Lipidomika - definice

Transkript

1 Lipidomika

2 Lipidomika - definice Journal of Lipid Research, Vol. 47, , October 2006 Lipidomics: a global approach to lipid analysis in biological systems by Andrew D. Watson Lipidomika, která je odvětvím vědecké disciplíny zvané metabolomika, znamená systematické studium všech lipidů, jejich struktury, zastoupení a funkce v buňce, a dále molekul se kterými interagují (z těchto se myslí zejména proteiny). BIOLOGICKÝ SYSTÉM GENOM TRASKRIPTOM PROTEOM METABOLOM CUKRY LIPIDY AMINOKYSELINY NUKLEOTIDY LIPIDOM

3 Nedávná zdokonalení měkkých ionizačních technologií pro hmotnostní spektrometrii v kombinaci se zavedenými separačními technikami (LC, GC) umožnila rychlou a citlivou detekci rozmanitých lipidových látek s minimalizovanou náročností přípravy vzorku. Pojmem "lipidový profil" surového lipidového extraktu (buň. či tkáňová kultura) se myslí hmotnostní spektrum, které ukazuje složení a abundanci obsažených lipidů. Lipidový profil můžeme použít k monitorování změn v čase a v rámci odezvy na určité podněty. Lipidomika spolu s genomikou, proteomikou a metabolomikou přispěje k pochopení funkce lipidů v biologickém systému a je mocným nástrojem pro vysvětlení mechanismů nemocí spojených s lipidy, sledování biomarkerů a monitorování farmakoterapie.

4 Lipidy Ve vodě nerozpustné látky, které mají hydrofobní nebo amphipatické vlastnosti. Vznikají z části kondenzací thioesterů (mastné kys., polyketidy) nebo izoprenových monomerů (prenoly, steroly). Lipidy byly dříve považovány v organismu za nedůležité látky sloužící pouze jako zdroj energie a stavební jednotky membrán. Dnes se ví, že lipidy mají v živém organismu celou řadu funkcí: 1) udržování elektrochemického gradientu 2) tvorba subcelulárních struktur (kompartmentace) 3) úloha v buněčné signalizaci (první a druhý posel) 4) uchovávání energie, zdroj esenciálních mastných kyselin (ꙍ-3, ꙍ-6, kys. linolová, linolenová), zdroj lipofilních vitamínů (A, D, E, K) 5) transport proteinů a jejich kotvení v membránách Řada onemocnění souvisí s poruchami metabolismu lipidů např. atheroskleróza, diabetes, obezita, Alzheimerova choroba.

5 Rozdělení lipidů jednoduché triacylglyceroly vosky acylsteroly isoprenoidní steroly Žlučové kyseliny Základem jsou estery vyšších monokarboxylových kyselin a vyšších alkoholů. Strukturně odlišné struktury, účastní se transportu jednoduchých lipidů v organismu; jsou s nimi součástí bio. struktur. fosfolipidy glycerofosfolipidy fosfatidylcholiny fosfatidylethanolaminy fosfatidylseriny fosfatidylinositoly plasmalogeny složené sfingofosfolipidy sfingomyeliny glykolipidy sfingoglykolipidy cerebrosidy gangliosidy sulfatidy Složené lipidy tvoří vedle základní složky ještě další polární část dodávající hydrofilní vlastnosti. Tyto molekuly jsou součástí jak biologických membrán, tak i poárního prostředí krevní plasmy.

6 Krevní lipoproteiny 1) jsou to nekovalentní komplexy lipidů se specifickými proteiny (tzv. apolipoproteiny) vyskytující se v krevní plasmě. Zajišťují transport a distribuci lipidů (triacylglycerolů, steroidních hormonů, vitaminů rozpustných v tucích, cholesterolu, fosfolipidů atd.). 2) Jsou tvořeny jádrem nepolárních lipidů (triacylglyceroly, cholesterol), obklopeným polárními lipidy a apolipoproteiny. Podle obsahu lipidů, který přímo určuje jejich hustotu, dělíme krevní lipoproteiny na chylomikrony (obsah lipidů 99 %), lipoproteiny s velmi nízkou hustotou VLDL, 93 %), lipoproteiny se střední hustotou (IDL, 89 %), lipoproteiny s nízkou hustotou (LDL, %), lipoproteiny s vysokou hustotou (HDL, %) a lipoproteiny s velmi vysokou hustotou (VHDL, 35-3 %). 3) Jednotlivé frakce mají různé úkoly při transportu lipidů; jejich stanovení v krevní plasmě má velký význam pro diagnostiku. Osud lipoproteinových částic je pestrý; mohou procesem endocytosy vstupovat do buněk, kde jsou obvykle rozloženy lysosomální hydrolýzou, mohou být v plasmě hydrolyzovány lipoproteinlipasami (EC ), přičemž jeden typ přechází postupně na druhý (ve směru od chylomikronů k částicím s větší hustotou) atd.

