OVĚŘENÍ CELKOVÉHO DEKLAROVANÉHO POČTU PROBIOTICKÝCH BAKTERIÍ VE VYBRANÝCH FARMACEUTICKÝCH PREPARÁTECH

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin OVĚŘENÍ CELKOVÉHO DEKLAROVANÉHO POČTU PROBIOTICKÝCH BAKTERIÍ VE VYBRANÝCH FARMACEUTICKÝCH PREPARÁTECH Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: Ing. Doubravka Rožnovská, Ph.D. Vypracovala: Bc. Simona Pokorná Brno duben 2012

zadání

Prohlášení Prohlašuji, že jsem zadanou diplomovou práci na téma Ověření deklarovaného celkového počtu probiotických bakterií ve vybraných farmaceutických preparátech vypracovala samostatně za použití literárních pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu použité literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně dne..... Podpis autora diplomové práce..

Poděkování Ráda bych poděkovala vedoucí mé diplomové práce Ing. Doubravce Rožnovské Ph.D. za odborné vedení. Velké poděkování patří také Ing. Pavle Sládkové Ph.D. za poskytnutou pomoc, ochotu, trpělivost a čas, který mi věnovala při zpracování této diplomové práce. Nemalé poděkování bych chtěla vyjádřit i celé mé rodině a přátelům, kteří mi byli po celou dobu studia oporou.

ABSTRAKT Probiotika jsou živé mikroorganismy, které při konzumaci v dostatečném množství příznivě ovlivňují střevní mikroflóru hostitele, čímž vykazují dobrý vliv na lidské zdraví. Probiotické bakterie se na našem trhu nacházejí jako součást mnoha potravin, především pak zakysaných mléčných výrobků nebo jako farmaceutické doplňky stravy. Hlavním úkolem této práce bylo zajistit osm různých farmaceutických preparátů s obsahem probiotik. U těchto výrobků byly stanoveny počty mikroorganismů pomocí kvantitativních a kvalitativních kultivačních metod a výsledky následně porovnány s celkovými deklarovanými počty bakterií uváděnými výrobcem na obalu. Analyzovanými mikroorganismy byly bakterie rodu Bifidobacterium, rodu Lactobacillus, z něj pak druhy L. acidophilus, L. casei a L. rhamnosus, dále pak druhy Streptococcus thermophilus a Bacillus coagulans. Ve farmaceutických produktech byly detekovány všechny zkoumané probiotické mikroorganismy, které výrobce uváděl na obalu. Avšak jejich zjištěné počty u všech preparátů kromě jediného neodpovídaly počtům deklarovaných výrobcem. Klíčová slova: probiotika, doplňky stravy, Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Streptococcus thermophilus, Bacillus coagulans

ABSTRACT Probiotika are live micro-organisms which when ingested in sufficient quantities, favourably affect the intestinal microflora host, thereby showing a good influence on human health. Probiotické bacteria in our market are located as part of many foods, particularly fermented of milk products or as pharmaceutical supplements. The main task of this work was to ensure eight different pharmaceutical preparations containing probiotik. These products have been laid down, the numbers of microorganisms using quantitative and qualitative cultivation methods and results were subsequently compared with the total numbers of bacteria indicated by the manufacturer, as declared on the packaging. Bacteria of the genus that have microorganisms have been of the genus Bifidobacterium, Lactobacillus from him, then the species L. acidophilus, L. casei and L. rhamnosus, species of Streptococcus thermophilus and Bacillus coagulans. In pharmaceutical products were detected by all the probiotické micro-organisms which producer claimed on the package. But the numbers for all products except one did not correspond to those declared by the manufacturer. Keywords: probiotika, supplements, Bifidobacterium, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Streptococcus thermophilus, Bacillus coagulans

OBSAH 1 ÚVOD... 9 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 10 2.1 Funkční potraviny... 10 2.2 Probiotika... 12 2.2.1 Probiotika definice slova... 12 2.2.2 Požadované vlastnosti a podmínky působení probiotik... 13 2.2.3 Příznivé účinky probiotik na zdraví... 14 2.2.4 Hodnocení bezpečnosti probiotik... 16 2.2.5 Legislativa a označování probiotik... 17 2.2.6 Bakterie mléčného kvašení... 18 2.3 Charakteristika vybraných rodů a druhů probiotických bakterií... 19 2.3.1 Rod Lactobacillus... 20 2.3.1.1 Lactobacillus acidophilus... 22 2.3.1.2 Lactobacillus casei... 23 2.3.1.3 Lactobacillus rhamnosus... 24 2.3.2 Rod Bifidobacterium... 25 2.3.3 Rod Streptococcus... 26 2.3.3.1 Streptococcus thermophilus... 27 2.3.4 Rod Bacillus... 28 2.3.4.1 Bacillus coagulans... 28 2.4 Formy probiotických preparátů na trhu... 29 2.4.1 Potraviny s obsahem probiotik... 29 2.4.2 Probiotické doplňky stravy... 31 2.5 Vybrané identifikační metody probiotických mikroorganismů... 34 2.5.1 Kultivační metody... 34 2.5.2 Biochemické metody... 35 2.5.3 Molekulárně biologické metody... 35 3 CÍL PRÁCE... 38

4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 39 4.1 Materiál... 39 4.1.1 Použité farmaceutické probiotické preparáty... 39 4.1.2 Použité chemikálie... 44 4.1.3 Použité pomůcky... 44 4.2 Metodika... 45 4.2.1 Kultivační média... 45 4.2.1.1 Stanovení rodu Lactobacillus (ČSN ISO 560642)... 45 4.2.1.2 Stanovení druhu Lactobacillus acidophilus (ČSN ISO 560642)... 46 4.2.1.3 Stanovení druhu Lactobacillus rhamnosus (ČSN ISO 560642)... 48 4.2.1.4 Stanovení druhu Lactobacillus casei (ČSN ISO 560642)... 49 4.2.1.5 Stanovení rodu Bifidobacterium (ČSN ISO 467046)... 50 4.2.1.6 Stanovení druhu Streptococcus thermophilus (ČSN ISO 9232)... 51 4.2.1.7 Stanovení druhu Bacillus coagulans (ČSN EN 15784)... 52 4.2.2 Statistické vyhodnocení... 53 5 VÝSLEDKY... 54 5.1 Porovnání závislosti počtu probiotických bakterií na době skladování... 55 5.1.1 Vzorek č. 1... 55 5.1.2 Vzorek č. 2... 57 5.1.3 Vzorek č. 3... 59 5.1.4 Vzorek č. 4... 61 5.1.5 Vzorek č. 5... 63 5.1.6 Vzorek č. 6... 65 5.1.7 Vzorek č. 7... 67 5.1.8 Vzorek č. 8... 69 6 DISKUZE... 71 7 ZÁVĚR... 74 8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 75

