je již řadu let velmi diskutované téma. Proto se v dnešní době v protinádorové léčbě dostává do popředí imunoterapie, která se snaží využít přirozené schopnosti imunitního systému bojovat proti nádorovým buňkám. Koncem devatenáctého století si americký lékař William B. Coley povšiml zajímavé skutečnosti, když pozoroval regresi nádoru u několika pacientů v průběhu bakteriální infekce (Coley 1991). Proto následně Coley injikoval pacientům s pokročilým nádorem inaktivované bakterie a u části pacientů zaznamenal výrazné zmenšení nádoru a delší dobu přežití. V polovině dvacátého století přednesli MacFarlane Burnet a Lewis Thomas hypotézu tzv. imunitního dozoru (cancer immunosurveillance), která předpokládala, že mezi fyziologické funkce imunitního systému patří rozpoznání transformovaných buněk, jejich včasné odstranění a případně odstranění již vytvořeného nádoru (Burnet 1957; 1970). Později byl na základě řady experimentů formulován koncept nazývaný imunoediting (Dunn et al. 2002; 2004; Smyth et al. 2006). Podle této dnes obecné přejímané teorie imunitní systém nejen že chrání organizmus před nádorovým bujením, což může vést jednak k regresi nádoru, ale bohužel to může přispívat k selekci nádorových buněk odolných vůči obranným mechanizmům organizmu. Imunoediting byl popsán jako dynamický proces, který se skládá ze tří fází: fáze eliminace, fáze rovnováhy eqilibrium a fáze úniku escape (Obr. 2.1). Ve fázi eliminace imunitní systém řadou obranných mechanizmů rozpozná transformovanou buňku a aktivuje procesy vrozené a později i adaptivní imunitní odpovědi. K další stimulaci dochází tím, že rostoucí nádorová masa poškozuje okolní tkáň a aktivuje uvolňování tzv. danger signálů, které upozorňují na poškozenou tkáň a aktivují imunitní systém. Tyto signály nebezpečí spolu s prozánětlivými cytokiny přivedou do místa nádoru buňky imunitního systému: NK buňky (natural killers, přirození zabíječi), NKT lymfocyty, γδ T lymfocyty, makrofágy a dendritické buňky. Následně jsou aktivovány efektorové buňky imunitního systému, které svými efektorovými cytotoxickými mechanizmy ničí nádorové buňky. Produkce interferonů I a II typu stimuluje expresi MHC I/II glykoproteinů (major histocompatibility complex) a prezentaci nádorových antigenů, přímo aktivuje makrofágy a NK buňky, inhibuje neoangiogenezi a amplifikuje zánětlivou reakci. Následně dendritické buňky fagocytují materiál z usmrcených nádorových buněk, zpracovávají nádorové antigeny a aktivované se přesouvají do spádových lymfatických uzlin. Zde prezentují pohlcené antigeny na pozadí MHC glykoproteinů I/II třídy naivním T lymfocytům. Nádorově specifické CD4+ a CD8+ T lymfocyty se pak přesouvají do místa nádoru a zabíjí antigen pozitivní nádorové buňky. Ve fázi eliminace je imunitní systém schopen úplně zničit celou nádorovou masu. Imunitní systém tedy po celý život hledá a odstraňuje transformované, případně nádorové buňky, ale s věkem či jiným faktorem např. dlouhodobým chronickým onemocněním nebo stresem, mohou být funkce imunitního systému oslabeny. Pokud se imunitnímu systému nepodaří úplně odstranit nádorovou masu, ale nádor se ještě nevymkl kontrole, může nastat fáze rovnováhy. Imunitní systém stále dokáže 11

13 nádorové buňky likvidovat, ty se ale postupně stávají odolnějšími vůči jeho útokům. Fáze dynamické rovnováhy mezi nádorovými buňkami a hostitelským imunitním systémem může trvat řadu let i celý život. Může ale také skončit úplným odstraněním nádoru nebo naopak vyústit do fáze úniku. Nádorové buňky dokážou díky genové nestabilitě a selekčnímu tlaku získávat nové mutace, kterými se stanou méně imunogenní a dokážou uniknout kontrole imunitního systému. Tento proces se nazývá fáze úniku. Přeživší nádorové buňky se množí, nekontrolovaně expandují (metastazují) i do okolních tkání hostitele. Mezi strategie, jak nádorové buňky dokážou uniknout pozornosti buněk imunitního systému, patří například snížená exprese MHC I/II třídy a nádorových antigenů (Marincola et al. 2000), nebo neodpovídavost na interferony (Kaplan et al. 1998). Nádorové buňky také mohou vytvářet imunosupresivní mikroprostředí uvolňováním protizánětlivých cytokinů TGF-β (transforming growth factor β) (Gorelik a Flavell 2001) a IL-10 (interleukin-10); mohou indukovat apoptózu u buněk imunitního systému pomocí FasL (Hahne et al. 1996) a galektinu (Rubinstein et al. 2004); uvolňováním rozpustných ligandů NKG2D, které snižují množství aktivačních NKG2D receptorů NK buněk (Groh et al. 2002). Imunosupresivní prostředí nádoru pomáhají také udržovat T regulační lymfocyty a tolerogenní dendritické buňky (Ghiringhelli et al. 2004). Obr. 2.1 Souhrn interakcí imunitního systému s nádorovými buňkami, převzato (Dunn et al. 2006) 12

14 2.2 Imunoterapie Imunoterapie má za cíl aktivovat přirozené protinádorové obranné mechanizmy, které mohou být vlivem nádoru utlumeny, případně potlačit vliv imunosupresivního prostředí nádoru. Její výhodou je možnost vytvoření specifické protinádorové reakce, která zničí i buňky rezistentní vůči klasické chemoterapii případně i kmenové nádorové buňky. Navození dlouhodobé specifické imunitní obrany tak snižuje riziko relapsu onemocnění. Současné přístupy v protinádorové terapii s využitím imunitního systému zahrnují použití monoklonálních protilátek, cytokinů, nádorových vakcín, dendritických buněk a adoptivní transfer T lymfocytů a NK buněk. Imunoterapii lze rozdělit na pasivní a aktivní. Pasivní imunoterapie spočívá v přenosu již aktivovaných efektorových autologních buněk např. z krve získaných LAK (lymphokine-activated killers)(mule et al. 1984), nebo z nádoru získaných lymfocytů TIL (tumor infiltrating lymphocytes), případně podání nádorově specifických monoklonálních protilátek. Potřebné buňky získané z krve či nádoru pacienta jsou ex vivo stimulovány a aktivované pak vráceny do těla pacienta. Účinkem monoklonální protilátek může být inhibice receptorů (např. receptory pro růstové faktory), neutralizace supresivních cytokinů (např. IL-10, TGF-β), vazbou na povrchové molekuly nádorových buněk mohou aktivovat komplement či buněčnou cytotoxicitu zprostředkovanou protilátkami (ADCC, antigen dependent cellular cytotoxicity) (Dougan a Dranoff 2009; Peggs et al. 2009). Monoklonální protilátky také mohou sloužit jako agonisté receptorů smrti (DR, death receptor) a spouštět apoptotickou smrt nádorových buněk (Wiezorek et al. 2010). Aktivní imunoterapie se snaží stimulovat aktivitu obranných mechanizmů přímo v těle pacienta pomocí protinádorových vakcín. Nádorové vakcíny jsou zaměřené na spuštění buněčné odpovědi a aktivaci specifických cytotoxických T lymfocytů proti nádorovým antigenům. Vakcíny v protinádorové imunoterapii mohou být založené na peptidech a proteinech asociovaných s nádory nebo na celých nádorových buňkách, vlastních či alogenních. Nádorové buňky mohou být navíc transfekovány geny kódující cytokiny např. IL-2 (Kircheis et al. 2000). Jako vakcíny mohou být využity i autologní dendritické buňky, které se in vitro stimulují antigeny nádorových buněk, nechají pomnožit a vrátí do těla pacienta, kde aktivují CD8+ a CD4+ T lymfocyty (Vulink et al. 2008; Murphy 2010). Dále se mohou používat k stimulaci protinádorové imunity cytokiny a růstové faktory, ale jejich působení velmi proměnlivé a podání může nést řadu vážných vedlejších účinků, a tak do klinického testování byly zatím uvedeny jen cytokiny IL-2 a IFNα (Kim-Schulze et al. 2007). Imunoterapie jako jediná léčebná metoda obvykle nestačí, aby odstranila celou nádorovou masu. Proto se využívá v kombinaci s chirurgickou léčbou, chemoterapií či radioterapií. 13

15 2.3 Klasická chemoterapie s nízkomolekulárními léčivy Chemoterapie hraje v současné době klíčovou roli při léčbě jak hematologických malignit, tak solidních nádorů. Ačkoli bylo na tomto poli dosaženo mnoha úspěchů, odvrácenou stranou takové léčby zůstává její toxické působení na zdravou tkáň. K závažným vedlejším účinkům klasické chemoterapie patří poškození buněk kostní dřeně, buněk gastrointestinálního traktu, gonád a buněk vlasových folikulů. Tyto negativní účinky jsou způsobeny nespecifickým cytotoxickým působením na rychle se dělící buňky, mezi které patří kromě nádorových buněk i buňky imunitního systému. Další závažnou komplikací chemoterapeutické léčby je vznik lékové rezistence, kdy se nádorové buňky stávají odolnými vůči cytotoxickým účinkům léčiv. Rezistence může vzniknout nejen vůči léčivům, kterým byly buňky vystaveny, ale také vůči novým druhům cytostatik a nastává tzv. mnohočetná léková rezistence (MDR, multidrug resistance). Mnohočetná léková rezistence je charakterizována zrychleným vypuzováním cytostatik ven z buňky pomocí transportních proteinů rodiny ABC. Dalším omezením je, že většina protinádorových léčiv patří mezi nízkomolekulární látky, které jsou z oběhu rychle odstraněny renální filtrací, aniž by se akumulovaly v nádoru. Omezení či úplné odstranění těchto problémů je jedním z hlavních cílů moderní protinádorové terapie. Významným přínosem k šetrnější a účinnější chemoterapii by bylo selektivní dopravení nízkomolekulárního léčiva jen do místa nádoru. 2.4 Chemoterapie s využitím vysokomolekulárních nosičů léčiva Německý lékař Paul Ehrlich v roce 1906 představil ideu o zázračné kulce tedy o léčivu, které bude směrované přímo do místa patologického procesu. Později v sedmdesátých letech 20. století rozvinul tuto myšlenku Helmut Ringsdorf a navrhl vodorozpustný polymer jako nosič biologicky aktivních látek (Ringsdorf 1975). V ideálním případě by vysokomolekulární (polymerní) nosič, ani jeho metabolity, neměly být toxické, neměl by se akumulovat ve zdravé tkáni, neměl by být imunogenní, měl by být stabilní a nést takové funkční skupiny, které umožní stabilní navázání léčiva, případně směrující struktury. Pomocí takového nosiče by bylo zajištěno, že léčivo bude přeneseno krevním řečištěm beze změny do místa svého působení s cíleným uvolněním léčiva v místě nádoru, čímž by se omezilo toxické působení na zdravé buňky organismu. Za tímto účelem byla vyvinuta řada polymerů, jak syntetických tak i přírodního původu, implantátů, lipozómů, mikrosfér a nanosfér. Vysokomolekulární nosiče s navázaným léčivem zajišťují výrazně delší setrvání léčiva v krevním oběhu díky omezené renální filtraci molekul s molekulovou hmotností větší než 45 kda. Léčivo je v průběhu cirkulace krevním řečištěm chráněno před degradací. K pasivní akumulaci přímo v nádorové tkáni dochází díky efektu zvýšené cévní propustnosti a omezené lymfatické drenáže nádoru tzv. EPR efektu (enhanced permeability and retention effect) (Matsumura a Maeda 1986; Maeda et al. 2003). Nově vznikající cévy v nádorové tkáni vykazují větší propustnost i pro velké molekuly, ale jejich lymfatický systém, který by odstraňoval léčivo z nádoru, je špatně vyvinutý nebo zcela chybí. Míra akumulace závisí na molekulové hmotnosti, náboji a hydrofobních/hydrofilních vlastnostech nosiče. Molekuly větší než 40 kda se v nádoru akumulují, zatímco molekuly menší 40 kda jsou z nádoru odstraňovány. 14

16 2.5 Syntetický polymerní nosič N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) Jeden z prvních popsaných vodorozpustných syntetických nosičů, a doposud intenzivně studovaný, je kopolymer založený na bázi N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA). Homopolymer HPMA byl původně vyvinut jako součást náhrady krevní plazmy pod názvem Duxon laboratoří prof. Jindřicha Kopečka (Kopecek et al. 1973). Tento syntetický homopolymer je biokompatibilní, netoxický a prakticky neimunogenní. Navázání cytostatika na HPMA kopolymer snižuje toxicitu a nežádoucí působení léčiva mimo tkáň nádoru, zlepšuje rozpustnost léčiva a prodlužuje dobu cirkulace v krevním oběhu (Garnett 2001). Samotný hydrofilní řetězec homopolymeru HPMA nenese funkční skupiny, na které by bylo možno navázat léčivo (případně směrující strukturu) a z kterých by se léčivo kontrolovaně uvolňovalo. Používá se proto modifikovaný kopolymerní HPMA řetězec, který nese krátké postranní sekvence zakončené reaktivní 4-nitrofenylesterovou skupinou (ONp) nebo hydrazinovou skupinou. Díky těmto reaktivním skupinám mohou být na nosič navázány molekuly obsahující aminoskupiny (Ulbrich et al. 2000) nebo ketoskupiny (Etrych et al. 2001). Na tyto postranní spojky je možné navázat léčivo a to buď přes enzymaticky biodegradovatelnou spojku, nebo přes ph degradovatelnou vazbu. Pro vazbu léčiva enzymaticky degradovatelnou vazbou se nečastěji používá oligopeptidická spojka GlyPheLeuGly, zatímco pro vazbu degradovatelnou slabě kyselým ph se používá hydrazonová vazba (Etrych et al. 2001). Takovéto spojky jsou v krevním řečišti stabilní a léčivo uvolňují až uvnitř buňky buď pomocí lysozomálních proteáz nebo vlivem nízkého ph v endozómu. Polymerní konjugát s léčivem může být dopraven do nádorové tkáně pasivně díky již zmíněnému EPR efektu (viz kapitola 2.4) (Noguchi et al. 1998), nebo může polymerní HPMA nosič nést směrující strukturu- ligand, který se s vysokou afinitou váže na receptor přítomný na nádorové buňce. Tomuto principu se říká aktivní směrování. Jako směrující struktura může být použita např. polyklonální i monoklonální protilátka (Jelinkova et al. 1998; Rihova 1998), lektin, karbohydrát, růstový faktor (Rihova 1997) nebo transferin (Kovar et al. 2002). 15