7 J. Lipid Res. (2005), Vol. 46,

8

9

10 Analyzované STRUKTURNÍ odlišnosti lipidů Rozdíly Identifikace, metody, veličina Třídy lipidů (fukční skupiny) MS, LC/MS M, t R Délky acylů (zbytků monokarboxylových kys., počet uhlíků, CN) MS, LC/MS M, t R Lineární / větvené acyly LC t R Počet dvojných vazeb (DB) MS, LC/MS M, t R Poloha dvojných vazeb (DB) MS, LC/MS, MS po derivatizaci Fragmenty, t R Geomtrie dvojných vazeb (cis-/trans-) LC t R Regioizomery (AAB / ABA) MS, LC/MS Poměry iontů, t R Optické izomery (AA*B / BA*A) LC, LC po derivatizaci t R M molekulová hmotnost lipidů; t R,- retenční čas; DB dvojná vazba, CN počet uhlíků

11 Analýza lipidů Analýza vzorků je zaměřena na: 1) identifikaci lipidů a jejich charakterizaci; 2) kvantifikaci. Rozlišujeme dva základní přístupy k analýze lipidomu: lipidomic profiling, shotgun lipidomics analýza celého vzorku najednou bez předchozí frakcionace a separace následovaná statistickým popisem dat. Výsledkem jsou hrubá data, definující profil jednotlivých složek vzorku, ale bez další charakterizace. Detailní charakterizace lipidů ve vzorku kombinací vhodných separačních (LC, GC) a spektrálních technik (MS, IČ, NMR) získáváme detailní znalost složení vzorku (typy lipidů, struktura, kvantitativní zastoupení). 1. Příprava vzorku Extrakce lipidů pomocí nepolárních rozpouštědel SPE, SFE dělení lipidů stanovení třídy lipidů (SPE, TLC, HILIC) Derivatizace vzorků pro detailní charakterizaci lipidů 2. Analýza lipidů Separační techniky LC, GC, CE, SFC Spektrální techniky MS, IČ, NMR 3. Interpretace dat - kvalitativní a kvantitativní analýza lipidů, statistické zpracování dat

12 Extrakce lipidů Neselektivní extrakcí se získá celkový lipidový extrakt Extrakce lipidů: 1. FOLCH (Folch et al. (1957)) chloroform/methanol/voda (2:1:0,6) 2. BLIGH/DYER (Bligh & Dyer (1959)) chloroform/methanol/voda (1:2:0,6) 3. MTBE methyl-terc-butylether/methanol/voda (4:1:1) 4. Extrakce nepolárních lipidů hexan/methanol/voda (4:1:1) Výsledkem extrakce je vznik dvou fází, kdy: - vodná fáze (směs voda/methanol) obsahuje složky nelipidové povahy - organická fáze (směs chloroform(methyl-terc-butylether)/methanol) obsahuje mix jednoduchých a složených lipidů. Zlepšenou extrakci vybraných tříd lipidů lze ovlivnit přídavkem vybraných aditiv jako např. NaCl zvýší extrakci fosfoinositolů. Dělení celkového lipidového extraktu na jednotlivé třídy se provádí pomocí: TLC chromatografie normální fáze+modifikace (Ag+), reverzní fáze LC chromatografie normální fáze, reverzní fáze, HILIC nosiče SPE techniky (NH2, diol)

