Ultrasenzitivní lektinové biosenzory pro včasnou detekci rakoviny prostaty

Rozměr: px

Začít zobrazení ze stránky:

Download "Ultrasenzitivní lektinové biosenzory pro včasnou detekci rakoviny prostaty"

Emil Bureš
před 7 lety
Počet zobrazení:

Interactive Conference of Young Scientists 2016 Ultrasenzitivní lektinové biosenzory pro včasnou detekci rakoviny prostaty Dominika Pihíková, Zuzana

1 Interactive Conference of Young Scientists 2016 Ultrasenzitivní lektinové biosenzory pro včasnou detekci rakoviny prostaty Dominika Pihíková, Zuzana Pakanová, Štefan Belický, Tomáš Bertók, Ján Mucha, Ján Tkáč Chemický ústav SAV, Dúbravská cesta 9, Bratislava , Slovensko

Rakovina prostaty Více než 600 000 nových případů ročně (celosvětově) 90 000 můžu ročně umírá Výskyt rakoviny (v %) Rakovina prostaty

Rakovina pankreasu Další Každé 2,3 min je diagnostikován nový případ rakoviny prostaty Průměrný věk, ve kterém je mužům diagnostikována

2 Rakovina prostaty Více než nových případů ročně (celosvětově) můžu ročně umírá Výskyt rakoviny (v %) Rakovina prostaty Rakovina plic Rakovina kolorekta Rakovina močového měchýře Non-Hodgkin lymphoma Rakovina kůže Rakovina jater Rakovina hltanu Leukémie Rakovina pankreasu Další Každé 2,3 min je diagnostikován nový případ rakoviny prostaty Průměrný věk, ve kterém je mužům diagnostikována rakovina prostaty je 66 let Výborná prognóza pacientů při včasné diagnóze MOVEMBER Celosvětová akce pro podporu pacientů s rakovinou prostaty

Počet vědeckých publikací Role glykanů v lidském těle Glykosylace = jedna z nejčastějších post-translačních modifikací proteinů Glykany = polysacharidy, které jsou kovalentně navázány na proteiny

3 Počet vědeckých publikací Role glykanů v lidském těle Glykosylace = jedna z nejčastějších post-translačních modifikací proteinů Glykany = polysacharidy, které jsou kovalentně navázány na proteiny nebo lipidy 70-80% proteinů v lidském těle jsou glykosylovány Glykany jsou součástí fyziologických i patologických procesů v lidském těle 1000 "Glycan" Host-patogenní interakce (virusy, bakterie) Stavební prvky Rozlišování krevních skupin Glykany Buněčná komunikace Ochrana buněk a proteinů Obr. 1 Zvyšující se počet publikací s klíčovým slovem glycan Obr. 2 Oligosacharidový obal HIV-1 trimeru zodpovídající za virovou nákazu (K. J. Doores, 2010, Proc Natl Acad Sci )

4 Glykosylace při patologických stavech Během různých onemocněních (rakovina, AIDS, revmatoidní artritida, aj.) nastávají změny a abnormality v glykosylaci Detekce glykanových změn = potenciální biomarker při včasné diagnostice onkologických onemocněních Mezi nejčastější abnormality v glykosylaci patří změny v obsahu/vazbě kyseliny sialové, fukózy nebo dochází k zvýšenému β-větvení glykanových struktur Obr. 3 Zaznačení nejčastějších glykanových změn při tumorigenezi; změny u kyseliny sialové, fukózy a zvýšené větvení oligosacharidů

5 Biosenzory a biočipy Lektiny = proteiny neimunitního původu, které dokáží s vysokou mírou specificity rozpoznávat a vázat sacharidové jednotky (ať už volné nebo vázané na glykoproteinech či glykolipidech) SNA lektin RCA lektin Con A lektin α-2,3-neu5ac Gal Man, Glc

6 -Z'' [Ω] Design experimentů Elektrochemická impedanční spektroskopie (EIS) Protilátka Blokovací činidlo Prostatický specifický antigen (PSA) Lektin Z' [Ω] Tvorba SAM vrstvy EDC/NHS imobilizace biomolekul na zlatý povrch elektrody

Glykoprofilace PSA elektrochemicky Klíčová optimalizace složení samo-uspořádané vrstvy (SAM) na zlaté elektrodě Optimální složení 1:3 (MUA:MCH) Dosažení velmi nízkého limitu detekce (4 am