17 2.6 Polymerní HPMA konjugáty s navázaným antracyklinovým léčivem doxorubicinem Na polymerní kostru HPMA nosiče mohou být navázány nejrůznější cytotoxická agens, ale v naší laboratoři se nejčastěji používá antracyklinové antibiotikum doxorubicin. Připojením doxorubicinuu na polymerní HPMA nosič je výrazně omezeno jeho systémové působení a jeho negativní vedlejší toxicita, prodlužuje se poločas setrvání v krevním oběhu a díky cílené akumulaci v nádoru se zvyšuje jeho terapeutický potenciál. Cytostatikum doxorubicin může být na polymerní kostru navázáno dvěma způsoby: a) pomocí enzymaticky štěpitelné amidické vazby (konjugát dále označovaný Dox-HPMA AM, Obr. 2.3) nebo b) pomocí hydrolyticky štěpitelné, ph senzitivní hydrazonové vazby (konjugát dále označovaný Dox-HPMA HYD, Obr. 2.4). Obr. 2.2 Chemická struktura doxorubicinu HPMA konjugáty amidicky navázaným doxorubicinem Konjugát Dox-HPMA AM, znám také pod označením PK1, FCE 28068, nese doxorubicin navázaný na oligopeptidickou spojku pomocí amidické vazby (Obr 2.3) a byl konstruován tak, aby se doxorubicin z nosiče uvolnil působením lysozomálních proteáz (Ulbrich et al. 1980; Ulbrich et al. 2000). Z toho důvodu by se měl konjugát dostat endocytózou do buňky a poté dosáhnout lysozómů, kde dojde k odštěpení doxorubicinu. Omelyanenko tento mechanizmus pozoroval, kdy se celý konjugát vyskytoval v lysozomech a po několika hodinách se objevil uvolněný doxorubicin v jádře (Omelyanenko et al. 1998). Práce Ondřeje Hovorky potvrzuje, že tento konjugát se nachází v lysozómech avšak ukazuje také, že konjugát Dox-HPMA AM může vstupovat do buňky přímo a intracelulárně se hromadit na buněčných membránách. Doxorubicin se mu nepodařilo detekovat v místě svého působení tedy v jádře, takže dochází k závěru, že se z konjugátu pravděpodobně neuvolňuje ve farmakologicky dodatečném množství, které by následně mělo být pozorovatelné intracelulárně. Konjugát Dox-HPMA AM se hromadí na všech buněčných membránách (mimo membránu mitochondrií), čímž způsobuje inhibici buněčného metabolismu a vyvoláváá nekrotickou buněčnou smrt (Minko et al. 1999; Hovorka et al. 2002; Hovorka et al. 2006). Mechanizmus působení konjugátuu s amidickou vazbou doxorubicinu Dox-HPMA AM není příliš znám. K uvolnění doxorubicinu z polymerního HPMA nosiče nedochází a není to ani podmínkou jeho cytotoxickéhoo účinku (Rihova et al. 2008). Ukázalo se, že nespouští stejné signalizační dráhy jako konjugát s hydrazonovou vazbou Dox-HPMA HYD, naopak může potlačovat aktivaci stresových kináz a aktivovat ERK kinázy, které se podílí na buněčném růstu (Kovar et al. 2007). 16

18 V in vitro i in vivo studiích ukázal konjugát Dox-HPMA AM vysokou protinádorovou účinnost proti celé řadě různých nádorů. Tento nesměrovaný HPMA kopolymer s doxorubicinem se stal prvním polymerním chemoterapeutikem, které vstoupilo do první fáze klinického testování v roce 1994 ve Velké Británii a následně i do druhé. Vasey et. al potvrdil akumulaci léčiva v některých lidských nádorech a jeho využití v humánní medicíně (Vasey et al. 1999). S cílem zvýšit efektivnost směrování polymerních konjugátů do místa nádoru, byl vytvořen kopolymer HPMA s doxorubicinem, na který je navázána jako směrující struktura molekula lidského imunoglobulinu HuIg (konjugát dále označovaný Dox- HPMA AM -HuIg). Konjugát Dox-HPMA AM -HuIg byl testován v laboratorních podmínkách na několika nádorových liniích (EL4 myší T buněčný lymfom, EL4.IL-2 a B16-F10 melanom). Přestože směrující strukturou v tomto konjugátu je lidský imunoglobulin, který se na buňky myší EL4 nádorové linie specificky neváže, dokázal kompletně vyléčit myši s EL4 lymfomem. O něco menší účinnost vykazoval u nádoru B16-F10, kde zpomalil růst nádoru a signifikantně prodloužil dobu přežití myší s tímto národem (Sirova et al. 2007). Pilotní klinická studie potvrdila, že tento konjugát je v krevním oběhu stabilní a neimunogenní, všemi pacienty dobře tolerovaný. Konjugát dokázal vyvolat částečnou klinickou odpověď a stabilizoval onemocnění na dlouhou řadu měsíců (Rihova et al. 2003a) HPMA konjugát s hydrazonově navázaným doxorubicinem O něco mladším typem je konjugát nesoucí doxorubicin navázaný k nosiči přes hydrazonovou vazbu, která je ph senzitivní a hydrolyticky štěpitelná (Obr 2.4). Doxorubicin může být připojen na polymerním řetězci pomocí peptidické spojky nebo pomocí 4-aminobenzoové kyseliny či 6-aminohexanové kyseliny. Tato vazba přináší výhodu, že k uvolnění léčiva nejsou nutné lysozomální enzymy, ale léčivo je uvolněno za nízkého ph v endozómu případně extracelulárně v mírně kyselém mikroprostředí nádoru (Ulbrich a Subr 2004). Při fyziologickém ph ~7,4, což odpovídá ph krevního řečiště, je konjugát stabilní. Konjugát s ph senzitivní vazbou se do buňky dostává aktivní cestou - pinocytózou nebo endocytózou (Hovorka et al. 2006). K uvolnění doxorubicinu dochází až v endozómu při nižším ph ~5, kdy je hydrazonová vazba rychle hydrolyzována, a uvolněný doxorubicin se akumuluje v jádře. Konjugát Dox-HPMA HYD je na rozdíl od konjugátu Dox-HPMA AM účinný i proti nádorovým liniím, které mají omezené množství lysozómů (Rihova et al. 2001). Vzhledem k tomu, že tento typ konjugátu, oproti konjugátům s amidicky navázaným doxorubicinem, velmi efektivně intratumorálně uvolňuje doxorubicin, vykazuje také vyšší míru cytotoxicky in vitro (Etrych et al. 2001) a in vivo (Kovar et al. 2004; Mrkvan et al. 2005). V jádře pak uvolněný doxorubicin spouští apoptotickou buněčnou smrt stejně jako volný doxorubicin (Hovorka et al. 2002; Kovar et al. 2004). Účinkem Dox-HPMA HYD dochází u nádorové linie 38C13 k vyšší expresi proteinu p21waf1/cip, který je aktivován proteinem p53, stejně jako u volného doxorubicinu. Protein p21 inhibuje komplex cyklindependentních kináz/cyklin a zastavuje buněčný cyklus. Exprese p21 u buněk, které byly vystaveny působení konjugátu s enzymaticky štěpitelnou vazbou Dox-HPMA AM byla 17

19 zvýšená jen slabě, stejně tak exprese proapoptotických proteinů bax a bad byla zvýšená méně než u buněk, které byly inkubovány s volným doxorubicinem či konjugátem s ph senzitivní vazbou Dox-HPMA HYD (Kovar et al. 2004). Volný doxorubicin a Dox- HPMA HYD aktivují kinázy p38 a JNK (c-jun N-terminální kináza) u EL4 nádorové linie. Tyto kinázy jsou aktivovány při buněčném stresu jako odpověď na poškození DNA a následně dochází k apoptóze (Wada a Penninger 2004). Dále volný doxorubicin i konjugát Dox-HPMA HYD zvyšují aktivitu efektorové kaspázy 3, jejíž aktivace je považována za klíčový nevratný krok při apoptotické buněčné smrti a zvyšují expresi Fas receptoru na povrchu, čímž se buňky stávají citlivější k apoptóze indukované FasL (Kovar et al. 2007). Obr. 2.3 Chemická struktura konjugátu Dox-HPMA AM, převzato (Rihova et al. 2010a) Obr 2.4 Chemická struktura konjugátu Dox- HPMA HYD, převzato (Rihova et al. 2010a) 18

20 2.7 Vliv HPMA homo a kopolymeru na imunitní systém Syntetické polymery, které jsou určené pro biomedicínské aplikace, musí být biokompatibilní a nesmí vyvolávat nežádoucí obranné reakce organismu. V případě homopolymeru HPMA rozsáhlé testy ukázaly, že nevykazuje mitogenní vlastnosti, není hepatotoxický (Korcakova et al. 1976; Sprincl et al. 1976). Reakce na homopolymer (s molekulovou hmotností okolo 30kDa) byla testována u pěti různých myších imbredních kmenů, které se lišily genetickým pozadím. V žádném z těchto myších kmenů nebyl homopolymer HPMA rozpoznáván jako cizorodý a nevyvolával humorální ani buněčnou imunitní reakci (Rihova et al. 1983; 1984; 1985; 1989). Slabou imunitní reakci vyvolává kopolymer nesoucí oligopeptidické spojky, kdy je stimulována tvorba protilátek proti peptidickému řetězci a z části proti hydroxypropylovým skupinám. Množství protilátek proti kopolymeru s postranními řetězci bylo o čtyři řády menší než množství protilátek proti referenčnímu hovězímu gama globulinu (Rihova et al. 1984). Ve slezinách myší, kterým byly podány kopolymery HPMA s větší molekulovou hmotností ( kda), bylo více než dvakrát více buněk tvořící protilátky, než pokud byly myším podány kopolymery s malou molekulovou hmotností (5 kda), což je dáno jejich delším setrváním v krevní cirkulaci a tedy existuje větší šance, že se setkají s imunokompetentními buňkami (Rihova a Kovar 2010b). Rovněž byl studován vliv homopolymeru HPMA a jeho kopolymerů na klasickou a alternativní dráhu komplementu. Bylo prokázáno, že homopolymer HPMA a jeho kopolymery v dávkách, které odpovídají terapeutickému využití, neaktivují ani neinhibují klasickou ani alternativní dráhu komplementu (Simeckova et al. 1986). Na druhou stranu navázání molekuly-antigenu na kopolymer HPMA snižuje její imunogenní vlastnosti, protože epitopy vázaných molekul jsou prostorově nedostupné a imunitnímu systému skryté. Tohoto lze využít v dlouhodobé terapii, kde se používá aktivními proteiny, jako jsou enzymy, protilátky a imunotoxiny (Rihova 2002a). 19

21 2.8 Imunostimulační vlastnosti antracyklinů Antracykliny byly popsány koncem 30. let, kdy byly objeveny jejich antibakteriální účinky proti Gram pozitivním bakteriím. Až v roce 1963 byl objeven daunorubicin, který se začal používat v protinádorové léčbě. O několik let později byl objeven i metabolit daunorubicinu- doxorubicin, který vykazoval lepší terapeutický efekt a nižší toxicitu. Doxorubicin (někdy také uváděn pod označením adriamycin, Adriblastina) je cytostatikum, které se obvykle používá při léčbě řady tumorů: karcinom prsu, karcinom plic, karcinom ovaria, karcinom močového měchýře z přechodných buněk, neuroblastom, Wilmsův tumor, sarkomy měkkých tkání, osteosarkom, akutní lymfocytová-lymfoblastová leukémie, akutní myeloblastická leukémie, non-hodgkinský lymfom, Hodgkinova choroba, karcinom štítné žlázy, karcinom endometria, karcinom v oblasti hlavy a krku, karcinom žaludku, primární hepatocelulární karcinom, karcinom varlat, nonseminom, karcinom prostaty, Ewingův sarkom, rhabdomyosarkom, mnohočetný myelom, chronické leukémie. Bohužel antracykliny díky svému systémovému působení jsou při dlouhodobém podávání kardiotoxické, přispívají ke kardiomyopatii a mají myelosupresivní účinky (Schein a Winokur 1975). Protože je kardiotoxicita limitující pro použití dostatečně účinné dávky antracyklinů, jsou hledány další, šetrnější antracykliny: epirubicin, pirarubicin, aklarubicin, idarubicin, mitoxantron, farmorubicin a amrubicin. Další možností je jiný způsob podání antracyklinů jako například Caelyx (Doxil), což je doxorubicin uschovaný uvnitř lipozómů tvořených polyetylen glykolem (O brien et al. 2004). Doposud byla popsána řada mechanizmů, jak antracykliny působí v buňce a indukují buněčnou smrt (shrnuto (Gewirtz 1999)). Antracykliny interkalují mezi páry bazí DNA a inhibují funkci zejména topoizomerázy II, jejímž důsledkem je inhibice replikace a transkripce DNA a RNA, poškození DNA a tvorba dvouvláknových zlomů, což vede k zvýšené expresi p53 (Hayakawa et al. 2000). Přirozené opravné mechanizmy ale nestačí rozsáhlé poškození DNA opravit, což vede ke spuštění signalizační kaskády, která končí apoptotickou smrtí buňky (Haupt a Oren 1996). Mezi další mechanizmy působení patří tvorba volných radikálů a reaktivních sloučenin kyslíku. První zmínky o tom, že k terapeutickému efektu doxorubicinu významně přispívá imunitní systém, se objevily ve studii Schwartze v roce Pokud byl doxorubicin podán myším s nádorem, které byly před léčbou imunosuprimované (celkovým ozářením, cyklofosfamidem či metotrexátem), vykazoval doxorubicin výrazně nižší protinádorový účinek (Schwartz a Grindey 1973). Další experimenty ukázaly, že doxorubicin může mít imunomodulační vlastnosti a stimulovat imunitní systém. Maccubin a kolektiv zjistili, že doxorubicin posiluje cytotoxickou T buněčnou odpověď a protinádorovou aktivitu makrofágů (Maccubbin et al. 1990). Zároveň dokázali in vivo vyléčit EL4 nádor, který byl in vitro rezistentní vůči doxorubicinu, pokud doxorubicinem léčili imunokompetentní myši (Maccubbin et al. 1992). Ujhazy a kolektiv ukázali, že peritoneální buňky z myší léčených doxorubicinem exprimují ve větší míře prozánětlivé cytokiny (IL-1, TNF a IFNγ), a pozorovali sníženou expresi IL-6. To vedlo ke zvýšené aktivitě NK buněk a makrofágů (Ujhazy et al. 2003). Ve snaze posílit jeho imunostimulační účinky byl doxorubicin podáván v kombinaci se samotným rekombinantním interleukinem 2 (IL-2) 20