1 ÚVOD Probiotika budou pro medicínu 21. století tím, čím byly pro medicínu 20. století antibiotika a mikrobiologie. Trávicí trakt člověka je osídlen řadou různorodých mikroorganismů, které se do jeho organismu dostávají potravou a vytvářejí tak mikroflóru střeva. Gastrointestinální mikroflóra představuje vysoce složitý ekosystém. Udává se, že povrch střeva je zhruba 150 200 m 2, přičemž pro srovnání má pokožka na povrchu našeho těla asi jen 2 m 2. Tímto je tedy poskytnut nezbytný prostor pro interakce během trávicího procesu i pro kolonizaci a adhezi mikroorganismů ke střevnímu epitelu. Tyto mikroorganismy, jejichž počet je až desetinásobkem oproti počtu tělních buněk, mají řadu významných funkcí. Především pak ovlivňují metabolické procesy. Intestinální mikroflóra obsahuje mikroorganismy jak člověku prospěšné, tak i takové, které mohou jedinci škodit. Mezi těmito mikroby se vytváří rovnovážný stav. Převládnou-li bakterie patogenní, projeví se to onemocněním, které však nemusí mít souvislost pouze s onemocněním trávicího traktu člověka, ale celého jeho organismu. Kladně na mikroflóru trávicího traktu a k potlačení špatného vlivu patogenních mikroorganismů působí právě probiotické bakterie. Probiotika jsou zdraví prospěšné živé kultury, které společně s prebiotiky a symbiotiky můžeme zařadit mezi tzv. funkční potraviny. Přesněji řečeno jde o jejich funkční složky. Prebiotika jsou oligosacharidy, které fungují jako potrava pro probiotické bakterie, díky nimž tyto mikroorganismy o mnoho lépe prosperují. Kombinací těchto dvou funkčních složek, tedy probiotik a prebiotik, vznikají symbiotika. V posledních letech stoupá zájem jak odborné, tak i laické veřejnosti o probiotické potraviny včetně doplňků stravy. Důvodem je fakt, že cílené užívání probiotických produktů může mít kladný vliv na lidské zdraví. Vznikají tak nově definovaná pravidla se zaměřením na různá pole působnosti probiotik. Mezi něž se mimo jiné řadí i ověřování deklarovaného počtu životaschopných probiotických bakterií v různých produktech nacházejících se na našem trhu. 9

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Funkční potraviny O funkčních potravinách se začalo diskutovat na počátku 90. let díky organizaci ILSI (International Life Science Institute), která Evropské komisi představila projekt známý pod zkratkou FUFOSE (Functional Food Science in Europe). Na základě tohoto projektu byl v roce 1999 přijat konses Scientific Concepts of Functional Foods in Europe, jehož součástí bylo zavedení pracovní definice pro funkční potraviny. Hlavní body této definice jsou: - Funkční potravina je svým charakterem běžnou potravinou, není to kapsle, tableta ani jiná forma doplňku stravy. - Prokázání příznivých účinků na zdraví člověka musí být založeno na vědeckém podkladě. - Funkční potravina má kromě své nutriční hodnoty příznivé účinky na lidské zdraví a/nebo snižuje riziko onemocnění. - Funkční potraviny jsou konzumovány jako součást běžné stravy. Mezi nejčastěji využívané druhy funkčních potravin v praxi se řadí: - potraviny, kde jsou přidány složky, které mají příznivý vliv na lidské zdraví, - potraviny, kde jsou odstraněny složky, které mohou mít nepříznivý vliv na zdraví člověka, - potraviny, ve kterých některé přirozeně se vyskytující složky jsou chemicky modifikovány, - potraviny, kde biologická dostupnost jedné nebo více složek je zvýšena. Do první skupiny potravin, kde jsou kladně působící složky dodávány, spadají mléčné zakysané výrobky, do kterých jsou právě probiotika a prebiotika přidávána jako jejich funkční složky (WINKLEROVÁ, 2009). Probiotika jsou živé kultury mikroorganismů prospěšně působící na svého hostitele zlepšením vlastností jeho vlastní střevní mikroflóry. Laicky řečeno jsou to tzv. přátelské bakterie (GROFOVÁ, 2007). Podrobnější informace o probatikách jsou uvedeny v následujících kapitolách. 10

Prebiotika jsou nestravitelné látky obsažené v potravinách, které pozitivně ovlivňují růst nebo aktivitu střevních bakterií, a to především bifidobakterií a laktobacilů. Tímto podporují dobré složení mikroflóry tlustého střeva, čímž vykazují celkově příznivý vliv na zdraví a pohodu člověka (NEVORAL, 2008). Do tzv. tračníkové potravy se řadí zejména různé formy vlákniny, jako je celulóza, pektiny, xylany, pak oligosacharidy, hlavně fruktooligosacharidy, například inulin, dále laktulóza a laktosacharóza. Reakčními produkty štěpení prebiotik pomocí mikrobiálních enzymů jsou krátké mastné kyseliny, některé aminokyseliny, polyaminy, růstové faktory, vitaminy a antioxidanty. Všechny tyto látky se významně podílejí na výživě střevní sliznice a dalších metabolických procesech (FRIČ, 2005). Předpokládá se, že doporučený denní příjem prebiotik se pohybuje okolo 0,3 g u mužů a 0,4 g u žen na kilogram jejich tělesné hmotnosti. Vyšší příjem by mohl vyvolávat nadýmání a průjmy (KALAČ, 2003). Tab. 1: Komerční vývoj různých druhů prebiotických sacharidů (McSWEENEY and FOX, 2009) Prebiotika Rok* Laktulóza 1953 Fruktooligosacharidy 1983 Sojové - oligosacharidy 1983 Galaktooligosacharidy 1985 Laktitol 1987 Inulin 1990 Laktosacharóza 1993 Xylooligosacharidy 1994 Rezistentní škrob 1996 β-glukany 1998 Obilné (cereální) oligosacharidy 1998 Polysacharidy 1998 Vláknina 1999 * uvádí se první rok komerčního využití sacharidických směsí jako prebiotik 11

2.2 Probiotika V těle průměrného člověka žije kolem několika desítek až sta biliónů bakterií. Každé tělo má jiný počet buněk a stejné tělo má v každý nový okamžik jejich jiný počet. Tedy i počet probiotických a i patogenních bakterií se liší člověk od člověka a den ode dne. Probiotické bakterie se nacházejí v našem trávicím traktu, avšak střevní trakt novorozence je sterilní a musí být teprve osídlen. Po osídlení zůstávají bakteriální kolonie až do konce života, ale jejich počet je i nadále ovlivňován různými faktory. Ke snížení počtu kolonií dochází například po léčbě antibiotiky, ve stresovém období života, aj. Přirozenou střevní mikroflóru lze obnovit příjmem stravy obsahující probiotické bakterie (MACHALA, 2008). 2.2.1 Probiotika definice slova Slovo probiotika je odvozené z latiny a řečtiny (pro = pro, bios = život), doslovně tedy tento termín znamená pro život, neboli látky vhodné pro život. Tento termín byl poprvé použit dvojicí Lilly a Stiwell v roce 1965, kteří takto definovali substance, které jsou vylučovány určitým mikroorganismem a podporují růst jiného mikroorganismu. Termín probiotika označuje látky, které jsou opakem antibiotik, a proto byl vytvořen podle vzoru slova antibiotika. Toto slovo začalo být používáno i v širších souvislostech (PETR a KALOVÁ, 2006). Označení probiotika v dnešním slova smyslu použil až Parker v roce 1974, kdy navrhl hypotézu, že probiotika jsou organismy a substance, které mají blahodárný účinek na živočišný organismus, protože pozitivně ovlivňují střevní mikroflóru. Tuto definici poté v roce 1989 obnovil Fuller, který označil probiotika jako živé mikrobiální přídavky ke stravě, které ovlivňují hostitele zlepšením jeho intestinální mikrobiální rovnováhy. Pojem nadále rozšířil Havenaar a kol. v roce 1992, který řekl, že probiotika jsou mono nebo smíšené kultury mikroorganismů, které, jestliže se aplikují člověku nebo zvířeti, pozitivně ovlivňují svého hostitele zlepšením vlastností jeho původní mikroflóry (LEE and SALMINEN, 2009). Během let prošla definice slova probiotika ještě mnoha změnami. Mezi novější se řadí definice z roku 2001 ustanovená FAO/WHO (Food and Agriculture Organization/World Health Organization Organizace pro výživu a zemědělství/ 12