7 Glykoprofilace PSA elektrochemicky Klíčová optimalizace složení samo-uspořádané vrstvy (SAM) na zlaté elektrodě Optimální složení 1:3 (MUA:MCH) Dosažení velmi nízkého limitu detekce (4 am koncentrace) MCH MUA Merkaptohexanol Merkaptoundekanová kys. Obr. 4 Kalibrační křivky pro analýzu PSA v závislosti na různém složení SAM vrstvy Glykoprofilace a kvantifikace PSA na povrchu zlaté elektrody Přítomnost α-2,6-sialové kyseliny (lektin SNA) Obr. 5 Odezva biosenzoru na lektin SNA (α-2,6-neu5ac) a na lektin MAA (α-2,3- Neu5Ac) Nepřítomnost α-2,3-sialové kyseliny (lektin MAA)

8 -Z' [Ω] ΔR ct after SNA [%] -Z'' [Ω] Redukce nespecifických interakcí no block 0.8% gelatin % Tween 1M ETA 0.1% gelatin CF buffer 8,E+03 6,E+03 4,E+03 2,E+03 A SAM+Ab SAM+Ab+SNA 15-5 Anti-PSA + blokovací činidlo + SNA Obr. 6 Účinnost různých blokovacích činidel při sledování nespecifických interakcí SNA lektinu na povrch imunosenzoru Porovnání 4 blokovacích činidel (0.8% želatina % Tween; 1M etanolamin; 0.1% želatina; carbo-free (CF) blokovací činidlo Snížení nespecifických interakcí SNA lektinu na povrch biosenzoru s imobilizovanou anti-psa Nejlepší blokovací schopnosti vykazoval carbo-free pufr (CF-buffer) použití v dalších experimentech 0,E+00 0,E+00 3,E+03 6,E+03 9,E+03 1,E+04 2,E+04 2,E+04 1,E+04 8,E+03 4,E+03 B Z' [Ω] SAM+Ab SAM+Ab+CF buffer SAM+Ab+CF buffer+sna 0,E+00 0,E+00 5,E+03 1,E+04 2,E+04 Z' [Ω] 2,E+04 3,E+04 Obr. 7 (A) Nespecifické interakce SNA lektinu na povrch imunosenzoru bez použití blokovacího činidlo, (B) Redukce nespecifických interakcí SNA lektinu na povrch imunosenzoru za použití carbo-free blokovacího činidla

Workflow analýzy MALDI TOF/TOF Enzymatické uvolnění N-glykanů z glykoproteinu PSA purifikace a izolace N-glykanů MALDI-TOF/TOF analýza (interpretace dat, hledání glykanových struktur u PSA) rozlišení

9 Workflow analýzy MALDI TOF/TOF Enzymatické uvolnění N-glykanů z glykoproteinu PSA purifikace a izolace N-glykanů MALDI-TOF/TOF analýza (interpretace dat, hledání glykanových struktur u PSA) rozlišení glykosidické vazby u kyseliny sialové Potvrzení α-2,6-sialové kyseliny na povrchu PSA pomocí hmotnostní spektroskopie (derivatizace kyseliny sialové pomocí EDC/HOBt) Proteolytické štěpení trypsinem, redukce a alkylace Získávání glykopeptidů (anion exchange chromatography) Uvolnění N-glykanů pomocí PNGaseF Separace N-glykanů od peptidů α-2,6-neu5ac α-2,3-neu5ac Rozlišení glykosidické vazby u kyseliny sialové (EDC/HOBt) MALDI TOF/TOF analýza, interpretace dat, hledání glykanových struktur Purifikace N-glykanů (npgc, C18)

Rozlišení vazby kyseliny sialové (MS) Princip rozlišení vazby kyseliny sialové (EDC/HOBt): α-2,6-sialová kyselina přírůstek 28 Da (ester) α-2,3-sialová kyselina úbytek 18 Da (cyklický lakton) Obr.