22 (Ho et al. 1993) nebo s IL-2 a zároveň s IFNγ (Lumsden et al. 1992), s interleukinem 12 (Zagozdzon et al. 1998). 2.9 Imunostimulační vlastnosti doxorubicinu vázaného na kopolymer HPMA Již v roce 1988 byly publikovány první výsledky, které ukazují, že antracyklinové léčivo (tehdy daunorubicin) navázané na kopolymer HPMA může mít imunostimulační vliv na buňky kostní dřeně (Rihova et al. 1988). Následné experimenty ukázaly, že oba typy dříve zmíněných konjugátů dokážou stimulovat protinádorovou imunitní reakci a navodit dlouho trvající protinádorovou rezistenci. U myší vyléčených protilátkou směrovanými konjugáty Dox-HPMA AM -B1mAb (Rihova et al. 2001a; Kovar et al. 2008) či Dox-HPMA AM -HuIg (Sirova et al. 2007) anebo pasivně směrovanými konjugáty Dox-HPMA HYD (Mrkvan et al. 2005) či Dox-HPMA AM se vyvíjí dlouhotrvající protinádorová imunita, která je přenositelná pomocí splenocytů i samotných CD8+ T lymfocytů do naivního příjemce. Myším vyléčeným HPMA konjugáty byla následně podána letální dávka stejných buněk nádoru, jako jim byl vyléčen, a myši byly ponechány bez další léčby. U těchto reinokulovaných myší byl pozorován pomalejší růst nádoru, výrazně delší doba přežití a často se nádor vůbec nevyvinul. Protinádorová imunita byla částečně specifická proti nádoru, který byl myším vyléčen. Pokud jim byla reinokulována letální dávka nádorových buněk jiného syngenního nádoru, doba přežití u těchto myší byla delší než u kontrolních, ale nikdy nedošlo k úplnému vyléčení (Sirova et al. 2007). Schopnost HPMA konjugátů vyvolat specifickou protinádorovou imunitní reakci závisí na dávce a režimu podání léčiva (Mrkvan et al. 2005; Kovar et al. 2008). Kompletní regresi nádoru lze dosáhnout pouze u myší s neporušeným imunitním systémem, což ukazuje na roli protinádorové imunitní reakce při léčbě HPMA kopolymery. Význam imunitního systému při léčbě HPMA konjugáty doxorubicinu potvrzuje i Winnův test (Winn s assay (Winn 1961)), při kterém byly naivním myším injikovány EL4 nádorové buňky spolu s izolovanými CD8+ T lymfocyty získané ze slezin myší, u kterých byl EL4 nádor vyléčen pomocí konjugátu Dox-HPMA AM -HuIg. U těchto naivních myší nádor nevyrostl. Pokud naivním myším byly injikovány EL4 nádorové buňky se splenocyty nebo samotné CD8+ T lymfocyty z jiného naivního dárce, tak nádor neodhojily (Sirova et al. 2007). Cytotoxický účinek a zároveň stimulace části imunitního systému byla zjištěna v klinickém pozorování, konkrétně pro konjugát Dox-HPMA AM -HuIg (Rihova et al. 2003c). Po léčbě konjugátem Dox-HPMA AM -HuIg u pacientek s karcinomem prsu bylo pozorován nárůst počtu a zvýšená aktivita NK buněk a také nárůst počtu LAK buněk. Přesné mechanizmy, jak polymerní konjugáty HPMA s doxorubicinem stimulují imunitní odpověď a navozují dlouhodobou imunitní protinádorovou obranu, nejsou známy. Avšak nové poznatky o molekulárních mechanizmech působení volného doxorubicinu, kterými vyvolává imunogenní buněčnou smrt, vnesly do problému nové světlo. 21

23 2.10 Imunogenní apoptotická smrt nádorových buněk Antracykliny vyvolávají v nádorových buňkách apoptotickou smrt, která je charakterizována smrštěním buňky, tvorbou membránových puchýřků, kondenzací chromozómů a fragmentací jádra (Kerr et al. 1972; Kroemer et al. 2009). Za fyziologických podmínek v těle umírají apoptotickou smrtí miliony buněk a jsou včas odstraněny okolními fagocytujícími buňkami, aniž by došlo k uvolnění prozánětlivých faktorů a k vyvolání imunitní reakce. Na druhé straně, pokud buňky zemřou nekrotickou buněčnou smrtí, z buňky se uvolní do prostředí řada tzv. danger signálů a imunitní systém je aktivován. Proto dlouho panovalo přesvědčení, že nekrotická buněčná smrt je imunogenní, zatímco apoptotická byla považována za imunologicky neaktivní či dokonce za tolerogenní. V roce 2005 byl však publikován článek, že nádorové apoptotické buňky umírající působením antracyklinů mohou vyvolat efektivní protinádorovou reakci (Casares et al ). Obeid a kolektiv sledoval účinky různých typů léčiv, které v buňkách spouští apoptotickou smrt. Myši, kterým byly injikovány buňky zabité cytoxickými léčivy, jejichž mechanizmus účinku je zaměřen na endoplazmatické retikulum (thapsigargin, tunicamycin a brefeldin), mitochondrie (arsenit, betulinic a C2 ceramid) anebo DNA (Hoechst33342, kamptothecin, etoposid a mitomycin C), nedokázaly později zabránit růstu stejných, ale živých nádorových buněk. Stejný výsledek byl pozorován u athymických nu/nu myší. Avšak myši, kterým byly podány nádorové buňky umírající vlivem antracyklinů nebo vlivem γ záření, dokázaly později živé nádorové buňky odhojit, což znamená, že tyto umírající buňky aktivovaly účinnou protinádorovou odpověď. Můžeme tedy říct, že některé cytotoxické látky vyvolávají imunogenní apoptózu, zatímco jiné vyvolávají neimunogenní typ apoptózy. Autoři dále izolovali povrchové proteiny a pomocí proteomické analýzy identifikovali dva proteiny, které se objevují na povrchu buněk léčených látkami vyvolávajícími imunogenní buněčnou smrt. Jsou jimi chaperonový protein calreticulin (CRT) a disulfid izomeráza ERp57. Oba proteiny se za normálních okolností vyskytují v lumen endoplasmatického retikula (ER) a přesouvají se na povrch během několika hodin po inkubaci buněk s doxorubicinem, OXP a ionizujícího záření (γ nebo ultrafialové C záření) (Obeid et al. 2007a; 2007b). Při apoptotické buněčné smrti se obecně na povrchu buněk objevuje řada molekul, které jsou za normálních okolností skryty uvnitř buňky, nebo se objevují povrchové molekuly, které jsou ale během apoptotické smrti pozměněny (oxidace, změny karbohydrátových struktur). Takovéto molekuly pak mohou sloužit jako tzv. eat me signály pro okolní fagocytující buňky a signalizují, že buňka je poškozená a je třeba ji odstranit. V tomto článku byl povrchově vázaný calreticulin identifikován jako eat me signál, který indukuje protektivní protinádorovou odpověď, zatímco ERp57 byl později popsán jako molekula zodpovědná za transport calreticulinu z endoplazmatického retikula (Obeid et al. 2007a; Panaretakis et al. 2008). Mezi eat me signály apoptotických buněk patří například i fosfatidylserin, ten se ale nepodílí na imunogenních vlastnostech nádorových buněk inkubovaných s antracykliny (shrnuto v Tab. 2.1). Dalším známým eat me signálem objevujícím se na povrchu nádorových buněk inkubovaných s léčivy a indukujícím protinádorovou reakci jsou chaperonové proteiny HSP (heat-shock protein), konkrétně HSP70 a HSP90 (Clark a 22

24 Menoret 2001; Spisek et al. 2007). Jako protiklad k eat me signálům slouží don t eat me signály (např. CD31, CD47) vyskytující se na živých buňkách, které jsou v pořádku, a chrání tak buňku před rozpoznáním a fagocytózou (Oldenborg et al. 2001; Brown et al. 2002). Při imunogenní smrti vyvolané antracykliny je do extracelulárního prostoru uvolňován také protein HMGB1 (high-mobility group box1), který slouží jako tzv. danger signál a je rozpoznáván receptorem TLR4 (Toll-like receptor 4) na dendritických buňkách (Apetoh et al. 2007). Dendritické buňky, které pohltí buňky umírající imunogenní apoptózou a dostanou signál přes TLR4, pohlcený materiál zpracují a prezentují ho v komplexu s MHC glykoproteiny na svém povrchu. Signalizační dráha receptoru TLR4 přes MyD88 brání rychlé degradaci fagocytovaného materiálu a přispívá k lepší prezentaci pohlcených nádorových antigenů (Apetoh et al. 2007). Jako další danger signál imunogenní apoptózy vyvolané antracykliny nebo oxaliplatinou bylo nedávno popsáno uvolnění ATP (adenosin trifosfát) z umírajících nádorových buněk. Takto uvolněné molekuly ATP aktivují purinergní P2RX 7 receptory (P2X purinoceptor 7) na dendritických buňkách a spouští tvorbu inflamazómu NLRP3- ASC-Casp1 (viz níže). Aktivace inflamazómu pak vede k proteolytickému štěpení pro- IL1β a k uvolnění IL-1β. Na aktivním IL-1β závisí priming nádorově specifických CD8+ T lymfocytů, které uvolňují IFNγ (Ghiringhelli et al. 2009). Nádorové buňky "eat me" signály fosfatidylserin calreticulin HSP 90 HSP70 Dendritická buňka rozpoznání pozitivní regulace fagocytózy cross-prezentace antigenu aktivace CD8+ T lymfocytů "danger" signály Receptor HMGB1 TLR4 zpracování a cross prezentace antigenu ATP P2RX7 sekrece IL-1β "don't eat me" signály CD31 CD31 negativní regulace fagocytózy CD47 SIRPα negativní regulace fagocytózy Tab 2.1 Souhrn signálů uvolňovaných umírající nádorovou buňkou a vliv na dendritické buňky 23

25 Obr. 2.5 Přehled charakteristických znaků imunogenní apoptózy, převzato (Green et al. 2009) Calreticulin Calreticulin byl poprvé izolován v roce 1974 Ostwaldem a MacLennanem jako HACBP (high-affinity calcium-binding protein) (Ostwald a Maclennan 1974). Jedná se o protein s molekulovou hmotností 46 kda, který se nachází jako rozpustný protein v lumen endoplazmatického retikula. Calreticulin dokáže vázat Ca 2+, Zn 2+ ionty, ATP a interaguje s disulfid izomerázou PDI (Baksh et al. 1995) a ERp57 (Oliver et al. 1999)(Obr. 2.6). Slouží především jako molekulární chaperon, kdy CRT spolu s calnexinem (transmembránový chaperon ER) tvoří calreticulin/calnexinový cyklus, který zodpovídá za skládání a kvalitu nově syntetizovaných glykoproteinů (Benham a Braakman 2000). Analýzy primární struktury ukázaly, že CRT se skládá ze tří domén. N-terminální doména zajišťuje lektinovou funkci CRT, následuje P-doména bohatá na aminokyselinu prolin, vázající Ca 2+ s vysokou afinitou a rameno interaguje s izomerázou ERp57. C- terminální doména obsahuje řadu reziduí kyseliny asparagové a glutamové a dokáže vázat Ca 2+ s nízkou afinitou (Baksh a Michalak 1991). Calreticulin udržuje homeostázu Ca 2+ vyvazováním vápenatých iontů a jejich ukládáním v ER. Na základě apoptotické signalizace může vápenaté ionty uvolnit, aktivovat calcineurin, který dále reguluje transkripční faktory a řídí tak expresi proteinů účastnící se apoptózy (Nakamura et al. 2000). 24

26 Obr. 2.6 Struktura calreticulinu a jeho interakce s ERp57, převzato (Michalak et al. 2002) CRT se přesouvá z ER na povrch buněk, které byly vystaveny působení antracyklinů, OXP nebo ionizujícímu záření. Při imunogenní apoptóze se CRT na povrchu buněk vyskytuje ještě dříve, než buňka vykazuje apoptotické znaky: kondenzace chromatinu, expozice fosfatidyl serinu na povrchu (Obeid et al. 2007a) či ztráta transmembránového mitochondriálního potenciálu (Panaretakis et al. 2009). K translokaci CRT na povrchu vlivem antracyklinů dochází nejen u myších a lidských buněk, ale také byl tento mechanizmus popsán u kvasinek Saccharomyces cerevisiae. Jedná se o evolučně konzervovaný proces, který se objevuje už u jednoduchých hub až po vyšší mnohobuněčné organizmy (Madeo et al. 2009). Při imunogenní apoptóze koreluje vystaveného CRT s indukcí protinádorové odpovědí, takže lze předpokládat, že CRT je klíčovou molekulou tohoto děje. Dále také knock-down calreticulinu pomocí sirna anuluje imunogenní potenciál buněk inkubovaných s antracykliny, avšak imunogenicitu je možné znovu obnovit dodáním rekombinantního CRT k nádorovým buňkám. Stejně tak rekombinantní CRT aktivuje protinádorovou imunitní odpověď, pokud je podán s léčivy, které za normálních okolností nevyvolávají imunogenní buněčnou smrt (Obeid et al. 2007a). Panaretakis a spol. zjistili, že disulfid izomeráza ERp57, která těsně interaguje s CRT už v ER, se objevuje na povrchu spolu s CRT. Na povrchu však nebyly detekovány žádné jiné proteiny ER jako například calnexin, PDI, BiP nebo grp94 (Panaretakis et al. 2009). Kompletní knock-out nebo knock-down ERp57 zcela inhiboval translokaci CRT. Buňky, které neexprimují ERp57 nebo jen v malém množství, nedokážou vyvolat protinádorovou imunitní reakci. Tato reakce může být ale aktivována přidáním exogenního CRT, který se na povrch buněk váže i bez přítomnosti ERp57 (Panaretakis et al. 2008). Způsob jakým se komplex CRT/ERp57 dostává na povrch je zatím znám jen částečně. K přesunu CRT dochází i u enukleovaných buněk (Obeid et al. 2007a), což znamená, že poškození jádra antracykliny, OXP nebo ionizujícím zářením nemá na přesun vliv. Dále bylo zjištěno, že při působení těchto látek a záření se zvyšuje uvolňování Ca 2+ z ER. Pokud bylo uvolňování vápenatých iontů blokováno, přesun CRT byl inhibován, a naopak pokud byl usnadněn únik Ca 2+ iontů z ER, CRT se na povrchu buněk objevil ve větší míře (Tufi et al. 2007). Látky indukující přesun CRT jsou také spouštěči stresu ER a vyvolávají produkci reaktivních kyslíkových intermediátů (ROS, reactive oxygen species). Pokud 25