13 Ukázka dělení celkového extraktu lipidů

14 Derivatizace lipidů Derivatizace se provádí pro vylepšení buď separačních vlastností a nebo detekč-ních vlastností (např. detekce pomocí UV). Techniky derivatizace: 1. Reesterifikace nejčastější derivatizační reakce v analýze lipidů Tvorba methylesterů MK reesterifikací s methanolem (diazomethan, MeONa, methanol+bcl3, HCl, H2SO4) Analýza methylesterů pomocí GC/FID kvantitativní analýza Charakterizuje se celkový profil mastných kyselin všech lipidů ve vzorku; ztráta informace o molekulách lipidů. 2. Acylace volných OH-skupin pro zvýšení retence v LC 3. Odštěpení fosfoskupiny enzymatická reakce pomocí fosfolipázy, dělení uvolněných acylglycerolů, případně následná acylace 4. Zavedení skupin a strukturních prvků pro dělení optických izomerů Selektivní odštěpení MK z předem definované polohy na glycerolovém skeletu s využitím selektivních lipáz Derivatizace vzniklé OH-skupiny opticky aktivní látkou Dělení derivátů na chirální koloně 5. Adice skupin/atomů na dvojnou vazbu techniky určování polohy dvojné vazby na základě charakteristických fragmentů v MS (halogenidy, nitroderiváty).

15 Techniky analýzy lipidů Separační techniky Tenkovrstevná chromatografie preparativní frakcionace lipidů, široká škála povrchů Plynová chromatografie v kombinací s plamenoionizační detekcí nebo MS detekcí využití pro dělení po derivatizaci Kapalinová chromatografie s velkým množstvím detektorů MS (různé typy ionizací APCI, ESI, APPI), ELSD, CAD, UV, RI Normální fáze, HILIC separace dle polarity, frakcionace lipidů na třídy Reverzní fáze (C8, C18) separace podle počtu dvojných vazeb a počtu uhlíkových atomů Ag-HPLC dělení podle počtu dvojných vazeb Off-line, on-line 2D HPLC kombinace Ag-LC a RP-LC chromatografie Superfluidní kritická chromatografie, kapilární elektroforéza a další Spektrální techniky Hmotnostní spektrometrie (spojení s GC, LC, identifikace, detailní charakterizace) Nukleárně-magnetická chromatografie (1H, 13C-NMR spektra, analýza struktury lipidů) Infračervená spektroskopie (cis-/trans- konfigurace DB)

16 Separace jednoduchých lipidů Dělení lipidů pomocí chromatografických technik GC (po derivatizaci), LC na základě počtu uhlíků a počtu dvojných vazeb. GC-FID(MS) methylesterů MK LC-UV dělení fenylacylesterů MK

17 Separace složených lipidů Složené lipidy se dělí pomocí chromatografických technik LC a GC (po derivatizaci) 1. do skupin dle polarity funkčních skupin 2. dělení v rámci jedné skupiny podle počtu uhlíků a dvojných vazeb. Dělení složených lipidů po derivatizaci fosfolipáza > derivatizace Zlepšení dělení, acetáty diacylglycerolů získané z fosfolipidů jsou děleny jako jednoduché lipidy Zavedení skupin pro detekci (chromofory, fluorescence). Dělení intaktních složených lipidů Kapalinová chromatografie na reverzních fázích: sorbent C18, mobilní fáze voda/organika (ACN, MeOH, hexan), aditiva Detekce MS, UV, ELSD, CAD, RI, Fluorecence.

18 Comprehensive analysis of lipids in biological systems by liquid chromatography - mass spectrometry. Tomas Cajka, Oliver Fiehn Trends in Analytical Chemistry 61 (2014) CE, Cholesteryl ester; DG, Diacylglycerol; FA, Fatty acid; PA, phosphatidic acid; PC, phosphatidylcholine; PE, phosphatidylethanolamine; PG, phosphatidylglycerol; PS, phosphatidylserine; MG, Monoacylglycerol; PC, Phosphatidylcholine; PI, phosphatidylinositol; SM, Sphingomyelin; TG, Triacylglycerol;

19 Lipidomická analýza pomocí MS 1/ Lipidomic Profiling, Shotgun lipidomics přímá infúze celkového lipidového extraktu - hmotnostní spektrum = ionty (de-) protonovaných molekul, adukty a fragmenty všech lipidů přítomných ve směsi (stovky látek!!!) MALDI, ESI nebo DESI bez separace, statistické zpracování dat využití MS n pro identifikaci látek kvantitativní analýza pomocí interních standardů mastné kyseliny s lichým CN nebo izotopicky značené standardy (2D, 13C) pouze hrubá data (profil vzorku), bez znalosti složení vzorku 2/ Detailní charakterizace vzorku lipidů kombinace MS a separačních technik separace v několika krocích oddělení skupin lipidů a následná charakterizace jednotlivých skupin využití dalších spektrálních technik (IČ, NMR, UV) detailní znalost složení vzorku (struktura lipidů, kvantita)