Světová zdravotnická organizace), která říká, že probiotika jsou živé mikroorganismy, které po konzumaci v jejich dostatečném počtu prospěšně ovlivňují zdraví hostitele (VERDENELLI a kol., 2009). 2.2.2 Požadované vlastnosti a podmínky působení probiotik Obecně lze říci, že při výběru vhodných kmenů probiotických bakterií pro praktické využití se musí přihlížet ke třem okruhům kritérií (KALAČ, 2003): - obecným hlediskům, jež zahrnují jejich původ, spolehlivou identifikaci, bezpečnost a odolnost vůči mutacím a stresům vyvolaným prostředím a vůči nepříznivým podmínkám, kterým jsou bakterie vystaveny při průchodu gastrointestinálním traktem, - technickým hlediskům, mezi něž se řadí růstová schopnost během jejich kultivace, životnost během aplikace do potravin a jejich následné dopravy a skladování, - funkčním hlediskům, tedy přínosu pro konzumenta. Detailněji lze vlastnosti, které musí probiotické bakterie splňovat, popsat následovně. Vlastnosti lze využít i jako kritéria právě pro výběr nových probiotických organismů, jelikož počet organismů popisovaných jako probiotika představuje pouze nepatrný zlomek těch, které mohou být potenciálně k dispozici (KVASNIČKOVÁ, 2000, WEBB, 2006): - druhová kompatibilita (probiotické organismy určené pro člověka, by měly být izolovány z lidského trávicího traktu, neboť některé účinky probiotických bakterií vedoucí k podpoře zdraví mohou být u různých živočišných druhů odlišné), - schopnost přežít průchod trávicím traktem a dosáhnout střeva v životaschopném stavu, - rezistence vůči kyselinám a žluči, - dobrá adhezní schopnost ke střevnímu epitelu, - krátká generační doba růstu, aby probiotické bakterie mohly střevo rychle kolonizovat (některé bakterie se špatnou přilnavou schopností k intestinálnímu epitelu jsou stále dočasně schopny kolonizovat střeva kvůli jejich krátké generační době růstu), 13

- tvorba antimikrobních látek, které působí antagonisticky vůči patogenním a kariogenním bakteriím, brání jejich rozvoji, - zdravotní nezávadnost (aktuální probiotika jsou obecně považována za bezpečná a jsou nepatogenní a netoxická, avšak ve vzácných případech mohou být zdrojem infekce u lidí s oslabeným imunitním systémem), - stabilita (udržení si životaschopnosti, schopnosti kolonizace a dobrých organoleptických vlastností, během výroby a skladování, po dobu trvanlivosti potraviny nebo potravního doplňku), - znát údaje o účincích, které závisejí na dávce. Probiotické bakterie nekolonizují střevo natrvalo, ale jen dočasně a většinou jsou detekovatelné jen po dobu konzumace potraviny s probiotiky. Další podmínkou působení tedy je dosažení potřebné koncentrace probiotických bakterií ve střevě. Udávané množství těchto bakterií by mělo být v tenkém střevě vyšší než 10 6 KTJ/g a v tlustém střevě 10 8 KTJ/g. Z toho důvodu je nutné, aby denzita těchto bakterií v přijímané potravině či doplňku stravy činila 10 10 KTJ/g (ŠPELINA a WINKLEROVÁ, 2009). 2.2.3 Příznivé účinky probiotik na zdraví Zdravotní význam probiotických bakterií se projevuje od narození člověka. Již v trávicím traktu kojenců se usídlí probiotické mikroorganismy. S přibývajícím věkem se střevní mikroflóra mění, přibývá i výskyt škodlivých mikrobů, kteří zvyšují množství toxických látek ve střevě a tím i nebezpečí nádorového onemocnění. Probiotické bakterie tento mechanismus utlumují. Snižují také vstřebávání cholesterolu a tím i nepřímo ovlivňují hladinu cholesterolu v krvi, zlepšují toleranci laktózy a mohou ovlivňovat lidskou imunitu v pozitivním slova smyslu (BLATTNÁ a kol., 2005). Zdravotní účinky probiotik jsou často přičítány kladnému vlivu na střevní mikroflóru a slizniční i systémovou imunitu, tzv. imunomodulační účinky. Tyto účinky byly pozorovány v in vitro studiích, na zvířecích modelech a v klinických studiích. U lidí se účinky prokázaly zkrácením doby či zmírněním příznaků u onemocnění jako je Crohnova nemoc, ulcerózní kolitida, laktózová intolerance, infekce Helicobacter pylori, atopická dermatitida, potravinová alergie, gastroenteritida spojená s infekcí rotaviry a průjem spojený s podáváním antibiotik. 14

Mezi nespecifické imunitní účinky probiotik lze počítat celkové zvýšení odolnosti organismu, které může být výsledkem pozitivní konkurence probiotických bakterií nad patogenními v místě přilnutí na střevní epitel a produkce tzv. bakteriocinů. Některé probiotické kmeny mohou ovlivňovat buněčnou imunitu, jak naznačuje analýza produkovaných cytokinů, dále byla pozorována zvýšená fagocytóza a aktivita NK buněk (natural killer) tzv. přirozených zabíječů (ŠPELINA, 2006). Probiotické kultury mají také detoxikační schopnost. Jsou totiž schopny měnit některé toxiny ve střevech na neškodné látky. Dále produkují všechny vitaminy skupiny B, vyrábějí vitamín K 2 a pomáhají strávit jídla obsahující vitamin K 1. Několik studií rovněž zjistilo, že probiotika mírně snižují krevní tlak (MACHALA, 2008). Mnohé imunomodulační účinky probiotických bakterií byly prokázány teprve nedávno. Mezi ty nověji popisované patří jistý vliv na patogenezi alergických onemocnění a jejich využití v prevenci a terapii těchto onemocnění, jako je atopický ekzém a dermatitida, průduškové astma a alergická rinitida. Jednou ze základních příčin v posledních letech zvýšeného výskytu alergických onemocnění a i jiných chorob souvisejících s poruchou imunitního systému člověka je špatné složení stravy a způsob života lidí, což má za následek změny ve složení jejich střevní mikroflóry. Podáváním právě probiotických kultur můžeme intestinální flóru vhodně regulovat (LISÁK, 2012). Zdravotní přínosy probiotických bakterií, z nichž některé se považují za prokázané, další za pravděpodobné, lze shrnout následovně (KALAČ, 2003): - ustavení či obnovení vyvážené mikroflóry tlustého střeva, - zvýšení odolnosti proti osídlení střeva mikroorganismy vyvolávajícími průjem, - snížení hladiny krevního celkového a LDL cholesterolu (prevence srdečně cévních onemocnění - SCO), - v trávicím traktu snížení tvorby bakteriálních enzymů s mutagenními účinky a vyvolávající růst nádorů, - zmírnění nesnášenlivosti vůči laktose u osob s touto poruchou - posílení imunitního systému, - zvýšené vstřebávání vápníku, - syntéza některých vitamínů, - tvorba bakteriocinů potlačující choroboplodné bakterie 15