27 byly použity antioxidanty spolu s těmito léčivy, byla narušena translokace CRT. Samotné induktory ROS nestačily k tomu, aby vyvolaly přesun CRT na povrch (Panaretakis et al. 2009). Reakce ER na stres zahrnuje fosforylaci kinázy PERK, která se tak aktivuje a fosforyluje eukaryotický translační faktor 2α (eif2α) na serinu 51. Knock-down(out) PERK kinázy či výměna normálního eif2α za nefosforylovatelný eif2α vedly k narušení translokace CRT. Antracykliny dále inhibují eif2α specifickou protein fosfatázu (PP1). Použitím látek, které inhibují PP1 (tautomycin, calyculin A nebo salubrinal), byl spuštěn přesun CRT na povrch, aniž by to vedlo k smrti buněk (Obeid et al. 2007a; Kepp et al. 2009). Fosforylovaný eif2α je důležitým pro zastavení translace při buněčném stresu (Scheuner et al. 2001), tvorbě stresových granulí (Yamasaki a Anderson 2008), autofágii (Talloczy et al. 2002) a nyní tedy i pro imunogenní smrt buněk vyvolanou antracykliny, OXP nebo ionizujícím zářením. Translokaci CRT je možné zastavit širokým spektrem inhibitorů kaspáz např. Z-VADfmk nebo p35 (transfekovatelný protein původem z baculoviru) a je tak možné zrušit imunogenní účinek léčiv (Casares et al ; Obeid et al. 2007a). Panaretakis a kolektiv identifikovali kaspázu se aktivuje v buňkách po inkubaci s antracykliny pomocí biotinylovaného inhibitoru VAD-fmk, který se váže na první aktivovanou kaspázu. První zachycenou kaspázou byla kaspáza 8. Aktivace této kaspázy proběhla několik hodin předtím, než byla aktivována exekuční kaspáza 3. Aktivace kaspázy 8 přes receptory smrti pomocí ligandu TRAIL a agonistické CD95 protilátky vedla k expozici CRT na povrchu buněk. Selektivní delece či inhibice kaspázy 8 nebo deplece proteinu Bap31 (B-cell receptor-association protein 31), jehož štěpení je katalyzováno kaspázou 8, zabránila translokaci CRT. Proces translokace CRT je pravděpodobně regulován proteiny Bcl-2, s nimiž Bap31 interaguje, protože zvýšená exprese Bcl-2 brání přesunu CRT na povrch stejně jako knock-down(out) proteinu Bax či Bak (Panaretakis et al. 2009). CRT/ERp57 se přesouvá z ER anterográdním transportem za pomoci aktinového skeletu do Golgiho aparátu (Panaretakis et al. 2009). Tento proces potvrdily pokusy, kdy při použití brefeldinu A (inhibitor anterográdního transportu) anebo lantriculinu B (inhibitor polymerizace aktinu) nedošlo k přesunu CRT z ER. Na povrch se dostává CRT ve váčku aktivní exocytózou. Membránová fúze váčku s plazmatickou membránou je zajišťována interakcí VAMP1 (vesicle-associated membrane protein 1) s proteinem na plazmatické membráně SNAP23/25 (synaptosome-associated protein of 23/25 kda) (Panaretakis et al. 2009). Způsob jakým je CRT uchycen na povrchu plasmatické membrány zatím není přesně znám. Calreticulin se váže na LDL-receptor-related protein (LRP1; CD91; alfa-2- makroglobulinový receptor), pokud jsou oba přítomni na povrchu fagocytující buňky v přítomnosti trombospondinu (Orr et al. 2003). Studie ukázaly, že CRT přítomný na apoptotické buňce se váže na LRP1 fagocytující buňce. Umírající buňka není fagocytována, pokud je zablokován LRP1 specifickou protilátkou (Gardai et al. 2005). Dalšími molekulami, které se mohou vázat na CRT, jsou trombospondin či komplementový faktor C1q. Tyto molekuly mohou sloužit jako spojovací molekuly mezi CRT a LRP1 (Ogden et al. 2001). Calreticulin se může také vázat na další povrchové 26

28 receptory jako je scavanger receptor A (SR-A) nebo scavanger receptor exprimovaný endoteliálními buňkami SREC-I (Berwin et al. 2004). Molekula calreticulinu (spolu s fosfatidylserinem) byla detekována i na živých buňkách, které přesto nebyly fagocytovány (Obeid et al. 2007a). To může být dáno přítomností don t eat me signálů na živé buňce, např. CD47. Tato molekula CD47 se vyskytuje na živých buňkách a interakcí s receptorem SIRPα (signal-regulatory protein α) poskytuje fagocytující buňce negativní signál, že není určena k odstranění (Oldenborg et al. 2001). Buňky, které nemají CD47 na svém povrchu, jsou fagocytovány (Gardai et al. 2005). U některých apoptotických buněk nebylo ale snížení množství CD47 na povrchu pozorováno (Gardai et al. 2005; Obeid et al. 2007a). Gardai et al. zjistil, že CD47 tvoří shluky mimo oblast kde se vyskytuje calreticulin a fosfatidylserin, čímž je usnadněna fagocytóza těchto apoptotických buněk (Gardai et al. 2005) Heat-shock proteiny Rodina HSP proteinů patří mezi molekulární chaperony stejně jako CRT, které napomáhají správnému složení proteinů nebo řídí jejich degradaci v proteazómu. Ačkoli místo jejich působení jako chaperonů je uvnitř buňky, mohou být HSP70 a HSP90 vystaveny na povrchu a účastnit se stimulace imunitního systému během nekrotické buněčné smrti (Saito et al. 2005). HSP70 se může vázat na řadu receptorů dendritických buněk a stimulovat tak fagocytózu umírající buňky, stimulovat zpracování a prezentaci antigenů, stimulovat maturaci dendritických buněk a zvyšovat expresi kostimulačních molekul (Zitvogel et al. 2004; Asea 2008). Podobně jako CRT zvyšuje HSP70 imunogenní vlastnosti umírajících nádorových buněk (Clark a Menoret 2001), což vede k aktivaci vrozené i adaptivní imunitní reakce proti nádoru (Noessner et al. 2002; Elsner et al. 2007). Bortezomib, specifický inhibitor 26S proteazómu, vyvolává expresi HSP90 na povrchu myelomových buněk a spouští imunogenní buněčnou smrt. Povrchový HSP90 nádorových buněk vede k rozpoznání dendritickými buňkami, k maturaci těchto dendritických buněk a následně v lymfatických uzlinách k aktivaci T lymfocytů (Spisek et al. 2007) HMGB 1 Protein high-mobility group box 1 (HMGB1) je členem HMG box rodiny chromozomálních proteinů. Jedná se o malý nehistonový protein s molekulovou hmotností 25kDa. HMGB1 je evolučně konzervovaný protein, který byl nalezen u všech mnohobuněčných organizmů (Sessa a Bianchi 2007). Za normálních okolností se nachází v buněčném jádře, kde se váže na DNA. Váže se do malého žlábku DNA a ohýbá dvoušroubovici, tím napomáhá interakci řady proteinů s DNA, které ovlivňují genovou transkripci (p53, NFκB, RAG 1/2, receptory steroidních hormonů aj.) (Bianchi a Agresti 2005). Extracelulárně lokalizovaný má HMGB1 však ještě další funkci - je označován jako alarmin a patří mezi molekulární vzory asociované s poškozením (DAMP, damageassociated molecular patterns). Mimo buňku působí jako cytokin, chemoatraktant pro zánětové buňky, vyvolává maturaci dendritických buněk a stimuluje TH1 polarizaci (Messmer et al. 2004; Rovere-Querini et al. 2004; Dumitriu et al. 2005; Palumbo et al. 27

29 2007). Uvolňují ho aktivované monocyty a makrofágy po stimulaci lipopolysacharidem, TNF-α nebo IL-1β (Wang et al. 1999). Spontánně je uvolňován nekrotickými buňkami, kdy indukuje prozánětlivé reakce (Scaffidi et al. 2002), podporuje hojení a angiogenezi (Mitola et al. 2006). Pokud je přítomen extracelulárně váže se na receptory označované jako PPR (pattern recognition receptors): Toll-like receptor 2, 4 a 9 (TLR2, TLR4, TLR9) a receptor pro konečné produkty pokročilé glykace (RAGE, receptor for advanced glycosylation end products) (Hori et al. 1995; Apetoh et al. 2007; Chen et al. 2007; Tian et al. 2007). Aktivací receptoru RAGE vyvolává HMGB1 maturaci dendritických buněk (Messmer et al. 2004) a navíc zvyšuje jejich citlivost k chemokinům (Yang et al. 2007). Dendritické buňky samy uvolňují HMGB1 a stimulují migraci do lymfatických uzlin (Dumitriu et al. 2007). Nezralé dendritické buňky odpovídají na signál chemokinu CCL5, zatímco zralé DC jsou citlivé na chemoatraktant CCL21 a putují do sekundárních lymfatických orgánů, což je důležité pro jejich funkci prezentace antigenů naivním T lymfocytům. Významnou roli hraje HMGB1 při apoptóze, kdy je uvolňován do extracelulárního prostředí pouze buňkami, které umírají po působení antracyklinových léčiv, OXP a nebo vlivem ionizačního záření (Apetoh et al. 2007). Apetoh a kolektiv ukázali, že HMGB1 není potřeba pro maturaci DC, ale přispívá k lepší prezentaci pohlcených antigenů vazbou na TLR4 a aktivací signalizační kaskády TLR4/MyD88. Aktivace TLR4 brání rychlé degradaci fagocytovaného materiálu z umírajících buněk, tím umožňuje zpracování antigenu a jeho prezentaci dendritickou buňkou (Shiratsuchi et al. 2004). Pokud se dendritickým buňkám vyřadí TLR4, ztratí schopnost prezentovat antigen umírajících buněk T lymfocytům Obdobně je narušena imunogenicita nádorových buněk po použití blokující protilátky proti HMBG1 nebo pokud je syntéza HMGB1 zastavena. Vliv signalizace HMGB1 přes TLR4 byl zkoumán i u lidí. Zjistili, že u pacientů s karcinomem prsu, kteří měli mutaci v genu pro TLR4 (záměna jednoho nukleotidu A896G, Asp299 Gly), docházelo k relapsu onemocnění a k častějšímu výskytu metastáz než u pacientů s normální alelou pro TLR4. Dendritické buňky pacientů s mutovanou alelou TLR4 vykazovaly sníženou afinitu k HMGB1 a hůře prezentovaly antigeny z nádorových buněk (Apetoh et al. 2007) ATP Vedle uvolnění HMGB1 uvolňují nádorové buňky po působení řady různých induktorů buněčné smrti (doxorubicin, mitoxantron, oxaliplatina, cis-platina, etoposid aj.) také ATP (Ghiringhelli et al. 2009; Martins et al. 2009). ATP je rozpoznáváno především purinergními receptory rodiny P2RX7 (Di Virgilio 2007). Po aktivaci těchto receptorů dochází k tvorbě a skládání NLRP3 inflamazómu, který je tvořen NLRP3 (NOD-like receptor 3, cryopyrin)-asc (apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain) a aktivuje kaspázu-1 (Sutterwala et al. 2006). Kaspáza-1 následně štěpí cytozolický pro-il-1β na aktivní sekretovaný IL-1β (Martinon et al. 2002). Sekretovaný IL-1β nemá vliv na samotné dendritické buňky, nedochází jeho vlivem k aktivaci ani maturaci, ani není ovlivněno zpracování a prezentace antigenů z pohlcených 28

30 buněk. IL-1β je důležitý následně pro priming CD8+ T lymfocytů na nádorově specifické cytotoxické T lymfocyty, které produkují IFNγ (Ghiringhelli et al. 2009). Ghiringhelli a kolektiv zjistili, že k protinádorové imunitní reakci přispívají CD8+ T lymfocyty spíše produkcí IFNγ, než jejich cytolytickými funkcemi (Hinrichs et al. 2006; Ghiringhelli et al. 2009). K aktivaci NLRP3 inflamazómu v dendritických buňkách může přispívat i HMGB1, uvolněný spolu s ATP z umírajících buněk, signalizací přes TLR4 (Ghiringhelli et al. 2009). 29

31 3 MATERIÁL A METODY 3.1 Roztoky Fosfát-fyziologický roztok (PBS) 9,0 g NaCl (Lach-Ner) 1,2 g Na2HPO4.12H2O (Lach-Ner) 0,2 g NaH2PO4.H2O (Lach-Ner) doplnit do 1l destilovanou vodou a upravit na ph 7,35 10x koncentrovaný Tris pufr (TBS) 24,2 g Tris (tris-(hydroxymethyl)-aminomethan; ph 8,8; Sigma-Aldrich) 80 g NaCl (Lach-Ner) doplnit do 1l destilovanou vodou a upravit na ph 7,6 10x koncentrovaný elektrodový roztok pro elektroforézu 30,3 g Tris 144 g glycin (Sigma-Aldrich) 10 g SDS (dodecylsulfát sodný, Sigma-Aldrich) doplnit do 1l destilovanou vodou, ph upravit na 8,3 Extrakční roztok pro izolaci proteinů (20 ml) 20 µl Nonidet P-40 (1%) (Pierce) 200 µl orthovanadát sodný Na 3 VO 4 (1 mm, Sigma-Aldrich) 0,0074 g Na 2 EDTA.2H 2 O (sodná sůl kyseliny ethylendiamin-n,n,n',n'-tetraoctové, Invitrogen) 0,0152 g EGTA (ethylenglykol-di-(2-aminoethylether)-tetraoctová kyselina, Invitrogen) 0,0084 g fluorid sodný NaF (Lachema) 0,0031 g DTT (dithiothreitol; Sigma-Aldrich) 1000 µl inhibitory proteáz: Protease inhibitor Coctail (4-(2- aminoethyl)benzensulfonyl fluorid (AEBSF), pepstatina, E-64, bestatin, leupeptin a aprotinin; Sigma-Aldrich) 5 µl PMSF (fenylmethansulfonyl fluorid, Sigma-Aldrich), skladován jako zamražený 0,3 M roztok v DMSO (dimethyl sulfoxid) doplnit do 20 ml Tris, ph 7,4 Hypotonický roztok pro izolaci komponent plazmatické membrány 10 mm HEPES (kyselina 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethansulfonová; ph 7,2; Sigma-Aldrich) 42 mm chlorid draselný KCl (Lachema) 5 mm chlorid hořečnatý MgCl 2 (Lachema) 1mM PMSF 30

32 1mM orthovanadát sodný Na 3 VO 4 1mM fluorid sodný NaF 10% roztok inhibitorů proteáz Protease Inhibitor Coctail 3x koncentrovaný SDS sample pufr (10 ml) 0,0985 g Tris 0,6 g SDS 0,03 g bromfenolová modř (Lachema) 3 ml glycerol 0,231 g DTT, skladován jako zamražený 5M roztok v H 2 O (13 µl DTT se přidá k 300 µl SDS sample pufru v čas spotřeby) doplnit do 10ml destilovanou vodou Blotovací roztok (1000 ml) 5,82 g Tris 2,93 g glycin 0,375 g SDS 200 ml methanol (Lachema) doplnit do 1l destilovanou vodou, ph se neupravuje, ph~ 9,0-9,4 Promývací pufr (TBS/T) TBS obsahující navíc: 0,1% Tween-20 (Sigma- Aldrich) Blokovací roztok TBS obsahující navíc: 0,1% Tween-20 5% nízkotučné sušené mléko nebo 2% BSA (bovine serum albumin, ICN Biomedicals) Roztok pro ředění primární protilátky (imunoblot) TBS obsahující navíc: 0,1% Tween-20 5% BSA Roztok pro průtokovou cytometrii (FACS roztok) PBS obsahující navíc: 2mM Na2EDTA roztok (Invitrogen) 2% FCS (fetal calf serum, Invitrogen) 0,05% azid NaN 3 Roztok pro magnetickou separaci buněk (MACS roztok) PBS obsahující navíc : 2mM Na2EDTA roztok 0,5% BSA Roztok pro značení buněk CFSE (karboxyfluorescein sukcinimidyl ester) PBS obsahující navíc: 0,1% BSA 31

33 Směs pro 10% dělící polyakrylamidový gel (10 ml) 4,0 ml destilovaná H2O 3,3 ml 30% akrylamidový mix (Roth) 2,5 ml 1,5 M Tris (ph 8,8) 0,1 ml 10% SDS Těsně před nalitím gelu se přidají polymerační činidla: 0,15 ml 10% APS (persíran amonný, Serva) 0,006 ml TEMED (N, N, N, N - tetramethylethylendiamin, Serva) Směs pro 8% dělící polyakrylamidový gel (10 ml) 4,6 ml destilovaná H 2 O 2,7 ml 30% akrylamidový mix (Roth) 2,5 ml 1,5M Tris (ph 8,8) 0,1 ml 10% SDS Těsně před nalitím gelu se přidají polymerační činidla: 0,15 ml 10% APS 0,006 ml TEMED Směs pro 4% zaostřovací polyakrylamidový gel (4ml) 2,7 ml destilovaná H2O 0,67 ml 30% akrylamidový mix 0,5 ml 0,5M Tris (ph 6,8) 0,04 ml 10% SDS Těsně před nalitím gelu se přidají polymerační činidla: 0,06 ml 10% APS 0,006 ml TEMED Standardní kultivační médium pro buněčné kultury (500ml) 450 ml 1x koncentrované RPMI 1640 (Gibco) s NaHCO3 (Sigma-Aldrich) 200mM glutamin (Sigma-Aldrich) 100mM pyruvát sodný (Sigma-Aldrich) 1,5M HEPES (ph 7,2) 5 ml antibiotika ( U penicilin + 10 mg streptomycin/ml, Sigma-Aldrich) 50mM 2-merkaptoethanol (Sigma-Aldrich) teplem inaktivované telecí sérum FCS bylo přidáno do konečné koncentrace 10 % 32