20 Lipidomická analýza pomocí MS Vliv struktury na odezvu lipidů v hmotnostní spektrometrii. Funkční skupiny velmi silný vliv na odezvu v MS volba ionizační techniky - ESI - polární lipidy (PC, PE, PI, atd.) - APCI - nepolární (triacylglyceroly, voskové estery, cholesterol estery, atd.) volba polarity záznamu - ESI kladné ionty - PC, SM, LPC - ESI záporné ionty - PS, PI, PA - ESI kladné / záporné ionty - PE Alifatická část různá odezva pro stejné třídy lipidů délka acylů počet dvojných vazeb (rozdílné retenční časy Ag-LC, derivatizace) poloha dvojných vazeb (rozdílné retenční časy Ag-LC, derivatizace, rozdílné intenzity fragment. Iontů) poloha acylu na glycerolovém skeletu

21 Hmotnostní spektrum extraktu (MS), lipidový profil negativní mód

22 Strategie MS/MS v lipidomice Product ion scan Precursor ion scan Neutral loss scan

23

24

25

26 Lipid blast in silico tandem mass spectrometry database for lipid identification Tobias Kind, Kwang-Hyeon Liu, Do Yup Lee Brian DeFelice, John K Meissen & Oliver Fiehn Nature methods 10(8), pp.755, freely available computer-generated tandem mass spectral library of 212,516 spectra covering 119,200 compounds from 26 lipid compound classes, including phospholipids, glycerolipids, bacterial lipoglycans and plant glycolipids.

27

28 Lipid Metabolites and Pathways Strategy cíle LIPID MAPS (1) Separovat a detekovat všechny lipidy v dané buňce, objevit a charakterizovat nové lipidy, které by navíc mohly být přítomné. (2) Kvantifikovat každý z přítomných lipidových metabolitů a změny v jeho hladinách a lokalizaci během buněčného života. (3) Definovat metabolické dráhy vlastní každému lipidu a vytvořit z nich lipidové mapy, které by ukazovaly sítě vzájemných interakcí.

29 Glykobiologie Glykoproteomika Funkční glykomika Glycobiology how sweet it is!

30

31 Monosacharidy (glukosa, fruktosa, galaktosa ) Oligosacharidy (maltosa, isomaltosa, sacharosa, laktosa.., oligosacharidové řetězce tzv. glykany v glykoproteinech a glykolipidech) Polysacharidy (celulosa, škrob, pektin, chitin, glykogen, hyaluronová kyselina atd.) mají podíl na architektuře buňky strukturní funkce, slouží jako zásobárna energie, významná role v metabolismu

32 Monosacharidy běžné v glykoproteinech

33 Glykosylace je nejběžnější posttranslační modifikací proteinů: membránově vázané receptory, mnoho rozpust-ných proteinů a dokonce i nukleoproteiny. Posttranslační glykosylace proteinů probíhá v endoplasmatickém retikulu s katalytickou účastí glykosylačních enzymů N-glykany jsou vázány přes N-acetyl-β-D-glukosamin (βglcnac) na amidový dusík v L-asparaginu. Pro tuto glykosylaci musí být přítomná signální sekvence Asn-Xxx-Ser/Thr, přičemž Xxx může být jakákoli aminokyselina s vyjímkou Pro a Asp. O-glykany jsou vázány na hydroxylovou skupinu L-serinu nebo L- threoninu, a to přes N-acetyl-α-D-galaktosamin (αgalnac). Na základě současných vědomostí pro O-glykany neexistuje žádná signální sekvence.