2.2.4 Hodnocení bezpečnosti probiotik Bezpečnost probiotik můžeme testovat různými metodami. Při posuzování bezpečnosti každého probiotického kmene je nevyhnutelné vykonat jeho přesnou identifikaci, aby bylo možné posoudit všechna rizika spojená s mikroorganismem a zabránit zařazení podmíněně patogenních mikroorganismů do komerčních produktů. V in vitro podmínkách je možné testovat vlastnosti mikroorganismů, které jsou charakteristické pro patogeny nebo rizikové faktory vyskytující se u patogenů (BOMBA, 2011). V roce 2002 doporučila pracovní skupina odborníků z FAO/WHO, aby byly kmeny probiotických bakterií charakterizovány pomocí následujících testů (ŠPELINA, 2006): - určení rezistence k antibiotikům, - hodnocení některých metabolických aktivit, - hodnocení vedlejších účinků během klinických zkoušek, - test na tvorbu toxinů (pokud kmen patří k druhu, u něhož se produkce toxinů vyskytuje), - test na hemolytickou aktivitu (pokud kmen patří k druhu, u něhož se tato aktivita projevuje), - hodnocení absence efektivity u imunokompromitovaných zvířat. V Evropě byl vypracován obecně použitelný postup k hodnocení bezpečnosti mikroorganismů používaných v potravinách a krmivech. Sestavila jej pracovní skupina skládající se z členů evropského Vědeckého výboru pro potraviny, Vědeckého výboru pro výživu zvířat a Vědeckého výboru pro rostliny. Jde o systém posuzování, který by umožňoval kvalifikovaný předpoklad bezpečnosti tzv. QPS (Qualified presumption of safety). Schéma postupu pro udělení, popřípadě neudělení, tohoto statusu je následující (ŠPELINA a WINKLEROVÁ, 2009): - identifikace mikroorganismu na požadované taxonomické úrovni, tedy určení rodu, druhu a kmene, - stupeň obeznámenosti, tzv. familiarity, což jsou praktické zkušenosti z využívání zkoumaného mikroorganismu pro určité účely již v minulosti, 16

- získání genetických dat, biochemických charakteristik a údajů o patogenitě u organismů běžně nevyužívaných. Jde-li o taxonomickou skupinu s patogenními vlastnostmi, status QPS nelze udělit. Pokud je však patogenita mikroorganismu vázána pouze na určité kmeny nebo se projevuje za extrémních podmínek, je možné v postupu dále pokračovat, - živý organismus bude součástí konečného produktu a bude konzumován nebo jej bude použito pro výrobu fermentačního produktu, který nemá obsahovat živé mikroorganismy, - živé mikroorganismy nemají mít schopnost produkovat antibiotika, která jsou podobná těm používaným v medicíně (humánní i veterinární), - bakterie z taxonomických skupin, které jsou známé svou produkcí toxinů, mají mít prokázanou neschopnost takové tvorby. Většina probiotických bakterií, které se využívají v klinické praxi, jsou za normálních fyziologických okolností běžnou součástí gastrointestinálního traktu člověka a pro svého hostitele nepředstavují žádné riziko. Avšak i běžná střevní mikroflóra může být určitým rizikovým faktorem pro vznik infekce u chronicky nemocných či jinak oslabených jedinců, proto podávání probiotických kmenů znamená pouze velmi malé navýšení tohoto rizika. Výrobci produktů s probiotickými kulturami využívají sofistikovaných metod v oblasti zajištění nezávadnosti a celkové bezpečnosti těchto kultur (BRONSKÝ, 2008). 2.2.5 Legislativa a označování probiotik O zavádění potravin s cíleně přidanými mikroorganismy na trh není v rámci celé Evropské unie k dispozici žádný legislativní předpis. A to ani v případě kojenecké a dětské výživy, kde jsou probiotické bakterie výrobci relativně často přidávány. Na probiotika lze částečně aplikovat Nařízení Evropského parlamentu a Rady o nových potravinách a nových složkách potravin (č.258/97/es) (ŠPELINA, 2006). V současné době jsou ve většině zemí povolena pouze obecná zdravotní tvrzení o potravinách obsahující probiotika. Pracovní skupina FAO/WHO doporučuje, aby při označování potravin bylo povoleno i detailnější zdravotní tvrzení týkající se užívání probiotik. Tato specifická zdravotní tvrzení by měla být vyznačena na štítku a propagačních materiálech. Například konkrétní tvrzení, které uvádí, že probiotika 17

snižují výskyt a závažnost rotavirových průjmů u kojenců, by pro spotřebitele byla více informativní než obecné tvrzení, které uvádí, že probiotika prospívají střevní mikroflóře. Tímto by se zabránilo zavádějícím informacím. Doporučuje se také, aby výrobce nesl odpovědnost za výrobek, že zdravotní tvrzení jsou pravdivá a nejsou zavádějící. FAO/WHO doporučuje, aby byly vyznačeny tyto informace (Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, 2002): - rod, druh a kmen příslušného probiotického mikroorganismu - minimální počet životaschopných mikroorganismů jednotlivých probiotických kmenů na konci doby trvanlivosti - účinnou dávku probiotik (velikost porce) v souladu se zdravotním tvrzením - zdravotní tvrzení - doporučené podmínky skladování - kontaktní údaje firmy 2.2.6 Bakterie mléčného kvašení Na organismus člověka kladně působí především bakterie mléčného kvašení, které jsou obsaženy v zakysaných (kysaných) mléčných výrobcích, např. v jogurtech, kysaných mlékách (acidofilní, kefírové, jogurtové, kyška, s bifidokulturou) aj. Řadí se sem mikroorganismy typu Lactobacillus, Bifidobacterie, některé grampozitivní koky a kvasinky typu Sacharomycces boulardii. Tyto mikroorganismy jsou označovány jako probiotika (BLATTNÁ a kol., 2005). Bakterie mléčného kvašení (BMK) jsou klasifikovány společně podle tvorby stejného produktu metabolismu, a to kyseliny mléčné. BMK se řadí do několika rodů, které jsou děleny na druhy, jež mohou být dále rozčleněny na poddruhy, variety, příp. kmeny. BMK lze rozdělit do dvou kategorií, a to dle tvorby konečných produktů jejich metabolismu nebo optimální teploty. První kategorie, kdy se bakterie mléčného kysání dělí podle produkce metabolitů, obsahuje skupinu homofermentativních a skupinu heterofermentativních BMK. Homofermentativní bakterie produkují kyselinu mléčnou jako základní konečný produkt metabolismu (70 90 %). Druhá skupina, tedy heterofermentativní BMK, vytváří společně s kyselinou mléčnou (minimálně 50 %) i další vedlejší produkty jako je kyselina octová, oxid uhličitý (CO 2 ) a ethanol. 18

V druhé kategorii, která se dělí dle optimální teploty růstu mikroorganismů, se nacházejí mezofilní a termofilní bakterie mléčného kysání. Kdy mezofilní bakterie rostou nejlépe při teplotách mezi 25 až 30 C, zatímco termofilní bakterie preferují teploty 40 až 44 C a rostou větší rychlostí než bakterie mezofilní (GAJDŮŠEK, 2002). Tab. 2: Rody bakterií mléčného kysání, jejich fermentační typ a produkty (GÖRNER a VALÍK, 2004) Rod (skupina) Typ fermentace Hlavní produkty (molární poměr) Lactococcus homofermentativní laktát Streptococcus homofermentativní laktát Pediococcus homofermentativní laktát Lactobacillus Thermobacterium Streptobacterium homofermentativní homofermentativní homofermentativní laktát laktát laktát heterofermentativní* laktát : acetát 1:1 Betabacterium heterofermentativní laktát : acetát : CO 2 1:1:1 Leuconostoc heterofermentativní laktát : acetát : CO 2 1:1:1 Bifidobacterium heterofermentativní laktát : acetát 2:3 * při fermentaci pentóz 2.3 Charakteristika vybraných rodů a druhů probiotických bakterií Mikroorganismy, které se mohou považovat za probiotika, lze rozčlenit do dvou skupin. První skupina zahrnuje bakteriální druhy, které jsou obecně považovány za bezpečné, a jejich aplikace tedy nepředstavuje pro člověka žádné riziko. Řadí se sem druhy bakterií ze tří nejvýznamnějších mikrobiálních rodů této skupiny, a to rodu Bifidobacterium, Lactobacillus a Lactococcus. Avšak do této kategorie se též zahrnují rody Enterococcus a Streptococcus. Druhá skupina obsahuje probiotické mikroorganismy, které představují nepatogenní izoláty rodů, které zahrnují i potenciálně patogenní kmeny. Mezi tyto izoláty patří např. Escherichia coli, Clostridium butyricum nebo kvasinka Saccharomyces boulardii (KREJSEK a kol., 2007). 19