34 3.2 Volný doxorubicin a polymerní konjugáty Jako volný doxorubicin byl používán Dox.HCl (Fluka Chemie), který byl uchováván při teplotě -20 C. HPMA (N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid) konjugáty byly syntetizovány a charakterizovány na Ústavu makromolekulární chemie AV ČR, v.v.i. v laboratoři prof. Ing. Karla Ulbricha, DrSc.(Ulbrich et al. 2000). Polymerní konjugáty byly uchovávány při 4 C. V experimentech jsme používali tyto konjugáty (Tab. 4.2) Příprava léčiv pro inkubaci in vitro Volný doxorubicin ve formě Dox. HCl byl vytemperován na laboratorní teplotu, odvážen na analytických vahách a rozpouštěn ve sterilní destilované vodě. Polymerní konjugáty byly rozpouštěny ve standardním RPMI médiu ve tmě za stálého míchání, dokud nedošlo k úplnému rozpuštění Aplikace léčiv in vivo Volný doxorubicin ve formě Dox. HCl byl vytemperován na laboratorní teplotu, odvážen na analytických vahách a rozpouštěn ve sterilní destilované vodě. Polymerní konjugáty byly vytemperovány na laboratorní teplotu, odváženy na analytických vahách a rozpouštěny ve sterilním PBS ve tmě za stálého míchání. Pro aplikaci do myši bylo připraveno 200 µl roztoku, který byl myši podán intravenózně do ocasní žíly injekční stříkačkou. 3.3 Protilátky Protilátky použité pro imunoblot Primární protilátky byly ředěny v roztoku pro ředění primární protilátky v poměru 1:1000: biotinylovaná anti-mouse β-actin, goat anti-mouse CD7 a CD43, rabbit anti-mouse CD44, CD45 (Santa Cruz Biotechnology), rabbit anti-mouse calreticulin (Stressgen), rabbit antimouse ERp57, rabbit anti-mouse HMGB1 (Abcam), biotinylovaná anti-mouse CD47 (R&D Systems), rabbit anti-mouse eif2α, rabbit anti-mouse phospho eif2α (Cell Signaling). Sekundární protilátky IgG nesoucí enzym křenovou peroxidázu (horseraddish peroxidase, HRP) byly ředěny v blokovacím roztoku v poměru: 1: anti-biotin IgG-HRP, 1: anti-mouse IgG-HRP, 1: anti-rabbit IgG-HRP (Cell Signaling), 1: anti-goat IgG-HRP (Santa Cruz) Protilátky použité pro analýzu buněk na průtokovém cytometru Primární protilátky byly ředěny ve FACS roztoku v čas spotřeby v poměru 1:100: rabbit anti-mouse calreticulin (Stressgen), biotinylovaná anti-mouse CD47 (R&D Systems), rabbit anti-mouse ERp57 (Abcam), biotinylovaná anti-mouse CD8 (ebioscience) Sekundární protilátky byly ředěny ve FACS roztoku v čas spotřeby v poměru 1:500: streptavidin-qdot525, goat anti-rabbit Alexa Fluor 647, goat anti-mouse Alexa Fluor 633 (Invitrogen), streptavidin-apc (ebioscience). 33

35 Fluorescenčně značené protilátky byly ředěny v poměru 1:200: anti-mouse CD11c-Alexa Fluor 700, anti-mouse MHC II (I-A/I-E)-Alexa Fluor 700 (ebioscience). 3.4 Buňky a experimentální zvířata Buněčné linie EL-4 buněčná linie (ATCC TIB-39) byla odvozena z T buněčného lymfomu vyvolaného 9,10-dimethyl-1,2-benzanthracenem pocházející z myšího kmene C57BL/6 (Gorer 1950). Tato linie je v systému in vitro suspenzní. EL4.IL2 linie, jedná se o podtyp buněčné linie EL-4 (ATCC TIB-181), který produkuje IL- 2 jako odpověď na forbol-12-myristát-13-acetát (PMA) (Farrar et al. 1980). Tato linie je v systému in vitro suspenzní. B16-F10 buněčná linie (ATCC CRL-6475) myšího melanomu pocházející z kmene myší C57BL/6J (Fidler 1975). Linie je v systému in vitro adherentní. 38C13 je linie myšího B buněčného lymfomu, kterou laskavě poskytl MUDr. Jan Kovář ze 3. lékařské fakulty UK v Praze. Linie je v systému in vitro suspenzní. CT26 buněčná linie (ATCC CRL-2638) je myší karcinom tlustého střeva, který byl indukován N-nitroso-N-methyl uretanem (NNMU) v myším kmenu BALB/c (Wang et al. 1995). Linie je v systému in vitro adherentní. BCL1 (ATCC TIB-197) je linie spontánní B buněčné leukémie odvozená od imbredního myšího kmene BALB/c (Strober et al. 1979). V syngenním příjemci nevytváří solidní nádor, ale osidluje peritoneum a později i periferní lymfatické uzliny. Linie je v systému in vitro adherentní. 4T1 buněčná linie (ATCC CRL-2539) představuje myší model pro lidský karcinom prsní žlázy stadia IV, pochází z kmene BALB/cfC3H (Aslakson a Miller 1992). V myších BALB/c tvoří spontánně vysoce metastatické nádory, které metastazují do plic, jater, lymfatických uzlin a mozku. Linie je v systému in vitro adherentní. Raji (ATCC CCL-86) je lidská linie buněčného B lymfomu. Byla ustanovena R.J.V. Pulvertaftem v roce 1963 z Burkittova lymfomu 11letého chlapce (Pulvertaft 1964). Pozitivní pro Epstein-Barr virus (EBV)-indukovaný jaderný antigen (EB-NA). Linie je v systému in vitro suspenzní. Splenocyty byly vyizolovány z myšího kmene C57BL/6 a použity pro in vitro pokusy Kultivace buněčných linií Všechny buněčné linie a splenocyty byly kultivovány při teplotě 37 C v atmosféře 5% CO 2 v kultivačním boxu (Sanyo). Buněčná linie EL4 rostla ve standardním RPMI kultivačním mediu (složení popsáno výše). Linie EL4.IL2 a B16F10 byly kultivovány v D-MEM (Dulbecco s modified Eagle s medium) médiu doplněným o L-glutamin (4mM), glukózu (4,5 g/l), penicilin (100 U/ml), streptomycin (100 µg/ml) a 10 % FTS. 38C13 buňky a buňky linie BCL1 byly kultivovány ve standardním RPMI 1640 médiu doplněným o L-glutamin (4 mm), 2-merkaptoethanol (0,05 mm), HEPES (10 mm), pyruvát sodný (1,0 mm), penicilin (100 U/ml), streptomycin (100 U/ ml), and 10 % FTS. Buněčné linie Raji a 4T1 byly kultivovány v RPMI

36 médiu doplněným o L-glutamin (4 mm), penicilin (100 U/ml), streptomycin (100 µg/ml), pyruvát sodný (1,0 mm), HEPES (10 mm), 4,5 g/l glukózy a 10% FTS. CT26 rostly v RPMI 1640 médiu doplněným o L-glutamin (4 mm), penicilin (100 U/ml), streptomycin (100 µg/ml), 4,5 g/l glukózy a 10 % FTS. Splenocyty byly kultivovány ve standardním RPMI 1640 médiu s L-glutaminem (4 mm), penicilinem (100 U/ml), streptomycinem (100 µg/ml) a 10 % FTS Pasážování buněk Buňky byly pasážovány, když dosáhly vysoké, ale ne maximální populační hustoty. Buňky, které rostou v suspenzi (EL4, EL4.IL2, 38C13, Raji), byly odebrány pipetou z kultivační lahve a stočeny (300 g, 5 min, 4 C). Adherentní buňky (CT26, B16F10, 4T1, BCL1) byly z lahve uvolněny inkubací s trypsinem po 10 min v 37 C a stočeny. Pokud byly adherentní buňky použity pro analýzu na průtokovém cytometru, byly z lahve uvolněny pouze inkubací s EDTA (10 min, 37 C). Pelety byly resuspendovány v médiu a ~500 µl buněčné suspenze bylo použito pro další kultivaci. Počítání buněk bylo prováděno pomocí Bürkerovy komůrky pod mikroskopem v trypanové modři Inkorporace [ 3 H] tymidinu Testované buňky byly kultivovány v 96ti jamkové destičce (s rovným dnem) bez anebo s Dox. HCl, Dox-HPMA HYD nebo Dox-HPMA AM v různých koncentracích (viz Výsledky) po 48 hod v 5% CO 2 atmosféře při teplotě 37 C. Na posledních 6 hodin inkubace bylo přidáno do každé jamky 50 µl roztoku [ 3 H] tymidinu (18,5 kbq; Lacomed). Poté byly buňky z destičky přeneseny na filtrační membránu se skelnými vlákny (Printed Filtermat A, Wallac) pomocí automatického sběrače (Wallac). Membrána byla usušena v digestoři za laboratorní teploty. Poté byla zasunuta s destičkou plastického scintilátoru (MeltiLex TM A, Wallac) do foliové kapsy a na zatavovacím přístroji (Microsealer, Wallac) byl scintilátor protaven skrz membránu. Měření aktivity (cpm) jednotlivých jamek probíhalo na přístroji MicroBeta 1450 Trilux (Wallac) Experimentální zvířata Pro experimenty byly použity myši kmene C57BL/6 (Ly 5.1) a BALB/c, získané z chovu FGÚ AV ČR, v. v. i. Myší kmen C57BL/6 (Ly 5.2) byl získán z chovu ÚMG AV ČR, v. v. i. V průběhu pokusů byly myši chovány v konvenčních podmínkách a krmeny standardní dietou. Věk myší použitých v experimentech se pohyboval v rozmezí 9-15 týdnů Nesterilní izolace splenocytů Kongenní Ly5.1 myš kmene C57BL/6 byla usmrcena cervikální dislokací a byla jí odejmuta slezina. Pro dezintegraci slezinné tkáně byla slezina propláchnuta injikací teplého Hanksova roztoku (Sigma-Aldrich) s kolagenázou D (1 mg/ml; Roche) a slezina byla následně roztrhána injekční jehlou. Tkáň byla v Petriho misce ponechána 30 min při teplotě 37 C. Vše bylo přefiltrováno přes 30 µm nylonová vlákna. Suspenze byla stočena 35

37 (300 g, 5 min., 4 C) a odebrán supernatant s buňkami. Získané splenocyty byly spočítány a ještě tentýž den použity pro pokus in vitro Sterilní izolace splenocytů pomocí Histopaque 1083 Myš kmene BALB/c nebo C57BL/6 byla usmrcena cervikální dislokací a byla jí odejmuta slezina. Slezina byla homogenizována v Hanksově roztoku pomocí skleněného homogenizátoru za sterilních podmínek v laminárním boxu. Suspenze byla stočena (300 g, 5 min, 4 C), promyta Hanksovým roztokem a znovu stočena. Do 15 ml kyvety byly napipetovány 3 ml roztoku Histopaque 1083, který byl velmi opatrně převrstven slezinnou suspenzí. Suspenze byla stočena (350 g, 30 min, 4 C). Po stočení byla odebrána tenká vrstva oddělených mononukleárních buněk, které byly spočítány a převedeny do kultivační lahve. Splenocyty byly kultivovány, dokud nebyly použity k in vitro pokusům. Část splenocytů byla před dalším použitím stimulována 24 hodinovou inkubací s konkanavalinema (ConA, koncentrace 5 µg/ml) Izolace dendritických buněk ze slezinných buněk pomocí pozitivní magnetické separace Slezinné buňky byly získány postupem popsaným výše (viz kapitola 3.4.6). V buněčné suspenzi byly označeny CD11c + buňky pomocí magnetických kuliček s navázanou CD11c protilátkou (MicroBeads, Miltenyi Biotec). Suspenze byla převedena do magnetické kolonky velikosti L Macs Colmn (Miltenyi Biotec), která byla umístěna v magnetickém poli MACS separátoru (Miltenyi Biotec). V kolonce se zachytily CD11c + buňky a zbytek buněčné suspenze kolonkou protekl. Po odstranění kolonky z magnetického pole se CD11c + buňky uvolnily, byly spočítány a tentýž den byly použity pro in vitro pokusy Značení buněk CFSE Buňky byly 1x promyty ledovým roztokem pro značení buněk CFSE a stočeny (300g, 5 min, 4 C). Peleta byla rozsuspendována v teplém roztoku pro značení buněk CFSE (37 C). 1-2x10 7 buněk bylo obarveno 1-2 µl 5mM CFDA SE (karboxyfluorescein diacetát, sukcinimidyl ester, jinak také nazývaný CFSE; Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit, Invitrogen) v DMSO a byly inkubovány 10 min ve tmě při teplotě 37 C. Reakce byla zastavena promytím ledovým CFSE roztokem a 1x standardním kultivačním médiem. Takto označené buňky byly připraveny k injikování do myší. Při in vitro experimentech byla použita 10x nižší koncentrace CFSE barviva Izolace proteinů z buněčného homogenátu Buňky byly odebrány z kultivační lahve a převedeny do 50 ml kyvety. Buněčná suspenze byla stočena (300 g, 5 min., 4 C), promyta a spočítána. Následně bylo odebráno 1x10 7 buněk, které byly dvakrát promyty na ledu ve studeném TBS pufru s 1µM orthovanadatanu sodného. Buňky byly stočeny (4000 g, 5 min., 4 C). Peleta byla na ledu rozsuspendována ve 100µl extrakčního pufru. V průběhu následujících 30 min byla suspenze 10x protažena čistou injekční stříkačkou a ponechána dalších 30 min na ledu. Po inkubaci v extrakčním pufru byl lyzát stočen ( g, 5 min., 4 C) a odebrán supernatant. Po stanovení obsahu proteinu pomocí BCA byl vzorek rozalikvótován 36