34 Chemická diverzita glykanů Glycomics: an integrated systems approach to structure-function relationships of glycans Rahul Raman, S Raguram, Ganesh Venkataraman, James C Paulson & Ram Sasisekharan Nature Methods 2, (2005), doi: /nmeth807

35 V glykosylaci téhož glykoproteinu existuje běžně variabilita daná přítomnosti více glykosylačních míst. Glykoformy jediného glykoproteinu mají shodnou sekvenci polypeptidového řetězce. Rozmanitost v umístění, stupni saturace na jednotlivých glykosylačních místech a složení glykanových řetězců však přispívá k mikroheterogenitě v molekulové hmotnosti a náboji. Glykosylace proteinů vykazuje čtyři typy specifičnosti. Druhová specifičnost - odlišnosti mezi analogickými proteiny např. lidskými a jinými savčími. Tkáňová specifičnost: glykosylační typ ledvinových glykoproteinů se liší od typu charakteristického pro pojivovou tkáň. Buněčná specifičnost je dána vlastnostmi a funkcí určité buňky. Proteinová specifičnost (nejnižší úroveň), kdy proteiny produkované např. stejnou buněčnou linií za stejných kultivačních podmínek mají různou glykosylaci.

36 Variability N-glykanů mezi organismy

37 Science 291, 2357 (2001); Carolyn R. Bertozzi, et al. Chemical Glycobiology

38 Sialové kyseliny Sialové kyseliny u člověka a živočichů představují zakončení oligosacharidů na povrchu buněk.

39

40 Jaké informace se získávají při analýze glykoproteinů? 1. Glykosylační místa počet; 2. Jejich obsazení oligosacharidovými řetězci; 3. Sekvence řetězců; 4. Místa větvení; 5. Vazebné propojení a konfigurace monosacharidů; 6. Odlišení izobarických struktur.

41

42 Afinitní chromatografie s použitím lektinů

43

44 APTS značení glykanů před separací kapilární elektroforézou výsledkem stejný náboj (po předchozí desialylaci, rozdílná velikost má vliv na migraci

45 Permethylace Methylace oligosacharidů pro MS analýzu umožňuje současně analyzovat neutrální a sialylované struktury; -umožňuje RP-HPLC separaci permethylovaných struktur; - zdokonaluje výsledky MS/MS a zjednodušuje jejich interpretaci; Provedení: dimethylsulfoxidem smíseným s práškovým hydroxidem sodným a methyljodidem. Ciucanu I, Kerek F Carbohydr. Res. 1984,131,

46

47 Hmotnostní spektrometrie glykanů Zejména MALDI-TOF MS 1. Měření intaktních molekul (velikost). 2. Fragmentace (pro určení struktury). tři typy fragmentačních experimentů: - PSD (post-source decay), fragmenty vznikají po extrakci iontů z iontového zdroje ISD (in-source decay), fragmenty vznikají uvnitř iontového zdroje - CID (collision-induced dissociation), fragmenty vznikají v kolizní cele pomocí kolizního plynu

48

49

50

51

52 Určení N-glykosylačních míst a heterogenity Ann et al., Anal. Chem. 75 (2003) 5628.

53 Amidasová reakce N-glykosidasy F (PNGasa F) Deglykosylace použitím hydrazinu Patel et al. Biochemistry 1993, 32(2) p

54 β-eliminace s použitím amoniaku

55 Enzymová sekvenční analýza

56

57

58 On-plate sekvencování

59

60 % Intensity % Intensity PSAO glycosylation at Asn Mass (m/z) (W)VTAYNR(T) Tryptic N-glycopeptides with 0 or 1 missed cleavage (R)GAFTNYNVWVTAYNR(T) (R)GAFTNYNVWVTAYNRTEK(W) N-glycopeptides produced by nonspecific activity of trypsin Mass (m/z) MS/MS

61 % Intensity PSAO glycosylation at Asn558 MSMS analysis Suggested N-glycopeptide structure or (W) VTAYNR (T) Z 0 (y 6 -NH 3 ) Peptide backbone fragmentation N-glycosylation pattern Y 0 (y 6 ) ,2 X 0 Y Y 1 ( 0,2 X Da) 0,2 X 0 (MH Da) Mass (m/z) O OH OH O NHAc Y 0 (MH + ) Z 0 (MH Da) O N H 120 Da 83 Da 17 Da N-glycan chain fragmentation C H 2 C CH NH O 666.3

62 Funkční glykomika Některé nemoci spojené s glykokonjugáty 1. Oslabení imunity díky infekčním chorobám, včetně AIDS; 2. Revmatická artritida (ovlivněno složení IgG a hladina MBP v séru mannose-binding protein); 3. Prionové choroby; 4. Vrozené choroby glykosylace (vzácné, poškození CNS); 5. Choroby ústní dutiny; 6. Cystická fibrosa; 7. Srdeční choroby; 8. Rakovina.

63 Mapování glykanů pro diagnostické účely