Tab. 3: Nejčastěji používané probiotické mikroorganismy (NEVORAL, 2005) Lactobacily Bifidobakterie Gram pozitivní koky Kvasinkové mikroorganismy L. acidophilus B. bifidum Lactococcus Lactis subsp. cremonis Saccharomyces boulardii L. casei, spec. rhamnosus B. adolescentis Streptococcus salivarius subsp. thermophilus (Lactobacillus GG) L. casei Shirota B. animalis Enterococcus faecium L. delbrueckii subsp. B. infantis S. diacetylactis bulggaricus L. reuteri B. longum S. intermedius L. brevis B. thermophilum E. coli (sérotyp O83:K24:H1) L. cellobiosus L. curvatus L. fermentum L. plantarum 299v 2.3.1 Rod Lactobacillus Taxonomické zařazení: Doména: Bacteria Kmen: Firmicutes Třída: Bacilli Řád: Lactobacillales Čeleď: Lactobacillaceae Rod: Lactobacillus Rod Lactobacillus je z biotechnologického a potravinářského hlediska nejdůležitějším rodem, který je v přírodě velmi rozšířen. Zahrnuje fakultativně anaerobní anebo mikroaerofilní nepohyblivé, nesportující, grampozitivní, tyčinkovité 20

bakterie mléčného kysání, které jsou většinou rovné nebo mají tvar kokobacilů (GÖRNER a VALÍK, 2004, ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Laktobacily se nalézají na různých stanovištích, kde jsou k dispozici zkvasitelné sacharidy. Například na místech jako jsou sliznice člověka a zvířat, tedy v ústní dutině, střevě a vagíně. Dále se vyskytují na rostlinách nebo na materiálu rostlinného původu, v hnoji a také na umělých stanovištích, jako jsou kanalizace. V neposlední řadě jsou obsaženy ve fermentovaných potravinách či potravinách, které již podléhají své zkáze (WOOD and HOLZAPFEL, 1995). Rod Lactobacillus je původně roztříděn do tří tradičních skupin, a to na termobakterie, streptobakterie a betabakterie. Novější rozdělení tohoto rodu, a to dle fermentačních schopností jednotlivých druhů, vypadá následovně: - První kategorií jsou obligátně homofermentativní laktobacily, které fermentují hexózy na kyselinu mléčnou z 90 % a pentózy a glukonáty nefermentují. Lze do této skupiny zařadit všechny termobakterie a další nově popsané druhy. Řadí se sem L. delbreckii ssp. delbrueckii, L. delbreckii ssp. bulgaricus, L. delbreckii ssp. lactis, L. helveticus. L. acidophilus, L. salivarius, L. farciminis a L. yamanashiensis. - Druhou kategorií jsou fakultativně heterofermentativní laktobacily, které také zkvašují hexózy téměř vždy na kyselinu mléčnou, ale při nedostatku glukózy produkují kyselinu octovou, ethanol a kyselinu mravenčí. Pentózy jsou fermentovány pomocí indukovatalné fosfoketolázy. Tato skupina obsahuje všechny streptobakterie a další nově popsané druhy. Patří sem L. alimentarius, L. bavaricus (L. sake), L. casei ssp. casei, L. casei ssp. pseoudoplantarum, L. casei ssp. rhamnosus. L. casei sspl. tolerans, L. curvatus, L. maltaromaticus, L. plantarum a L. sake (L. bavaricus). - Třetí kategorií jsou obligátně heterofermentativní laktobacily, které při fermentaci hexóz produkují kyselinu mléčnou, kyselinu octovou, ethanol a CO 2. Pentózy jsou fermentovány na kyselinu mléčnou a kyselinu octovou. V této skupině se nacházejí všechny betabakterie a ostatní později popsané druhy. Obsahuje druhy jako L. bifermentas, L. brevis, L. buchneri, L. confusus, L. divergens, L. fructivorans, L. hadotolerans, L. kadleri, L. kefir, L. reuteri, L. sanfrancisciscensis a L. viridescens. 21

Rod Lactobacillus je velmi náročný na živiny a růstové faktory. Kromě fermentovatelných sacharidů jako zdroj uhlíku a energie, vyžadují i nukleotidy, aminokyseliny a vitamíny skupiny B. Nejlépe se jim daří na slabě kyselých médiích s počáteční hodnotou ph mezi 6,4 až 4,5 a růst se zastavuje při dosažení hodnot ph 4,0 až 3,6. Jejich růst kladně stimuluje zvýšený obsah CO 2 v prostředí (okolo 5 %), i když většina druhů je značně aerotoleratních. Nejlepší teplotní podmínky pro růst jsou mezofilní teploty s horní hranicí cca 40 C, ale některé tzv. termofilní druhy mají horní hranici 55 C. Existují i druhy, které rostou při teplotách pod 15 C. Avšak dobré růstové podmínky se liší od druhu a kmene. Některé druhy a kmeny laktobacilů produkují bakteriociny, což jsou bílkoviny, které devitalizují citlivé kmeny většinou toho stejného bakteriálního druhu. Laktobacily jsou citlivé vůči většině antibiotik působících na grampozitivní bakterie. Dále také bakteriální druhy tohoto rodu vykazují konzervační účinky, protože při fermentaci snižují hodnotu ph v prostředí, což je pro mnohé jiné bakterie nevyhovující (GÖRNER a VALÍK, 2004). Význam rodu spočívá v širokém využití v potravinářství, při přípravě mléčných výrobků i sýrů, při konzervaci zeleniny i některých krmiv (kysání zelí a okurek, silážování jetelovin, aj.), vyskytuje se v pekařském kvásku, ale může působit i jako kontaminant ve vinařství, pivovarství a lihovarství (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). Rod Lactobacillus se dříve fylogeneticky členil na tři skupiny, dnes se rozčleňuje na skupin devět, na skupinu L. acidophilus, L. reuteri, L. casei, L. plantarum, L. buchneri, L. perolens, L. salivarius, L. pediococcus a L. vitulinus cateformis (LJUNGH and WANDSTRÖM, 2009). 2.3.1.1 Lactobacillus acidophilus Tento druh patří do velmi významné skupiny L. acidophilus, která byla také dříve nazývána L. delbrueckii (LJUNGH and WANDSTRÖM, 2009). Buňky mají tvar tyčinek se zakulacenými konci o velikosti 0,6-0,9 a 1,5-6,0 µm, které se vyskytují jednotlivě, v párech nebo v krátkých řetízcích. Bakterie druhu L. acidophilus jsou grampozitivní, fakultativně anaerobní, jejich optimální ph se pohybuje mezi 5,5 až 6,0, ideální teplota růstu je 37 C, přičemž nerostou pod 10 C a nad 45 C, jsou obligátně homofermentativní a zkvašují glukózu, fruktózu, laktózu, galaktózu, sacharózu 22