38 (konečná koncentrace proteinu 15 µg/10 µl) a přidán SDS sample pufr. Takto připravený vzorek proteinů byl zamražen v -20 C Izolace proteinů z buněčného supernatantu Buňky byly po inkubaci odebrány z kultivační lahve, stočeny (300g, 5 min, 4 C) a peleta byla použita pro izolaci proteinů. Získaný supernatant byl zahuštěn pomocí centrifugačních kyvet Amicon Ultra 10k (Millipore). Pro odstranění zbytků odumřelých buněk byl supernatant ultracentrifugován ( g, 90 min, 4 C). V supernatantu bylo změřeno množství proteinu, přidán SDS sample pufr a vzorky byly zamraženy v -20 C. Absence kontaminace intracelulárními proteiny byla potvrzena western blotem, kdy nebyla zjištěna přítomnost β-aktinu ve vzorcích Izolace membránových proteinů Pro izolaci povrchových membránových proteinů byl použit Cell Surface Protein Isolation Kit (Pierce). Celé buňky byly 30 minut inkubovány v biotinylačním roztoku při teplotě 4 C za stálého míchání. K buněčné suspenzi byl přidán zhášecí roztok, kterým se zastavila reakce biotinylace, a TBS pufr. Buňky byly stočeny (500 g, 3 min) a znovu promyty TBS. Poté byly buňky lyzovány a biotinylované proteiny byly separovány na kolonkách s NeutrAvidin agarózou. Navázané proteiny byly uvolněny inkubací s SDS sample pufrem obsahujícím 50mM DTT. Takto připravený vzorek proteinů byl zamražen v -20 C. Absence kontaminace intracelulárními proteiny byla potvrzena western blotem, kdy nebyla zjištěna přítomnost β-aktinu ve vzorcích Izolace komponent plasmatické membrány pro HPAEC-PAD analýzu sacharidů 1x10 9 EL4 buněk bylo odebráno z kultivační lahve a 3x promyto PBS. Peleta byla nesuspendována v hypotonickém pufru a buňky v něm byly inkubovány po 30 min. V průběhu inkubace byla buněčná suspenze 10x protažena injekční jehlou. Lyzát byl stočen (400g, 2 min, 4 C), supernatant byl pak převeden do nové mikrozkumavky a znovu stočen. Získaný supernatant byl opět převeden do nové mikrozkumavky a stočen ( g, 12 min, 4 C). Peleta byla před HPAEC-PAD analýzou uchována v -80 C Stanovení množství proteinu pomocí kitu BCA Z vyizolovaného buněčného lyzátu bylo odebráno 2,5 µl vzorku do kyvetky a přidáno 49 µl činidla A a 1 µl činidla B (BCA kit, Piers). Kyveta byla ponechána 30 min při teplotě 37 C, poté ochlazena na laboratorní teplotu a vzorek byl změřen na Biophotometru (Eppendorf) nastaveným na program BCA. 37

39 3.5 Detekce molekul pomocí western blotu Příprava polyakrylamidových gelů Gely byly připravovány pomocí sestavy pro nalévání gelů MiniProtean od firmy BioRad. Po sestavení zařízení byla nalita polyakrylamidová směs pro dělící gel mezi dvě skla (spacer O,75mm) přibližně 2cm pod okraj menšího skla. Poté byl gel převrstven izopropanolem (Sigma-Aldrich), který po ztuhnutí gelu byl vymyt destilovanou vodou a místo osušeno filtračním papírem. Na dělicí gel byla nalita směs pro zaostřovací polyakrylamidový gel a vložen plastový hřeben. Zpolymerovaný gel byl následně použit pro elektroforézu, nebo uložen do lednice a uchováván při 4 C do druhého dne Elektroforéza SDS PAGE Připravené proteiny v SDS sample pufru byly povařeny v termobloku (Eppendorf) po dobu 10 minut, cytozolární proteiny při teplotě C, purifikované nebo membránové při 80 C. Proteinový standardní žebříček (Cell Signaling) byl povařen po dobu 2 min při teplotě C. Vzorky a žebříček byl poté stočen (300 g, 5 min). Vzorky byly naneseny v koncentraci 20 µg proteinu na jamku a 5-10 µl proteinových markerů na jamku. Na vysokonapěťovém zdroji (PowerPac HV Power Supply, BioRad) bylo nastaveno konstantní napětí V. Elektroforéza běžela přibližně 1 hodinu, dokud čelo bromfenolové modři nedosáhlo spodního okraje gelu Western blot Na blotovací desce (Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell, BioRad) byl připraven filtrační papír s nitrocelulózovou membránou (GE healthcare), obojí navlhčené v blotovacím pufru. Na membránu byl položen dělicí gel a navrch opět navlhčený filtrační papír. Zkumavkou byly odstraněny vzduchové bubliny. Komora byla uzavřena a připojena ke zdroji. Blotování probíhalo 1 hodinu za konstantního proudu 1,5 ma/cm Imunoblot Nitrocelulózová membrána s přenesenými proteiny byla promyta 5 min v 25 ml TBS pufru, následně byla 1 hod inkubována v blokovacím pufru za stálého míchání při laboratorní teplotě, poté byla 3x promyta 5 min v TBS/T pufru. Dále byla membrána inkubována za stálého míchání s primární protilátkou přes noc při 4 C a po inkubaci byla 3x promyta 5 min v TBS/T pufru. Membrána byla inkubována se sekundární protilátkou nesoucí enzym HRP v blokovacím pufru po dobu 1 hodiny za laboratorní teploty. Na závěr byla membrána 3x promyta 5-10 min v TBS/T pufru. Membrána byla inkubována v roztoku chemiluminiscenčního substrátu luminolu a peroxidu vodíku: LumiGLO (Cell Signaling) nebo SuperSignal West Femto (Pierce). Chemiluminiscenční signál byl zaznamenán pomocí kamery LAS-1000 CCD (Leica). V některých případech byla membrána přeexponována na fotografický snímek (Kodak) a vyvolána. 38

40 3.6 Průtoková cytometrie Analýza buněk byla prováděna na průtokovém cytometru LSR II (BD Bioscience), pro následné vyhodnocení dat byl využit FlowJo software (Tree Star). Experiment byl sestavován tak, že destička obsahovala kontrolní buňky, kontrolní buňky pouze se sekundární protilátkou a měřené buňky inkubované s primární i sekundární protilátkou Životnost EL4 buněk po inkubaci s léčivy EL4 buňky byly odebrány z kultivační lahve, stočeny a spočítány. Poté byly rozpipetovány do 12ti jamkové destičky v množství 1x10 6 buněk na jamku. K buňkám byly přidány různé koncentrace volného Dox (Dox. HCl) anebo HPMA konjugátů. Kontrolní buňky byly ponechány bez léčiva a inkubovány pouze v médiu. Objem jamek byl doplněn na 1 ml a destičky byly vloženy do kultivačního boxu. Buňky byly inkubovány po 24 hodin nebo 72 hodin. Buňky byly odebrány z 12ti jamkové kultivační destičky a rozpipetovány do 96ti jamkové destičky (dno typu V) na ledu. Destička byla stočena (300 g, 5 min., 4 C), 3x promyta FACS roztokem. Do každé jamky bylo napipetováno 30 µl FACS roztoku a 10 µl Hoechst (10 µg/ml, Invitrogen). Životnost buněk pak byla změřena na průtokovém fluorocytometru Analýza vazby lektinů EL4 buňky byly kultivovány s volným Dox anebo HPMA konjugáty 24 hodin v 5% CO 2 atmosféře při teplotě 37 C. Poté bylo odebráno vždy 5x10 5 buněk, které byly promyty FACS roztokem a dále s nimi bylo pracováno na ledu. EL4 buňky byly inkubovány 15 min s biotinylovanými lektiny: aglutinin z Arachis hypogea (PNA, peanut agglutinin), lektin Maackia amurensis II (MAL II), aglutinin z Glycine max (SBA, soybean aglutinin), aglutininy Aleuria aurantia, Ulex europaeus, Erythrina cristagalli (ECA) (vše 1 µg/ml) nebo aglutinin Sambucus nigra, jackfruit lektin (Jacalin) (0,1 µg/ml) nebo (0,01 µg/ml) aglutinin z pšeničných klíčků (WGA, wheat germ agglutinin), Concanavalin A (ConA), aglutinin Phaseolus vulgasis (PVA), (vše Vector Laboratories). Poté byly odmyty nenavázané lektiny a buňky byly inkubovány 20 min se streptavidin-apc (1:500) ve tmě na ledu. Destička byla 3x promyta FACS roztokem a analyzována pomocí přístroje LSRII Analýza vazebné aktivity galektinu-1 EL4 buňky byly kultivovány s Dox. HCl nebo HPMA konjugáty 24 hodin. Poté bylo odebráno vždy 5x10 5 buněk, které byly promyty FACS roztokem a dále s nimi bylo pracováno na ledu. Buňky byly inkubovány 60 min v PBS roztoku s různými koncentracemi rekombinantního galektinu-1 (R&D Systems). Poté byly 3x promyty FACS roztokem a 20 min byly inkubovány s biotinylovanou protilátkou proti galektinu-1. Po inkubaci byly buňky 3x promyty a inkubovány se streptavidin-apc (1:500) po dobu 20 min ve tmě na ledu. Destička byla 3x promyta FACS roztokem a analyzována pomocí přístroje LSRII. 39

41 3.6.4 Analýza buněčné smrti indukované galektinem-1 EL4 buňky byly inkubovány s Dox. HCl nebo HPMA konjugáty 24 hodin. Poté bylo 2x10 5 buněk inkubováno 5 hodin ve standardním médiu pouze s různými koncentracemi rekombinantního galektinu-1 anebo navíc se specifickým inhibitorem, β-laktózou (Sigma- Aldrich) pro kontrolu. Buňky byly promyty PBS a byly analyzovány pomocí annexinu V- Dyomics 647 (Exbio) a propidium jodidu na LSRII Detekce povrchových molekul buněk po inkubaci s volným doxorubicinem či HPMA konjugáty Buňky nádorových linií a splenocyty byly odebrány z kultivační lahve, stočeny a spočítány. Poté byly rozpipetovány do 12ti jamkové destičky v množství 1x10 6 buněk na jamku. K buňkám byly přidány různé koncentrace volného doxorubicinu(dox. HCl) anebo HPMA konjugátů. Kontrolní buňky byly ponechány bez léčiva a inkubovány pouze v médiu. Objem jamek byl doplněn na 1 ml a destičky vloženy do kultivačního boxu na 24 hodin. Buňky byly odebrány z 12ti jamkové kultivační destičky a rozpipetovány do 96ti jamkové destičky (dno typu V) na ledu. Destička byla stočena (300g, 5 min., 4 C), 3x promyta FACS roztokem. K buňkám bylo přidáno 30 µl primární protilátky naředěné ve FACS roztoku v poměru 1:100. Buňky byly ponechány 30 min na ledu a poté 3x promyty FACS roztokem. Do jamek byla napipetována sekundární protilátka naředěná ve FACS roztoku 1:500, destička byla ponechána ve tmě na ledu 30 min. Po inkubaci se sekundární protilátkou byla destička 3x promyta FACS roztokem, peleta buněk byla resuspendována v 30 µl FACS roztoku a připravena k měření. Těsně před měřením na průtokovém cytometru bylo k buňkám přidáno 10 µl Hoechst Fagocytóza nádorových buněk a splenocytů in vitro Buňky nádorové linie 38C13 a EL4 byly 24 hodin inkubovány buď s volným doxorubicinem nebo s polymerními konjugáty v kultivačním boxu (37 C, 5% CO 2 ). Stejným způsobem byly inkubovány myší splenocyty a ConA předstimulované splenocyty získané z kongenních myší Ly 5.1 C57BL/6 (viz kapitola 3.4.7). Splenocyty a nádorové buňky byly poté obarveny 1mM CFSE (viz kapitola 3.4.9). Dendritické buňky byly získány izolací ze sleziny standardního myšího kmene Ly 5.2 C57BL/6 pomocí pozitivní magnetické separace (viz kapitola 3.4.8). Dendritické buňky byly rozpipetovány do 96ti jamkové destičky (dno typu V), pak k nim byly přidány CFSE označené: splenocyty, ConA stimulované splenocyty, nádorové buňky 38C13 nebo EL4 v poměru 1:1 nebo 1:5. Společně byly kultivovány 2 hodiny v kultivačním boxu. Destička byla stočena, 3x promyta FACS roztokem. Buňky byly inkubovány 20 min s fluorescenčně značenou protilátkou anti-mhc II (I-A/I-E)-Alexa Fluor 700 ředěné v poměru 1:100, poté 3x promyty a připraveny k měření. Dendritické buňky, které fagocytovaly CFSE označené buňky, byly analyzovány jako CFSE a Alexa Fluor 700 dvojitě pozitivní. 40

42 3.6.7 Fagocytóza nádorových buněk EL4 in vivo EL4 buňky byly inkubovány 24 hodin s Dox. HCl nebo s HPMA konjugáty. 1x10 7 EL4 buněk bylo obarveno CFSE značením a podáno intravenózně v objemu 200 µl PBS myši standardního kmene C57BL/6. Kontrolním myším bylo podáno 200 µl PBS. Po dvou hodinách byly myši usmrceny cervikální dislokací a byly jim odebrány sleziny. Splenocyty byly vyizolovány dezintegrací tkáně pomocí kolagenázy D a přeneseny do 96ti jamkové destičky (dno typu V). K suspenzi splenocytů byl přidán Fc blok (5 µl/ml anti-mouse CD16/CD32 mab, ebioscience). Splenocyty byly inkubovány 20 min na ledu s primární protilátkou v koncentraci 1:100 anti-cd8-biotin, dále byly buňky 3x promyty. K splenocytům byla přidána fluorescenčně značená protilátka anti-cd11c-alexa Fluor 700 a streptavidin značený barvičkou Qdot 525 (Invitrogen). Splenocyty byly inkubovány ve tmě na ledu 20 min. Poté byly buňky stočeny, 3x promyty FACS roztokem a ve 30 µl téhož roztoku byly připraveny k měření na průtokovém cytometru. Při analýze byly hodnoceny dendritické buňky (CD11c+ buňky) a CFSE+ CD8 pozitivní subpopulace dendritických buněk. 41

43 4 VÝSLEDKY 4.1 Vliv doxorubicinu a HPMA konjugátů na proliferaci a životnost nádorových EL4 buněk Nejprve jsme měřili cytostatický efekt různých forem doxorubicinu na buněčnou linii T myšího lymfomu EL4. Hodnota IC 50 reprezentuje koncentraci doxorubicinu, která je potřebná ke snížení proliferace EL4 buněk na 50% oproti kontrolním EL4 buňkám po 48 hodinové inkubaci. Volný doxorubicin vykazoval nejvyšší cytostatickou aktivitu v koncentraci 0,014 µm, hodnota IC 50 pro konjugát obsahující doxorubicin navázaný ph senzitivní vazbou na HPMA kopolymer Dox-HPMA HYD byla 0,066 µm ekvivalentu Dox, zatímco IC 50 pro konjugát mající doxorubicin navázaný na HPMA kopolymer enzymaticky štěpitelnou vazbou Dox-HPMA AM byla při koncentraci 45,97 µm ekvivalentu Dox (Tab. 4.1). Vzorek koncentrace IC 50 (µm) ± SD volný doxorubicin 0,014 ± 0,0001 Dox-HPMA HYD 0,066 ± 0,013 Dox-HPMA AM 45,97 ± 3,844 Tab. 4.1 Cytostatický efekt volného doxorubicinu a doxorubicinu vázaného na polymerní HPMA nosič. Cytostatická aktivita je vyjádřená jako koncentrace doxorubicinu (µm), při které se proliferační aktivita sníží na 50 % aktivity kontrolních buněk (IC 50 ). Na Obr. 4.1 je znázorněna životnost buněk linie EL4 po inkubaci s volným doxorubicinem (Dox) či s doxorubicinem navázaným na HPMA kopolymer. Volný doxorubicin vykazoval nejvyšší cytotoxicitu, po 24 hodinové inkubaci s nejnižší koncentrací doxorubicinu (1 μm) bylo živých buněk 65%, ale s nejvyšší koncentrací doxorubicinu (50 μm) bylo živých pouze 6% EL4 buněk. Po 24 hodinové inkubaci s konjugátem obsahující doxorubicin navázaný na HPMA kopolymer ph senzitivní vazbou Dox-HPMA HYD bylo při nejnižší koncentraci 1 μm živých necelých 50%, při nejvyšší koncentraci 100 μm Dox bylo 35% buněk živých. Nejméně buněk zabíjí po 24 hodinách konjugáty s enzymaticky štěpitelnou vazbou Dox-HPMA AM a Dox-HPMA AM -HuIg, kdy bylo více než 60% EL4 buněk živých i při nejvyšší koncentraci doxorubicinu 1000 μm (Obr.4.1A). Po 72 hodinách bylo živých EL4 buněk méně než 50% po inkubaci s nejnižší koncentrací volného Dox, zatím co po inkubaci s nejvyšší koncentrací Dox zůstala pouze 3% buněk živých. Buňky inkubované s konjugátem Dox-HPMA HYD byly živé z 50%, ale po inkubaci s nejvyšší koncentrací Dox bylo živých jen 23%. Životnost buněk po inkubaci s konjugáty Dox-HPMA AM nebo Dox- HPMA AM -HuIg se pohybovala okolo 30-55% živých buněk a po inkubaci s nejvyšší koncentrací Dox (3000 μm) zbylo živých buněk 6% respektive 1% v případě Dox- HPMA AM -HuIg (Obr.4.1B). 42

