Glycoscience: A Frontier in New Landscapes Milos V. Novotny National Center for Glycomics and Glycoproteomics and Department of Chemistry, Indiana University, Bloomington, Indiana, USA
Chemistry Building Indiana University
CO JE ANALYTICKÁ GLYKOBIOLOGIE? - Relativně nová vědní oblast integrující nové přístupy k měření základních biologických procesů na buněčné a molekulární úrovni. Staví na znalosti úlohy konjugátů důležitých látek jako jsou bílkoviny (proteiny) a lipidy, ve spojení s cukernými složkami biologické hmoty, takzvanými oligosacharidy (nebo glykany). Zde hovoříme o takzvaných glykoproteinech, glykolipidech a proteoglykanech. - I když význam těchto cukerných látek (glykonjugátů) pro selektivní regulaci důležitých buněčných procesů je zřejmý po více než dvě desetiletí, do nedávné doby nebylo možné tyto biologicky důležité procesy kvantitativně vyhodnotit.
ROLE MODERNÍ ANALYTICKÉ CHEMIE -Nové metody a přístrojová technika otevírají značné možnosti biologického a lékařského významu. -Jedním z hlavních úkolů je velice citlivá a strukturálně detailní analýza biologických matricí v malých objemech a stopových množstvích biologicky důležitých látek. Hmotnostní spektrometrie je klíčovou detekční metodou v glykobiologii. -Použití nových separačních přístupů chromatografie a elektroforézy je rovněž žádoucí. -Kvůli komplexnosti analytických dat je rovněž nutné využít počítačové techniky a bioinformatiky.
ANALYTICKÁ GLYKOBIOLOGIE Glykomika Glykoproteomika se zabývá studiem oligosacharidových složek glykokonjugátů se zabývá detaily spojení oligosacharidových složek s bílkovinami
GLYKOBIOLOGIE GLYKOPROTEOMIKA FUNKČNÍ GLYKOMIKA
Emil Fischer Laureát Nobelovy ceny za chemii 1902
Monosacharidové strukturní jednotky glykánů N-glycolylneuraminová kyselina (NeuGc)
O-glykan O-glykan O-glykan N-glykan O-glykan GlcNAc GalNAc Man Gal Fuc Sial GlcN Inositol Ethanolamin Fosfát GPI membránové ukotvení O O C O C O
Povrch buňky je hustě obsazen oligosacharidy ukotvenými k proteinům nebo lipidům v buněčné membráně. Tyto oligosacharidy pak zprostředkovávají mezibuněčné interakce a interakce buněk s mimobuněčnými subjekty. Důležitá role, kterou sacharidy zastávají v biologických systémech, výrazně přispěla k rychlému rozvoji oboru glykobiologie. 23. březen 2001 "Carbohydrates and Glycobiology" Vol. 291 Pages 2263-2502
Souvislost glykosylace s různými nemocemi Imunita proti infenkčním onemocněním, včetně HIV Revmatická artritida (změny IgG a hladiny mannosu vázajících proteinů v séru) Nemoci prionů Vrozené poruchy glykosylace (vzácné, obvykle se projeví poruchami CNS) Nemoci ústní dutiny Cystická fibróza Srdeční poruchy Rakovina
L. Tong, et al. in Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, Vol 20, p. 214 (2003)
% Intensity % Intensity 100 80 60 40 20 0 20 40 60 80 Healthy Prostate Cancer 100 1500 2200 2900 3600 4300 5000 Mass (m/z) PC2 Score 70 60 50 40 30 20 10 0-10 -20-30 -40-50 -60-70 -80-90 Healthy Prostate Cancer PC-19 PC-21 PC-23 PC-14 PC-07 PC-12 PC-11 PC-08 PC-22 PC-20 PC-03 PC-09 PC-17 PC-05 PC-02 PC-13 PC-10 PC-24 PC-06 PC-01-80 -60-40 -20 0 20 40 60 80 100 120 PC1 Score H-10 PC-16 PC-18 PC-04 H-8 PC-15 H-9 H-1 H-5 H-4 H-2 H-6 H-7 H-32 Sensitivity 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 2285 AUC = 0.94 ± 0.04 highly accurate test 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Specificity MALDI-MS PCA ROC Potenciální glykánové biomarkery Postup směřující k možné diagnostice a prognostice rakoviny prostaty, který je založen na profilování permethylovaných glykánů pomocí MALDI-MS. Výsledky z této metodiky ukazují statisticky významné rozdíly mezi glykomickými profily 10 zdravých jedinců a 24 pacientů s rakovinou prostaty. Potenciální glykánové biomarkery pro rakovinu prostaty jsou poté stanoveny pomocí statistických testů jako PCA, ROC a ANOVA. Kyselova, Z.; Mechref, Y.; Al Bataineh, M.; Dobrolecki, L.; Hickey, R.; Vinson, J.; Sweeney, C.; Novotny, M.V. J. Proteome Res., 6 (2007) 1822-1832.
PCA of MALDI/MS Profiling of Glycans Derived from Sera of Cancer Free Individuals (n= 77), Liver Cancer Patients (n= 73), and Cirrhosis Patients (n= 53) PC2 Score 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0-2 -4-6 -8-10 -12-14 -16 HC (n= 73) NC (n= 77) QT (n=53) -50-45 -40-35 -30-25 -20-15 -10-5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 PC1 Score
MALDI TOF-TOF (ABI 4800) Reflektron Detektor pro lineární mód Zdroje vysokého napětí Ovládaní iontové optiky TOF 2 CID cela TOF 1 Laser (355 nm) Detektor pro reflektron mód Ionizační zdroj Vstup pro platíčko Řídící elektronika
Platforma na analýzu glykoproteinů Vzorek MARS kolona M. Madera, Y. Mechref, I. Klouckova, M. V. Novotny J. Proteome Res., 2006; 5(9); 2348-2363.. Lektinová afinitní chromatografie mrp (70 o C) chromatografie Sběr frakcí a Trypsinová digesce Nano LC-MS/MS Hledání v databázi Výsledek
LTQ-FT Ultra
PROKARYOTIC SYSTEMS Glycans provide the first interfacial layer between mammalian host and pathogens. Glycosylation thus plays a crucial role in pathogenicity and invasion. Some microorganisms express distinctly different carbohydrate units and oligosaccharide structures. How does glycosylation occur in bacteria without compartmentalization? How do bacterial glycans affect host immune recognition or evasion? A better insight into prokaryotic glycosylation should help the design and production of glycosylated therapeutics.
Jun Hirabayashi Nature Chemical Biology 5(2009)198-199
-OMICS REVOLUTION AND ITS IMPACT ON SCIENCE AND ECONOMIES -Creation of entirely new fields of investigation (genomics, transcriptomics, proteomics, glycomics, metabolomics, lipidomics, etc.) -Unprecedented opportunities to gather massive amounts of data on biological systems (and their interpretation) - Systems biology leading to the nearly complete understanding of how different biological systems work -Creating new opportunities to combat human and animal diseases through a better understanding of the underlying biochemical processes -Creating new industries based on (a) better ways of analytically assessing (measuring) important biological/medical data; (b) sorting out relevant information (data interpretation through bioinformatics); and (c ) making use of the new knowledge in disease diagnosis, personalized treatment (pharmacogenetics) and development of new therapeutic agents