i maltózu. Mají však vyšší nároky na růstové faktory, vhodné jsou vitaminy, jako je riboflavin, kyselina pantotenová, kyselina listová a vitamin B 12 (WOOD and HOLZAPFEL, 1995, HUI et al. 2007). Lactobacillus acidophilus je součástí normální ústní flóry, gastrointestinálního traktu a vaginy. Za normálních okolností je tento druh nepatogenní, avšak je uváděn jako původce endokarditid, endometritid, abscesů, pleuropulmonárních infekcí a bakteriémií. S těmito infekcemi jsou spojovány i jiné druhy laktobacilů. L. acidophilus, jakožto převažující složka poševní mikroflóry, také velmi účinně brání ascendentnímu pronikání infekce do dělohy (VOTAVA a kol., 2003). Mezi nejvýznamnější pozitivní dieteticko léčebné účinky tohoto rodu patří potlačování nežádoucí mikroflóry gastrointestinálního traktu, jelikož dobře lne k humánnímu střevnímu epitelu a produkuje antibiotické látky s účinkem proti patogenním bakteriím a také substance s antimykotickým působením. Snižuje aktivitu fekálních enzymů, snižuje i fekální mutagenitu, zamezuje průjmu v souvislosti s radioterapií, pomáhá při zácpě a celkově tedy vyvažuje střevní mikroflóru (DWORKIN et al., 2006, KVASNIČKOVÁ, 2000). 2.3.1.2 Lactobacillus casei Tato probiotická bakterie spadá do skupiny L. casei a dříve byla označována jako Lactobacillus casei subsp. casei, později byla překlasifikována pouze na Lactobacillus casei. Avšak taxonomické zařazení této bakterie se vyznačuje určitými rozpory (ŠVEC, 2005). Bakterie tvoří nepohyblivé tyčinky často s kulatým zakončením o velikosti 0,7 až 1,1 a 2,0 až 4,0 µm, které se mohou spojovat do řetízků. Jsou mikroaerofilní, grampozitivní, fakultativně heterotrofní a jejich optimální teplota růstu je 3 C. Riboflavin, kyselinu listovou, kyselinu panthotenovou a niacin potřebují ke svému růstu nezbytně. Velmi dobře rozkládají bílkoviny, zvláště pak kasein, od něhož je odvozeno druhové jméno této probiotické bakterie, a to až na aminokyseliny (BERGEY and BOONE, 2009, KLABAN, 2001). Mezi popsané funkční účinky druhu Lactobacillus casei provedené in vivo patří, ochrana proti infekčnímu agens díky snížení kolonizace střev patogenními 23

mikroorganismy, aktivace místní a systémové imunity, snížení klinických příznaků rotavirových průjmů a snížení hladiny triglyceridů a cholesterolu. Tyto účinky lze i zahrnout na většinu bakteriálních druhů patřících do L. casei skupiny. V potravinářském průmyslu je tento druh ceněný pro svoje využití jako startovací kultury v sýrařství, při výrobě fermentovaných mlék a pro celkové zvyšování kvality potravin. Lactobacillus casei kolonizuje jak přírodní, tak i uměle vytvořené prostředí. U člověka se vyskytuje v ústech, zažívacím ústrojí a pochvě (ALONSO and SAAD, 2007). 2.3.1.3 Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus, neboli také Lactobacillus GG je pravděpodobně nejlepší studovanou probiotickou bakterií, která byla poprvé popsána Gobrachem a Goldinem v roce 1987. Tato probiotická bakterie byla dříve považována za poddruh bakterie Lactobacillus casei, byla tedy označována jako L. casei subsp. rhamnosus, ale pozdější genetická studie ukázala, že jde o samostatný druh, proto je nyní nazývána pouze jako L. rhamnosus. Avšak do skupiny L. casei se řadí stále. Buňky jsou nepohyblivé tyčinky se zakulacenými konci o velikosti 0,8 až 1,0 a 2,0 až 4,0 µm, které se vyskytují jednotlivě či v řetízcích. Tento druh je fakultativně anaerobní a byl izolován z mléčných výrobků, lidí a klinického materiálu. Jeho pozitivní klinické účinky jsou dokumentovány u průjmových onemocnění, jako je cestovatelský průjem, nebo u léčby recidivující infekce bakterie Clostridium difficile a rotavirové infekce u dětí. Využívá se k prodloužení trvanlivosti mléčných produktů, především pak jogurtů (BERGEY and BOON, 2009, TANNOCK, 2002). Základními kritérii, kvůli kterým se druh Lactobacillus GG izoluje, jsou jeho dobrá odolnost vůči žaludečním kyselinám a velmi dobrá adherence na epitelové buňky střeva. Ukázalo se, že tento bakteriální druh obývá střevní mikroflóru i minimálně jeden týden po jeho posledním požití ústy. Mezi zdravotní účinky spadá, že snižuje aktivitu prokarcinogenních enzymů, zlepšuje slizniční bariéru střeva a také podporuje výskyt ostatních laktobacilů a bifidobakteií. Uvádí se také, že mléko obohacené o LGG snižuje riziko respiračních infekcí a rozvoj zubního kazu u dětí (LEE and SALMINEN, 2009). 24

2.3.2 Rod Bifidobacterium Taxonomické zařazení: Doména: Bacteria Kmen: Actinobacteria Třída: Actinobacteriadae Řád: Bifidobacteriales Čeleď: Bifidobacteriaceae Rod: Bifidobacterium Bifidobakterie, dříve známé jako Bacillus bifidus, jsou skupina mikroorganismů, ve které v současné době existuje více než 33 druhů. Tyto bakteriální druhy byly zjištěny pomocí molekulárních a biochemických metod, z nichž 12 je v souvislosti s gastrointestinálním traktem. Bifidobakterie jsou grampozitivní, nesporotvorné, nepohyblivé, nepravidelně tvarované, kataláza-negativní a sacharolytické anaerobní mikroorganismy, které fermentací sacharidů produkují kyselinu octovou a kyselinu mléčnou (v poměru 3:2) bez vedlejší tvorby CO 2. Přičemž kyselina octová má silnější antagonistický účinek proti patogenním mikroorganismům než kyselina mléčná. Jejich optimální teplota růstu se pohybuje mezi 36 až 38 C a jako ideální hodnota ph se udává rozmezí od 6,5 do 7. Bifidobakterie jsou však inhibovány teplotními hodnotami do 25 C a nad 45 C. Typickým enzymem tohoto rodu je fruktózo-6-fosfát fosfoketoláza, která je odpovědná za odbourávání glukózy a její produkce je využívána k rozhodující identifikaci bifidobakterií. Bakterie tohoto rodu jsou schopny syntetizovat aminokyseliny, jako je kyselina glutamová a asparagová, nebo dále vitamíny, jako je riboflavin, thiamin a biotin. Dnes je rod Bifidobacterium předmětem intenzivního Mezinárodního výzkumu pro svou zásadní roli ve fermentovaných potravinách, zejména pro jejich schopnost produkovat různé antimikrobiální látky podporující probiotické vlastnosti (ROBINSON, 2002, ZINEDINE and FAID, 2007). Druhy zařazené do rodu Bifidobacterium jsou následující, B. adolescentis, B. angulatum, B. animalis, B. asteroides, B. bifidum, B. boum, B. breve, B. catenulatum, 25