44 A % živých buněk kontrolní buňky volný Dox 50 Dox-HPMA^HYD 0 Dox-HPMA^AM Dox-HPMA^AM-HuIg μm doxorubicinu B % živých buněk 100 kontrolní buňky volný Dox 50 Dox-HPMA^HYD 0 Dox-HPMA^AM Dox-HPMA^AM-HuIg μm doxorubicinu Obr. 4.1 Životnost EL4 buněk po inkubaci s různými formami doxorubicinu v různých koncentracích. EL4 buňky byly inkubovány s volným doxorubicinem nebo s různými HPMA konjugáty po A) 24 hodin nebo B) 72hodin. Životnost byla měřena na základě značení Hoechst průtokovou cytometrií. 43

45 4.2 Změny na plazmatické membráně buněk inkubovaných s volným doxorubicinem či HPMA konjugáty Přítomnost calreticulinu na povrchu buněk Sledovali jsme účinek volného doxorubicinu na přesun calreticulinu (CRT) z ER buňky na plazmatickou membránu. V pokusu bylo použito několik různých nádorových linií a jako nenádorové buňky byly použity myší splenocyty. Splenocyty byly kultivovány bez předchozí stimulace nebo předstimulované pomocí Concanavalinu A (ConA). Signifikantně zvýšené množství CRT bylo u všech buněčných linií kromě nestimulovaných splenocytů. Nejvíce CRT se objevovalo na povrchu buněk linie EL4, EL4.IL2 a CT26 a také u splenocytů stimulovaných ConA. U těchto buněčných typů bylo zvýšené množství CRT více než 14 krát oproti kontrolním buňkám (Obr. 4.2). násobky kontrol EL4 EL4.IL2 CT26 B16-F10 38C13 4T1 Raji splenocyty splenocyty+cona μm doxorubicinu Obr. 4.2 Přítomnost CRT na povrchu buněk po inkubaci s volným doxorubicinem. Buňky různých nádorových linií a splenocyty byly 24 hodin inkubovány s různými koncentracemi volného doxorubicinu. Splenocyty byly izolovány ze slezin myší kmene BALB/c. Část splenocytů byla před experimentem stimulována 24 hodinovou inkubací s Concanavalinem A (ConA). Výsledky jsou prezentovány jako násobky kontrol vztažené k množství CRT na povrchu kontrolních buněk neinkubovaných s doxorubicinem. Znamená statisticky signifikantní rozdíl (p<0.05) oproti kontrolní skupině buněk neinkubovaných s léčivy. 44

46 Inhibitory fosfatázy PP1/GADD signifikantně zvýšily množství CRT na povrchu EL4 buněk vůči množství CRT na povrchu kontrolních buněk. Inhibitor tautomycin zvýšil množství CRT na povrchu 43krát, salubrinal 21krát a calyculin A až 53krát. Množství CRT na povrchu bylo zvýšené až 70krát, pokud byly buňky inkubovány s volným doxorubicinem v koncentraci 25 μm (Obr. 4.3) násobky kontrol kontrolní buňky Doxorubicin Doxorubicin 5μM 25μM Tautomycin 150nM Salubrinal 20μM Calyculin A 30nM Obr. 4.3 Vliv PP1/GADD34 inhibitorů na množství CRT exprimovaného na povrchu EL4 buněk. Buňky linie EL4 byly 24 hodin inkubovány s uvedenými koncentracemi inhibitorů PP1/GADD34: tautomycinem, salubrinalem a calyculinem A. Buňky inkubované 24 hodin s volným doxorubicinem byly použity jako pozitivní kontrola. Znamená statisticky signifikantní rozdíl (p<0.05) oproti kontrolní skupině. 45

47 Buňky linie EL4 jsme 24 hodin inkubovali také s celou řadou různých polymerních konjugátů a pomocí průtokové cytometrie jsme sledovali expresi CRT na povrchu těchto buněk (Tab. 4.2). obsah (wt %) exprese Struktura konjugátu Mw CRT na (kda) Dox protilátka povrchu P - Ah-Dox HYD 37 13,7 0,0 P - Ah-Dox HYD 18 10,9 0,0 P - Ah-Dox HYD 26 10,0 0,0 P - Ah-Dox HYD 27 9,9 0,0 P - Ah-Dox HYD 27 9,8 0,0 P - Ah-Dox HYD 25 8,9 0,0 P - Ah-Dox HYD 25 8,5 0,0 P - Ah-Dox HYD 24 7,7 0,0 P - Ah-Dox HYD 24 7,2 0,0 P - Ah-Dox HYD 19 4,3 0,0 P - GFLG-Dox AM 52 7,0 0,0 P - GFLG-Dox AM 26 5,6 0,0 P - GFLG-Dox AM 29 5,5 0,0 GFLG-Dox AM P 900 4,8 16,0 GFLG-HuIg(IN) AM P P P P GFLG-Dox AM 890 4,0 38,5 GFLG-HuIg(EN) AM GFLG-Dox AM ,8 31,0 GFLG-HuIg(IN) AM GG-Dox AM 39 5,2 0,0 GFLG-OH GG-Dox AM 21 7,4 0,0 GG-OH P - GFLG-OH homopolymer HPMA ,0 0,0 0,0 0,0 P GFLG-Dox Ah-Dox 115 8,7 0,0 P - GFLG-Dox AM - 8,5 0,0 P - Ah-Dox HYD volný doxorubicin Tab. 4.2 Přehled testovaných HPMA konjugátů a jejich vliv na expresi calreticulinu na povrchu EL4 buněk. - nulová exprese CRT na povrchu; + nízká exprese CRT; ++ střední exprese CRT; +++ vysoká exprese CRT

48 P=N-(2-hydroxypropyl) methakrylamid (HPMA) kopolymerní nosič; Dox= doxorubicin; Ah= aminohexanová kyselina; HYD = hydrazonová ph senzitivní vazba; AM = amidická enzymaticky štěpitelná vazba; HuIg(EN)= lidský i.v. imunoglobulin Endobulin (Baxter AG); HuIg(IN)= lidský i.v. imunoglobulin Intraglobin F (Biotest); GG= Gly-Gly; GFLG= Gly-Phe (D,L) -Leu-Gly konjugát obsahující doxorubicin vázaný ph senzitivní vazbou i enzymaticky štěpitelnou v poměru 1:1 směs dvou konjugátů s rozdílnou molekulovou hmotností (P-Ah-Dox HYD Mw = 35kDa, P-GFLG- Dox AM Mw = 42kDa) Dále jsme porovnávali přítomnost CRT na povrchu EL4 buněk, které byly vystaveny působení volného doxorubicinu a nebo HPMA konjugátů (Obr. 4). Dle předpokladu nejvíce CRT se vyskytovalo na povrchu EL4 buněk, které byly inkubovány s volným doxorubicinem. Množství CRT bylo signifikantně zvýšené už při koncentraci 5 µm doxorubicinu, kdy CRT bylo na povrchu 7krát více než na kontrolních buňkách. Polymerní konjugát s ph senzitivní vazbou Dox-HPMA HYD vyvolal také signifikantní přesun CRT na povrch buněk, kdy se na povrchu buněk vyskytoval 5krát více už při koncentraci 5 µm ekvivalentu doxorubicinu. Naproti tomu konjugáty Dox-HPMA AM a Dox-HPMA AM -HuIg nevyvolaly přesun CRT na povrch EL4 buněk ani při vysokých koncentracích doxorubicinu μm doxorubicin 5 μm doxorubicin 10 μm doxorubicin 25 μm doxorubicin násobek kontrol μm doxorubicin 100 μm doxorubicin 500 μm doxorubicin 1000 μm doxorubicin 10 0 volný Dox Dox-HPMA^HYD Dox-HPMA^AM Dox-HPMA^AM-HuIg Obr. 4.4 Přítomnost CRT na povrchu EL4 buněk po inkubaci s různými formami doxorubicinu detekovaná pomocí průtokové cytometrie. Buňky byly inkubovány 24 hodin s různými koncentracemi doxorubicinu. Uvedené koncentrace odpovídají ekvivalentu doxorubicinu. Výsledky jsou prezentovány jako násobky kontrol vztažené k množství CRT na povrchu kontrolních buněk neinkubovaných s doxorubicinem. Znamená statisticky signifikantní rozdíl (p<0.05) oproti kontrolní skupině. Experiment byl opakován třikrát s obdobnými výsledky. Pomocí imunoblotu jsme detekovali přítomnost calreticulinu v celkovém lyzátu buněk a ve vzorku proteinů izolovaných z plazmatické membrány (Obr. 4.5A). Ve frakci proteinů izolovaných z plazmatické membrány jsme pozorovali CRT pouze u buněk, které byly inkubovány s volným doxorubicinem, a v menší míře u buněk inkubovaných s konjugátem s ph senzitivní vazbou Dox-HPMA HYD. Calreticulin nebyl přítomen ve vzorcích 47

49 povrchových membránových proteinů z buněk vystavených konjugátům s enzymaticky štěpitelnou vazbou Dox-HPMA AM a Dox-HPMA AM -HuIg. Ve vzorcích celkového buněčného lyzátu jsme pozorovali CRT ve stejném množství u kontrol jako v lyzátu buněk inkubovaných s různými formami doxorubicinu (Obr. 4.6B). Pro kontrolu jsme detekovali také cytozolický protein β-aktin, abychom zjistili, zda izolované membránové proteiny nejsou kontaminovány cytozolickými proteiny. A CRT β-aktin kontrolní buňky volný Dox Dox-HPMA HYD Dox-HPMA AM Dox-HPMA AM -HuIg B CRT β-aktin kontrolní buňky volný Dox Dox-HPMA HYD Dox-HPMA AM Dox-HPMA AM -HuIg Obr. 4.5 Detekce CRT v membránové frakci proteinů a v celkovém lyzátu buněk pomocí imunoblotu. EL4 buňky byly inkubovány 24 hodin s 25µM Dox, 100µM Dox-HPMA HYD a 1000µM Dox-HPMA AM, 1000µM Dox-HPMA AM -HuIg. Uvedené koncentrace odpovídají ekvivalentu doxorubicinu. A) Proteiny z plazmatické membrány B) Celkový buněčný lyzát. Cytozolický protein β-aktin byl použit jako kontrola, zda vzorek membránových proteinů není kontaminován cytozolickými proteiny, a jako kontrola množství nanesených proteinů v případě celkového buněčného lyzátu. Experiment byl opakován třikrát s obdobnými výsledky. CRT je přítomen na povrchu buněk signifikantně ve větším množství, pokud byly buňky inkubovány s volným doxorubicinem nebo s kombinací volný Dox + Dox-HPMA AM, než na povrchu kontrolních buněk nebo než na povrchu buněk inkubovaných se samotným konjugátem Dox-HPMA AM. Přesun CRT na povrch EL4 buněk je stimulován po inkubaci buněk s kombinací volný Dox+ Dox-HPMA AM jako po podání samotného volného Dox. Kombinace volný Dox+ Dox-HPMA AM zvýšila množství CRT na povrchu více než 55 krát při nejnižší použité koncentraci (Dox 25 μm) a více než 100krát při nejvyšší koncentraci (Dox 250 μm), (Obr. 4.6). 48

50 Dox-HPMA^AM volný doxorubicin Dox-HPMA^AM + volný doxorubicin násobky kontrol μm volného Dox Obr. 4.6 Vliv Dox-HPMA AM na přesun CRT na povrch EL4 buněk. Buňky EL4 byly inkubovány 24 hodin s volným doxorubicinem, Dox-HPMA AM nebo s konjugátem Dox-HPMA AM záměrně kontaminovaným volným doxorubicinem. Ke konjugátu Dox-HPMA AM bylo přidáno stejné množství volného doxorubicinu, jaké bylo použito pro inkubaci buněk s volným Dox. Použitá koncentrace konjugátu Dox-HPMA AM ve vzorcích byla 1000 μm ekvivalentu doxorubicinu. Výsledky jsou uvedeny jako násobky kontrol exprese CRT na povrchu kontrolních buněk. Znamená statisticky signifikantní rozdíl (p<0.05) oproti kontrolním buňkám a buňkám inkubovaných pouze s konjugátem Dox- HPMA AM. Dále jsme zjišťovali vliv Dox-HPMA AM na přesun CRT na buněčný povrch poté co byly EL4 buňky inkubovány konjugátem kombinujícím doxorubicin vázaný ph senzitivní vazbou a doxorubicin vázaný enzymaticky štěpitelnou vazbou (Dox-HPMA HYD +Dox- HPMA AM ). CRT je exprimován na povrchu buněk signifikantně ve větší míře u vzorků, kde byl přítomen doxorubicin vázaný ph senzitivní vazbou. Množství CRT se výrazně nelišilo mezi buňkami vystavenými pouze Dox-HPMA HYD a buňkami vystavenými směsi kongujátů Dox-HPMA HYD +Dox-HPMA AM (Obr. 4.7). 49

51 40 35 Dox-HPMA^HYD Dox-HPMA^HYD+Dox-HPMA^AM 30 násobky kontrol μm doxorubicinu vázaného ph senzitivní vazbou Obr. 4.7 Přítomnost CRT na povrchu EL4 buněk po inkubaci s konjugátem Dox-HPMA HYD nebo s konjugátem kombinující doxorubicin navázaný ph senzitivní vazbou a navázaný enzymaticky štěpitelnou vazbou (Dox-HPMA HYD +Dox-HPMA AM ). Buňky EL4 byly inkubovány 24 hodin s konjugátem Dox-HPMA HYD nebo s konjugátem Dox-HPMA HYD +Dox-HPMA AM. Výsledky jsou uvedeny jako násobky exprese CRT na povrchu kontrolních buněk inkubovaných s konjugátem Dox- HPMA AM. Znamená statisticky signifikantní rozdíl (p<0.05) oproti kontrolní skupině Přítomnost proteinu ERp57 na povrchu EL4 buněk Zjišťovali jsme přítomnost ERp57 na povrchu EL4 buněk po inkubaci s volným nebo na HPMA vázaným doxorubicinem. Protein ERp57 byl přítomen v signifikantně zvýšeném množství na povrchu buněk, které byly inkubovány s volným doxorubicinem, a to více než 28krát při koncentracích 10 μm doxorubicinu a více anebo s konjugátem Dox-HPMA HYD více než 10krát při koncentracích 10 μm doxorubicinu a více. Množství ERp57 nebylo signifikantně zvýšené, pokud byly buňky inkubovány s konjugáty Dox-HPMA AM nebo Dox-HPMA AM -HuIg. (Obr. 4.8) 50