10 Rozlišení vazby kyseliny sialové (MS) Princip rozlišení vazby kyseliny sialové (EDC/HOBt): α-2,6-sialová kyselina přírůstek 28 Da (ester) α-2,3-sialová kyselina úbytek 18 Da (cyklický lakton) Obr. 8 Schéma derivatizace kyseliny sialové pomocí EDC/HOBt; (A) Ethyl-esterifikace α-2,6-sialové kyseliny za vzniku esteru (přírůstek 28 Da v spektru), (B) laktonizace α-2,3-sialové kyseliny za vzniku cyklického laktonu (úbytek 18 Da ve spektru) Obr. 9 - (A) Přírůstek 28 Da ve spektru způsobený ethyl-esterifikací reprezentativního ((Hex)2(HexNAc)2(Deoxyhexose)1 (Neu5Ac)1 + (Man)3(GlcNAc)2) N-glykanu, (B) MALDI TOF/TOF (LIFT) spektrum tohoto glykanu po EDC/HOBt derivatizaci dokazující α-2,6-neu5ac

11 Z axis [nm] Mikroskopie atomárních sil (AFM) 12,5 10 7,5 5 2,5 0-2,5 PSA 1 PSA 2 PSA 3 PSA-Ab 1 PSA-Ab 2 PSA-Ab X axis [nm] Obr. 10 Velikost PSA glykoproteinu a komplexu PSA-Ab na základě AFM experimentů Analýza povrchů biosenzorů pomocí AFM Průměrná výška imobilizovaných protilátek (8,8 ± 0,9) nm PSA-Ab komplex (10 ± 1)nm; individuální imobilizované PSA (4,1 ± 0,5) nm

R ct after lecitn [%] Glykoprofilace reálných vzorků od pacientů 65 55 45 35 25 15 5 Lektinový imunosensor v analýze lidských sér (depletovaných od IgG a HSA) pomocí elektrochemické impedanční

12 R ct after lecitn [%] Glykoprofilace reálných vzorků od pacientů Lektinový imunosensor v analýze lidských sér (depletovaných od IgG a HSA) pomocí elektrochemické impedanční spektroskopie (EIS) Pacienti s diagnostikovanou rakovinou prostaty (PCa) mají mnohem vyšší podíl α-2,3-sialové kyseliny v porovnání se zdravými jedinci Ověřena specificita biosenzoru s negativními kontrolami (lidský sérový albumin HSA, lidský kalikrein2 hk2) -5 MAA SNA Obr. 11 Rozdílné elektrochemické odezvy (Rct) na lektiny MAA,SNA u zdravých jedinců a pacientů s rakovinou prostaty Lektin (MAA,SNA) PSA z lidského séra Carbo-free blokovací činidlo Anti-PSA protilátka SAM vrstva Obr. 12 Schéma imunosenzoru při glykoprofilaci PSA z lidských sér Obr. 13 Ověření specificity imunosensoru (pacienti s PCa, zdraví jedinci, lidský sérový albumin, lidský kalikren2)

13 Závěr V této práci byly připraveny lektinové imunosensory, které detekčních limitů (až 4 am koncentrace) dosahují velmi nízkých Byla zkoumána efektivita 4 blokovacích činidel, přičemž nejlepší schopnost snižovat nespecifické interakce měl carbo-free pufr Lektiny byly schopny rozlišit vazbu kyseliny sialové, která hraje v těle velmi důležitou roli Pomocí bioanalytických metod (MALDI TOF/TOF) jsme potvrdili vazbu kyseliny sialové Námi navržené biosenzory byly využity pro glykoprofilaci PSA z lidských sér (pacienti s rakovinou prostaty a zdraví jedinci) Bylo zjištěno, že pacienti s rakovinou prostaty mají mnohem větší podíl α-2,3-vázané kyseliny sialové na povrchu PSA než zdraví jedinci Změny glykosidické vazby u kyseliny sialové by mohly sloužit jako nový glykobiomarker rakoviny prostaty Tato studie může zvýšit citlivost a specificitu biomarkerů používaných v diagnostice onkologických onemocnění

14 Poděkování Tato práce je financována v rámci projektu National Priorities Research Program (Qatar National Research Fund), č. projektu NPRP Speciální poděkování: Ing. Ján Tkáč, DrSc. Spolupracovníci z oddělení glykobiotechnologie, Chemický ústav SAV Spolupracovníci z Centra excelence pro glykomiku, Chemický ústav SAV Oddělení biotechnologie, FCHPT STU

Podobné dokumenty

Magnetické částice, izolace a detekce chřipky (hemaglutininu)

Název: Magnetické částice, izolace a detekce chřipky (hemaglutininu) Školitel: Ludmila Krejčová, MVDr. Datum: 7.11. 2013 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 Název projektu: Partnerská síť centra excelentního