B. choerinum, B. coryneforme, B. cuniculi, B. dentium, B. gallicum, B. gallinarum, B. indicum, B. longum, B. magnum, B. merycicum, B. minimum, B. pseudocatenulatum, B. pseudolongum, B, psychraerophilum, B. pullorum, B. ruminantium, B. saeculare, B. scardovii, B. subtile, B. thermacidophilum and B. thermophilum. Z toho následující druhy obsahují i dva poddruhy, B. animalis (subsp. animalis and lactis), B. pseudolongum (subsp. globosum and pseudolongum), B. thermacidophilum (subsp. thermoacidophilum a porcinum), a druh B. longum obsahuje tři odlišné biotypy (longum, infantis a suis) (LEE and SALMINEN, 2009). 2.3.3 Rod Streptococcus Taxonomické zařazení: Doména: Bacteria Kmen: Firmicutes Třída: Bacilli Řád: Lactobacillales Čeleď: Streptococcaceae Rod: Streptococcus Podle starší taxonomie se rod Streptococcus člení na šest skupin, skupinu pyogenních streptokoků, orálních streptokoků, anaerobních streptokoků, enterokoků, mléčných streptokoků a jiných streptokoků (S. thermophilus). V novějším rozřazení druhů v rámci rodu Streptococcus došlo k úplnému vynechání anaerobních streptokoků a k povýšení dalších dvou skupin na samostatné rody. První povýšenou skupinou jsou mléčné streptokoky, což jsou nehemolyzující nepatogenní druhy používané v mlékárenském průmyslu, které jsou nově zařazeny do rodu Lactococcus, například druhy L. lactis ssp. lactis, L. lactis ssp. cremoris a L. plantarum. Druhou skupinou jsou streptokoky vyskytující se často ve střevním traktu člověka a jiných savců, které jsou nyní přeřazeny do rodu Enterococcus, například L. faecium, L. gallinarum a L. durans. (GÖRNER a VALÍK, 2004, ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 26

Buňky rodu Streptococcus mají tvar koků, jsou tedy kulovité až vejčité o průměru menším než 2 µm. Koky se vyskytují nejčastěji v řetízcích, ale také ve dvojicích či jednotlivě. Jsou grampozitivní, většinou nepohyblivé a fakultativně anaerobní. Fermentují sacharidy hlavně na kyselinu mléčnou s velmi malým množstvím plynu. Některé druhy zkvašují i organické kyseliny a aminokyseliny. V rámci tohoto rodu je zahrnuta řada druhů pro člověka a zvířata patogenních, ale i těch využívaných v potravinářském průmyslu (GÖRNER a VALÍK, 2004). 2.3.3.1 Streptococcus thermophilus Streptococcus salivarius ssp. thermophilus spadá do skupiny jiných streptokoků, i když by se svými vlastnostmi lépe hodil do skupiny mléčných streptokoků. V mlékárenském průmyslu se využívá pro jeho schopnost zkvašovat laktózu na kyselinu mléčnou společně s jinými bakteriemi mléčného kysání ve formě termofilních zákysů (GÖRNER a VALÍK, 2004). Bakterie tohoto druhu jsou grampozitivní, kulovitého až vejčitého tvaru o velikosti 0,7 až 0,9 µm v průměru a tvoří dlouhé řetízky zhruba o 10 až 20 buňkách (ROBINSON, 2002). Optimální teplota růstu tohoto streptokoka se pohybuje okolo 45 C, ale je odolný i vůči teplotě 67, 5 C po dobu 50 minut a některé kmeny vydrží dokonce 80 C po dobu 15 minut. Druh Streptococcus thermophilus je důležitý pro výrobu jogurtů a některých druhů sýrů (GAJDŮŠEK a KLÍČNÍK, 1985). Jeho kladnou vlastností je rychlé zvyšování kyselosti, čehož je využíváno při výrobě sýrů, a zápornou, že nesnáší zvýšené koncentrace NaCl (>2 %). Je velmi citlivý na antibiotika a jiné inhibiční látky, proto je v mlékárenství využíván k zjišťování přítomnosti právě těchto látek v mléce (GÖRNER a VALÍK, 2004). 27

2.3.4 Rod Bacillus Taxonomické zařazení: Doména: Bacteria Kmen: Firmicutes Třída: Bacilli Řád: Bacillales Čeleď: Bacillaleae Rod: Bacillus Rod Bacillus je velice rozsáhlý a v přírodě velmi rozšířený. Druhy tohoto rodu tvoří nejčastěji grampozitivní peritrichní tyčinky. Bakterie jsou enzymově bohatě vybavené, tedy schopné rozkládat nejrůznější organické sloučeniny. Obsahují amylolytické, pektolytické i proteolytické enzymy. Některé druhy produkují antibioka, z nichž některá se pomocí těchto bakterií vyrábějí průmyslově, například bacitracin. Určité druhy slouží také pro průmyslovou přípravu enzymů (ŠILHÁNKOVÁ, 2002). 2.3.4.1 Bacillus coagulans Tento druh byl izolován a popsán již v roce 1933 a byl pojmenován jako Lactobacillus sporogenes. Až později byl překlasifikován na Bacillus sporogenes a následně přejmenován na Bacillus coagulans. Je sporotvorný, pohyblivý a kataláza pozitivní, z těchto důvodů musí být zařazen v rámci rodu Bacillus, i když se od tohoto rodu liší elipsoidním tvarem spor a jejich umístěním v jednom z buněčných polů, nedostatkem cytochrom oxidázy a neschopností redukce dusičnanů na dusitany. Dále je Bacillus coagulans fakultativně anaerobní, grampozitivní, má tvar tyčinek, které jsou spojeny v řetízcích různých délek. Jeho optimální teplota růstu se pohybuje mezi 35 až 50 C a vyhovuje mu ph v rozmezí 5,5 až 6,5. Tvoří kyselinu mléčnou bez vedlejší produkce plynu, čímž by se mohl řadit mezi rod Lactobacillus. Produkcí této kyseliny a dalších produktů, jako jsou termostabilní enzymy, může být využit na průmyslové úrovni. 28

Existuje málo údajů o odolnosti této bakterie vůči kyselinám a žluči. Avšak spory tohoto druhu jsou odolné vůči nepříznivému prostředí, tudíž by měly odolat průchodu kyselým prostředí žaludku a dostat se až do střeva, kde by mohlo dojít ke sporulaci. Tvorba spor je také výhodou u lyofilizovaných doplňků stravy, jelikož spory dobře přežívají průmyslové zpracování a zajišťují dlouhodobou životaschopnost bakterie i po dobu skladování. V jedné studii se také prokázalo, že ke žluči je slabě tolerantní. Bacillus coagulans se bohužel vykazuje špatnou adherencí na střevní epitel. Také se předpokládá vliv tohoto bakteriálního druhu na potlačení patogenních bakterií, ale tento účinek musí být ještě objasněn. V některých studiích však již byla prokázána tvorba netěkavých látek s inhibičním účinkem vůči enterokokům rezistentních na vankomycin. V jedné humánní studii se také projevil pozitivní účinek ke snížení celkového cholesterolu, avšak toto zjištění ještě nelze označovat za průkazné. Bacillus coagulans je na některých výrobcích stále označován jako Lactobacillus sporogenes, což je z taxonomického hlediska nesprávné zařazení a do budoucna by se takovéto označení mělo úplně vyloučit. O probiotickém působení tohoto bakteriálního druhu existují zatím omezené solidní vědecké důkazy, ale jsou k dispozici dvě významné výhody. Prvním pozitivem je jeho velká stabilita při výrobě a skladování a druhou výhodou jsou nízké výrobní náklady (VECCHI and DRAGO, 2006). 2.4 Formy probiotických preparátů na trhu Existuje mnoho způsobů, jak dodávat do střevního traktu probiotické kultury, jejichž přítomnost či nepřítomnost v dostatečném počtu může znamenat rozdíl mezi zdravím a nemocí. Mezi způsoby, jak dostat probiotika tam, kde člověku mohou pomáhat, se řadí příjem probiotických mikroorganismů pomocí stravy, nejčastěji konzumací mléčných výrobků a druhou možností je užívání potravních doplňků ve formě kapslí či tablet (MACHALA, 2008). 2.4.1 Potraviny s obsahem probiotik Probiotika, jakožto látky nenutriční povahy, které jsou však svým působením organismu prospěšné, jsou jako funkční složky součástí tzv. funkčních potravin. Takováto potravina vykazuje kromě vlastního nutričního účinku ještě další prospěšný 29