52 μm doxorubicin 5 μm doxorubicin 10 μm doxorubicin 25 μm doxorubicin násobek kontrol μm doxorubicin 100 μm doxorubicin 500 μm doxorubicin 1000 μm doxorubicin volný Dox Dox-HPMA^HYD Dox-HPMA^AM Dox-HPMA^AM-HuIg Obr. 4.8 Detekce ERp57 na povrchu EL4 buněk pomocí průtokové cytometrie. Buňky byly inkubovány 24 hodin s různými molárními koncentracemi doxorubicinu. Množství použitého HPMA konjugátu bylo vždy přepočítáno na ekvimolární množství doxorubicinu ve vzorku. Výsledky jsou prezentovány jako násobky kontrol, vztažené k množství ERp57 na povrchu kontrolních buněk neinkubovaných s doxorubicinem. Znamená statisticky signifikantní rozdíl (p<0.05) oproti kontrolní skupině. Protein ERp57 jsme detekovali pomocí imunoblotu jak ve frakci proteinů z plazmatické membrány, tak z celkového buněčného lyzátu. Množství ERp57 bylo zvýšeno ve vzorcích vnitrobuněčných proteinů z buněk, které byly vystaveny volnému doxorubicinu a nebo konjugátu Dox-HPMA HYD (Obr. 4.9A). Změny v množství ERp57 v celkových lyzátech buněk jsme nepozorovali (Obr. 4.9B). A ERp57 β-aktin B ERp57 kontrolní buňky volný Dox Dox-HPMA HYD Dox-HPMA AM Dox-HPMA AM -HuIg β-aktin kontrolní buňky volný Dox Dox-HPMA HYD Dox-HPMA AM Dox-HPMA AM -HuIg Obr. 4.9 Detekce ERp57 A) v membránové frakci proteinů a B) v celkovém lyzátu buněk pomocí imunoblotu. EL4 buňky byly inkubovány 24 hodin s 25 µm Dox, 100 µm Dox-HPMA HYD a 1000 µm Dox-HPMA AM, 1000 µm Dox-HPMA AM -HuIg. Uvedené koncentrace odpovídají ekvivalentu 51

53 doxorubicinu. Cytozolický protein β-aktin byl použit jako kontrola, zda vzorek membránových proteinů není kontaminován cytozolickými proteiny, a jako kontrola množství nanesených proteinů v případě celkového buněčného lyzátu. Experiment byl opakován třikrát s obdobnými výsledky Fosforylace eukaryotického translačního faktoru eif2α Testovali jsme jaký vliv na fosforylaci eif2α má volný doxorubicin a doxorubicin vázaný na kopolymer HPMA. Množství detekovaného nefosforylovaného eif2α se mezi vzorky proteinů nelišilo. Avšak množství fosforylovaného eif2α bylo zvýšené oproti kontrole v lyzátech z buněk, které byly předtím inkubovány (3 a 5 hod) s volným doxorubicinem nebo Dox-HPMA HYD (Obr. 4.10). Mezi vzorkem lyzátu kontrolních buněk a buněk inkubovaných s Dox-HPMA AM a Dox-HPMA AM -HuIg nebyl rozdíl v množství fosforylovaného eif2α po třech ani pěti hodinách. f. eif2α 3 hodiny f. eif2α 5 hodin celkový eif2α kontrolní buňky volný Dox Dox-HPMA HYD Dox-HPMA AM Dox-HPMA AM -HuIg Obr Detekce fosforylovaného proteinu eif2α (f. eif2α) pomocí imunoblotu. Buňky linie EL4 byly inkubovány 3 nebo 5 hodin s volným Dox nebo s polymerními konjugáty v koncentracích: 25 µm Dox, 100 µm Dox-HPMA HYD, 1000 µm Dox-HPMA AM a 1000 µm Dox-HPMA AM -HuIg. Uvedené koncentrace odpovídají ekvivalentu doxorubicinu. Experiment byl opakován třikrát s obdobnými výsledky. 52

54 4.3 Změny povrchové glykosylace vyvolané působením HPMA konjugátů Sacharidové složení povrchu buněk Na Obr je ukázáno, jak se mění sacharidové složení na povrchu EL4 buněk po 24 hodinové inkubaci s různými formami doxorubicinu. V celkové frakci povrchových sacharidů dochází k signifikantním změnám u buněk, které byly inkubovány s Dox- HPMA AM na rozdíl od kontrolních buněk nebo buněk vystavených Dox-HPMA HYD. O více než 60% bylo zvýšené množství všech testovaných povrchových sacharidů oproti množství sacharidů u kontrolních buněk: 68% fukóza, 79% glukóza, 60% manóza, 61% galaktóza, 74% N-acetylgalaktosamin, 66% N-acetylglukosamin. Při další analýze bylo zjištěno, že k těmto změnám dochází spíše u sacharidových částí glykoproteinů než u glykolipidů (Obr. 4.12). V glykoproteinové frakci bylo zvýšené množství galaktózy o 74% oproti kontrole, manózy o 75% a N-acetylglukosaminu o 86% (Obr. 4.12A). V glykolipidové frakci bylo signifikantně zvýšené jen množství N-acetylgalaktosaminu o 94% (Obr. 4.12B). Celková membránová frakce kontrolní buňky volný Dox % kontrol Dox-HPMA^HYD Dox-HPMA^AM Obr Změny sacharidového složení plasmatické membrány EL4 buněk vystavených volnému nebo na HPMA vázaného doxorubicinu. EL4 buňky byly 24 hodin inkubovány s IC 50 různých forem doxorubicinu (Tab. 4.1) a poté připraveny pro HPAEC-PAD analýzu cukrů asociovaných s plazmatickou membránou. Výsledky jsou uvedeny v % kontrol, kdy kontrolní buňky reprezentují 100%. Znamená statisticky signifikantní rozdíl (p<0.05) oproti množství daného sacharidu u kontrolních buněk. 53

55 A Glykoproteinová frakce pmol sacharidů v povrchové membráně kontrolní buňky volný Dox Dox-HPMA^HYD Dox-HPMA^AM B Glykolipidová frakce pmol sacharidů v povrchové membráně kontrolní buňky volný Dox Dox-HPMA^HYD Dox-HPMA^AM Obr Změny sacharidového složení plasmatické membrány EL4 buněk vystavených volnému nebo na HPMA vázaného doxorubicinu detekované pomocí HPAEC-PAD analýzy. A) Změny sacharidového složení u glykoproteinové frakce B) Změny sacharidového složení glykolipidové frakce. EL4 buňky byly 24 hodin inkubovány s IC 50 různých forem doxorubicinu (Tab. 4.1). Znamená statisticky signifikantní rozdíl (p<0.05) oproti množství daného sacharidu u kontrolních buněk. 54

56 4.3.2 Kvalitativní změny povrchových glykoproteinů po inkubaci EL4 buněk s HPMA konjugáty EL4 buňky vystavené konjugátu Dox-HPMA AM 2krát více vázaly lektiny PNA (peanut aglutinin) a ECA aglutinin Erythrina cristagalli) než kontrolní buňky. Lektiny PNA a ECA se nevázaly signifikantně více ani méně na buňky, které byly inkubovány s Dox- HPMA HYD (Obr. 4.13). Vazba ostatních testovaných lektinů (MAL II, SNA, Jacalin, WGA, ConA, SBA, AAL, UEA, PWA) nebyla signifikantně rozdílná oproti kontrolám (neuvedeno). A Vazba PNA lektinu průměr intenzity fluorescence kontrolní buňky volný Dox Dox-HPMA^HYD Dox-HPMA^AM B průměr intenzity fluorescence Vazba ECA lektinu 0 kontrolní buňky volný Dox Dox-HPMA^HYD Dox-HPMA^AM Obr Vazba lektinů PNA (A) a ECA (B) na povrch EL4 buněk měřená pomocí průtokové cytometrie. u EL4 buněk, které byly 24 hodin inkubovány s 1x IC 50 různých forem doxorubicinu (Tab. 4.1). Znamená statisticky signifikantní rozdíl (p<0.05) oproti kontrolní skupině Změny exprese povrchových glykoproteinů po inkubaci EL4 buněk s HPMA konjugáty Pomocí imunoblotu jsme zjistili, že na povrchu buněk, které byly 24 hodin inkubovány s konjugátem Dox-HPMA AM, se vyskytuje signifikantně ve větší míře molekula CD43 a to o 73% více než u kontrolních buněk (Obr. 4.14A). U buněk vystavených jiným formám doxorubicinu se množství CD43 na povrchu signifikantně nezměnilo. Dále jsme nezaznamenali změny v přítomnosti dalších povrchových glykoproteinů, jako jsou CD44 (Obr. 4.14B), CD45 (Obr. 4.14C) a CD7 (neuvedeno) u buněk inkubovaných s různými formami doxorubicinu. 55

57 A % kontrol CD43 0 kontrolní buňky volný Dox Dox-HPMA^HYD Dox-HPMA^AM B % kontrol CD44 0 kontrolní buňky volný Dox Dox-HPMA^HYD Dox-HPMA^AM C % kontrol CD45 0 kontrolní buňky volný Dox Dox-HPMA^HYD Dox-HPMA^AM Obr Kvantitativní vyhodnocení imunoblotu exprese glykosylovaných proteinů na povrchu EL4 buněk (A) CD43, (B) CD44, (C) CD45. EL4 buňky byly 24 hodin inkubovány s IC 50 volného či na HPMA kopolymer vázaného doxorubicinu (Tab. 4.1). Výsledky jsou uvedeny v % kontrol, kdy kontrolní buňky reprezentují 100%. Experiment byl opakován třikrát s obdobnými výsledky. Znamená statisticky signifikantní rozdíl (p<0.05) oproti kontrolní skupině. 56

58 4.3.4 Vazba galektinu-1 na EL4 buňky inkubované s HPMA konjugáty Při nižších koncentracích galektinu-1 (2 a 4 µm) jsme nepozorovali rozdíl ve vazbě mezi EL4 buňkami inkubovanými s různými formami doxorubicinu oproti kontrolním buňkám. Galektin-1 v koncentraci 8µM se však signifikantně lépe vázal na povrch EL4 buněk, které byly předtím 24 hodin inkubované s Dox-HPMA AM (Obr. 4.15). průměr intenzity fluorescence kontrolní buňky volný Dox Dox-HPMA^HYD Dox-HPMA^AM μm galectinu-1 Obr Vazebná aktivita galektinu-1 určená průtokovou cytometrií. Buňky linie EL4 byly 24 hodin inkubovány s IC 50 volného či na HPMA kopolymer vázaného doxorubicinu (Tab. 1), poté byly ponechány 1 hodinu v PBS roztoku s různými koncentracemi rekombinantního galektinu Galektinem-1 vyvolaná apoptóza EL4, Jurkat buněk a splenocytů vystavených HPMA konjugátům Po 24 hodinové inkubaci EL4 buněk s volným doxorubicinem bylo 25% mrtvých z toho 22% buněk bylo apoptotických, po inkubaci s Dox-HPMA HYD 17% buněk bylo mrtvých z toho 14% apoptotických. Méně cytotoxický konjugát Dox-HPMA AM vyvolal buněčnou smrt u 6% buněk, z toho 3% buněk byla apoptotických. Pokud jsme přidali galektin-1 k EL4 buňkám, které byly předtím 24 hodin inkubovány s Dox-HPMA AM, výrazně zvýšil procento apoptotických buněk. Se vzrůstající koncentrací galektinu-1 rostlo i množství apoptotických buněk (Obr. 4.16A). Pokud byly EL4 buňky inkubovány s volným Dox nebo Dox-HPMA HYD, nezvyšoval u nich galektin-1 procento apoptotických buněk. Stejný experiment jsme provedli i na lidské leukemické T buněčné linii Jurkat. Zde jsme pozorovali signifikantně zvýšené procento apoptotických buněk pouze, pokud byl k buňkám vystaveným Dox-HPMA AM přidán galektin-1 v koncentraci 1,4μg/ml (Obr. 4.16B). Množství apoptotických buněk bylo zvýšeno i u splenocytů (Obr. 4.16C), ale ne signifikantně. 57

59 A B %kontrol A C Nádorová linie EL μg/ml galektin-1 % kontrol Nádorová linie JURKAT μg/ml galektin-1 kontrolní buňky Dox-HPMA^HYD volný Dox Dox-HPMA^AM kontrolní buňky Dox-HPMA^HYD volný Dox Dox-HPMA^AM C %kontrol Splenocyty μg/ml galectin-1 kontrolní buňky volný Dox Dox-HPMA^HYD Dox-HPMA^AM Obr Galektinem-1 indukovaná apoptóza měřená průtokovou cytometrií u A) myší nádorové linie EL4 B) lidské leukemické linie Jurkat C) myších splenocytů. Buňky byly 24hodin inkubovány s IC 50 volného Dox, Dox-HPMA AM, Dox-HPMA HYD (Tab. 4.1) a následně 5 hodin s galektinem-1 v různých koncentracích. Znamená statisticky signifikantní rozdíl (p<0.05) oproti kontrolní skupině. 58

60 4.3.6 Exprese povrchové molekuly CD47 u EL4 buněk Chtěli jsme zjistit, zda volný doxorubicin nebo polymerní konjugáty mění expresi molekuly CD47 na povrchu. Exprese CD47 se po inkubaci s Dox nebo HPMA konjugáty nelišila od kontrolních buněk (Obr. 4.17). Stejný výsledek jsme pozorovali, když jsme provedli western blot s proteiny izolovanými z plazmatické membrány (Obr. 4.18). násobek kontrol 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 1 μm doxorubicin 5 μm doxorubicin 10 μm doxorubicin 50 μm doxorubicin 100 μm doxorubicin 500 μm doxorubicin 1000 μm doxorubicin 0,20 0,00 volný Dox Dox-HPMA^HYD Dox-HPMA^AM Dox-HPMA^AM-HuIg Obr Exprese CD47 na povrchu EL4 buněk měřená průtokovou cytometrií. EL4 buňky byly inkubovány 24 hodin s 25µM Dox, 100µM Dox-HPMA HYD a 1000µM Dox-HPMA AM, 1000µM Dox- HPMA AM -HuIg. Uvedené koncentrace odpovídají ekvivalentu doxorubicinu. CD4 kontrolní buňky volný Dox Dox-HPMA HYD Dox-HPMA AM Dox-HPMA AM -HuIg Obr Povrchová exprese CD47 u EL4 buněk detekce pomocí imunoblotu. EL4 buňky byly inkubovány 24 hodin s 25 µm Dox, 100 µm Dox-HPMA HYD a 1000 µm Dox-HPMA AM, 1000 µm Dox- HPMA AM -HuIg. Uvedené koncentrace odpovídají ekvivalentu doxorubicinu. K detekci byly použity vyizolované povrchové proteiny. 59