vliv na jednu či více cílových funkcí organismu, jako je například snížení rizika určitých onemocnění (MÜLLEROVÁ, 2003). Probiotické potraviny během posledních několika let zaznamenaly značný rozmach. I v České republice se spotřebitelům dostaly více do podvědomí. Mezi těmito potravinami mají hlavní slovo kysané neboli fermentované mléčné výrobky s přídavkem probiotických mikroorganismů. Kysané mléčné výrobky mají svůj původ v mnoha lidových mléčných nápojích vznikajících přirozenou fermentací mléka, která byla způsobena mikroorganismy obsaženými v syrovém mléce. Dnes jsou při výrobě probiotických potravin využívány pouze čisté mlékařské kultury, které jsou označené jako probiotické. K fermentaci se v současnosti požívají bakterie mléčného kysání, z nichž majoritní zastoupení mají bakterie rodu Lactobacillus a Bifidobacterium. Nyní se k probiotickým produktům řadí téměř všechny zakysané mléčné výrobky tekuté a jogurtového typu. Využití probiotik se přenáší i na další skupiny potravinářských výrobků například snídaňové cereálie a šťávy, masné výrobky, nápoje a kvašené výrobky obecně (BARTOŠOVÁ, 2009). Dle znění vyhlášky č. 77/2003 Sb. se kysaným mléčným výrobkem rozumí mléčný výrobek, který je získaný kysáním mléka, smetany, podmáslí nebo jejich směsi za použití mikroorganismů uvedených v následující tabulce a je tepelně neošetřený po kysacím procesu. Mezi kysané mléčné výrobky patří jogurt (nízkotučný nebo odtučněný, se sníženým obsahem tuku, smetanový), jogurtové mléko, acidofilní mléko, kefír, kefírové mléko, kysané mléko nebo smetanový zákys, kysaná nebo zakysaná smetana, kysané podmáslí a kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou (Vyhláška č. 77/2003 Sb.). 30

Tab. 4: Druhy živých mikroorganismů v kysaných mléčných výrobcích (Vyhláška č. 77/2003 Sb.) Druh výrobku Použité mikroorganismy Mléčná mikroflóra výrobku v 1 g Acidofilní mléko Lactobacillus acidophilus a další mezofilní, příp. termofilní kultury 10 6 Lactobacillus acidophilus bakterií mléčného kvašení Jogurty *) protosymbiotická směs Streptococcus salivarius subsp. thermophilus a Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 10 7 Kysané mléko, vč. smetanového zákysu, podmáslí, a kysané smetany Kefír Kefírové mléko Kysaný mléčný výrobek s bifidokulturou monokultury nebo směsné kultury bakterií mléčného kvašení zákys připravený z kefírových zrn, jehož mikroflóra se skládá z kvasinek zkvašujících laktózu Sacharomyces cerevisce, Sacharomyces exitus a dále Leuconoctoc, Lactococcus a Aerobacter, rostoucí ve vzájemném společenství zákys skládající se z kvasinkových kultur rodu Kluyveromyces, Torulopsis nebo Candida valida a mezofilních a termofilních kultur bakterií mléčného kvašení v symbióze Bifidobacterium sp. v kombinaci s mezofilními a temofilními bakteriemi mléčného kvašení 10 6 bakterie mléčného kvašení 10 6 a kvasinky 10 4 bakterie mléčného kvašení 10 6 a kvasinky 10 2 10 6 bifidobakterie *) U jogurtových výrobků mohou být kromě základní jogurtové kultury přidávány kmeny produkující kyselinu mléčnou a pomáhající dotvářet specifickou chuťovou nebo texturovou charakteristiku výrobku. Musí však být zachován optimální poměr obou základních kmenů jogurtové kultury. 2.4.2 Probiotické doplňky stravy Doplněk stravy, je produkt, který obsahuje směs jednotlivých potravních doplňků, které u zdravého člověka mají zajistit jediné, a to dostatečný příjem toho kterého potravního doplňku, který chybí v běžné stravě, anebo nějaké přírodní, nebo 31

dokonce uměle vytvořené, ale pro lidský organismus vlastní, nebo stravou přijímané látky, která svým efektem má jistým způsobem ovlivnit některý z fyziologických procesů, probíhajících u zdravého člověka (FOŘT, 2005). Další z možností jak organismu dodat užitečné probiotické bakterie je pomocí kvalitních koncentrovaných výživových doplňků. Měly by být podávány v enterosolventní kapsli, která je odolná proti kyselému prostředí žaludku. Tímto je zajištěno jejich přežití při průchodu žaludkem až do tenkého a tlustého střeva. V kapsli se probiotické mikroorganismy nacházejí v lyofilizované formě. Lyofilizace je proces sušení, kdy se touto nadstandardní technologií získává 100 % přírodní produkt, který je mimořádně mikrobiologicky čistý. Původní biochemické i morfologické vlastnosti bakterií se při tomto procesu nemění a i několik let si zachovávají svoji životnost. Po natrávení obalu kapsle ve střevě se lyofilizované probiotické mikroorganismy uvolní, naberou vlhkost z intestinálního prostředí a začnou se rozmnožovat. Kvalitní výživové doplňky obsahují zároveň i prebiotika, které jsou potravou pro probiotické bakterie (HORÁKOVÁ, 2012). Na účinnost farmaceutických kapslí či tablet existují různé názory. Jeden říká, že jen malé procento doplňků s probiotiky obsahuje dostatečný počet živých probiotických kultur. Další průzkum zase vypovídá o tom, že probiotika samotná jsou méně úspěšná v uchycení se uvnitř gastrointestinálního traktu člověka než probiotika na povrchu potravin. Dále existuje tvrzení, že některé přípravky mohou být účinné u některých lidí a jiné u jiných (KALAČ, 2003). Další publikace uvádí, že podmínku dostatečného počtu životaschopných probiotických bakterií nejlépe splňují doplňkové výživové přípravky, které jsou podávány ve formě želatinových kapslí perorálně. Kapsle jsou totiž naplněny dostatečným počtem mikroorganismů v lyofilizovaném stavu, což zaručuje jejich životnost na minimálně jeden rok. Oproti tomu životnost probiotických bakterií v zakysaných mléčných výrobcích je časově omezená, například bifidobakterie v různých jogurtech přežívají nejdéle 8 10 dní od výroby. Další výhodou je, že do kapslí se mohou kromě probiotických bakterií přidat vitaminy či stopové prvky (FERENČÍK a kol. 2005). 32