Buněčná a humorální odpověď u hlubokých pyodermií psů a reakce na terapii MVDr. František Špruček Školitel: prof. MVDr. Miroslav Svoboda, CSc. Školitel-specialista: prof. MVDr. Miroslav Toman, CSc.
Úvod Hluboká pyodermie (HP) psů Syndrom různé, neznámé a nejasné primární etiopatogeneze (idiopatické) s následným pomnožením bakterií jako sekundární příčiny klinického projevu HP Staphylococcus intermedius Staphylococcus aureus Staphylococcus hyicus Staphylococcus schleiferi Predispoziční faktory prostředí (teplota, vlhkost), trauma, anatomie (oblast kůže), plemenná predispozice apod.
Příčiny hlubokých pyodermií Primární příčiny hlubokých pyodermií imunologické (imunodeficience, autoimunitní, alergie ) metabolické (Zn, vitamin A, nenasycené masné kyseiny) endokrinologické (hypothyteóza, hyperadrenokorticizmus diabetes mellitus) parazitologické (demodex, svrab apod.) idiopatické Sekundární příčiny (klinický projev) oportunní bakterie při oslabení imunity podmíněně patogenní a patogenní bakterie nosokomiální bakterie kombinace všech typů Vzájemná kombinace primárních příčin s klinickým sekundárním projevem
Imunodermatologie Epidermis keratinocyty (IL-1, -6, -10, TGF-β, TNF) Langerhansovy buňky (ACP) dentritické buňky (DC) inraepiteliální T-lymfocyty (TCRγδ CD3+ CD4-CD8-) melanocyty bakterie kožního povrchu (komenzální, rezidentní, tranzientní, nomádní) Dermis fibroblasty (kolagen I. a III. typu) epidermální struktury (chlupové folikuly, potní a mazové žlázy apod.) T-lymfocyty paměťové (CD45RA+ ) žírné buňky makrofágy
Klinické projevy HP Porušení stratum basale a hlubších vrstev dermis a subcutis granulom Absces absces hluboká folikulitis furunkulosis celulitis (panikulitis)
Složky specifické a nespecifické imunity Imunita Buňky (buněčná) Molekuly (humorální) Nespecifická NK buňky Dendritické buňky Žírné buňky (mastocyty) Fagocyty - neutrofily - monocyty (makrofág) - eosinofily - basofily Komplement Proteiny akutní fáze Interferony Přirozené protilátky (IgM) Specifická T-lymfocyty (Th, Tc, Tr,Ts) B-lymfocyty (plazmatické b.) Cytokiny Protilátky IgG, IgM, IgA, IgE, IgD Přechod mezi spec. a nespecifickou buněčnou imunitou - γδt-lymfocyty
Reakce imunitního systému 1. Fyziologická zánět jako obranný fenomén akutní zánět odstranění příčiny odstranění poškozených tkání obnovení původního stavu 2. Patologická zánět jako autoagresivní fenomén chronický zánět nepřiměřený, opakující se patologický podnět imunodeficit zánět jalo důsledek imunopatologické reakce alergie (atopie) autoimunita odhojení (rejekce) transplantované tkáně
Poruchy imunity Imunodeficitní onemocnění primární (vrozené) deficity protilátek (50%) kombinované poruchy buněčné a protilátkové imunity (20%) poruchy fagocyzózy (18%) poruchy buněčné imunity (10%) deficity komplementu (2%) sekundární (získané) napadení imunokompetentních buněk 4. Autoimunitní systémová autoimunitní onemocnění (SLE) orgánově specifická onemocnění Alergie a atopie
Odpověď imunitního systému humorální protilátka a Ag inhibice fce, neutralizace, nemá vliv protilátka a Ag + C1q lýza, perforace buňky protilátka a Ag + C1q + makrofág, neutrofil Fagocytóza protilátka a Ag + C FDC B-lymfocyty (sig) buněčná Ag + buňka (MHC I) Tc Ag (baktrie) + MF (MHC II), Th1 (DC4 TCR) Fagocytóza Ag + C, Protilátka opsonizace + MB (histiocyty, baso; žírné b.) trombo; neu; eos; + Mono, Mf, Gran Fagocytóza NK + buňka MHC I cytotoxická lýza NK + (Ag - Protilátka ) ADCC lýza perforiny - cytolýza
Rozdíly Th1 a Th2 odpovědi Th1 vyvolávající cykokin IL-12 Th2 IL-4 produkované cytokiny IL-2, IFNγ IL-4, 5, 6, 10 aktivující cytokiny IL-4 inhibující cytokiny IL-2 IL-10 IFNγ převažující odpověď buněčná - protilátková ovlivňuje buňky - makrofágy - žírné b., eozinofily při infekci - intracelulární - extracelulární hypersenzitivita IV. typ I. typ
Cíle práce Klinické vyhodnocení imunologických parametrů Posouzení humorální a buněčné odpovědi před, v průběhu a po ukončení léčby Individuální posouzení atypických případů Vyhodnocení terapeutického účinku imunomodulátorů Identifikace potenciálních diagnostických markerů ve vztahu k primární příčině
Materiál a metody Celkový a diferencální rozpočet leukocytů Populace a subpopulace lymfocytů průtoková cytometrie Test fagocytární aktivity Funkční test fagocytů chemiluminiscence Funkční test lymfocytů test blastické transformace Celková hladina imunoglobulinů Stanovení cirkulujících imunokomplexů Stanovení lysozymu - fotometricky
Výsledky Sledování imunologických parametrů před zahájením léčby dynamika imunitní odpovědi v průběhu terapie terapie pyodermie antibiotiky a imunomodulátory Foto: Špruček Foto: Špruček
P = 0,041 28 24 20 MONOCYTY (%) NEUTROFILY (%) 32 pyodermie kontroly 5,0 4,0 3,0 75 65 60 8 kontroly pyodermie kontroly 7 6 5 4 3 pyodermie P = 0,015 70 55 EOZINOFILY (%) LYMFOCYTY (%) Počty leukocytů (%) pyodermie kontroly U psů s HP (n=25) v porovnání s kontrolami (n=10)
Počty leukocytů (106/l) LYMFOCYTY 106/l 3500 P = 0,029 3000 2500 2000 pyodermie EOZINOFILY 106/l MONOCYTY 106/l 600 400 pyodermie kontroly 10000 8000 6000 4000 kontroly 800 200 NEUTROFILY 106/l 12000 4000 pydermie kontroly pyodermie kontroly 700 500 300
Výsledky buněčné imunity (abs. 106/l; rel. %) P = 0,029; P = 0,041 Lymfocyty Neutrofily (relativní %) P = 0,015 T-lymfocyty (CD3+) (relativní %) P = 0,0025 Tc-lymfocyty (CD8+) (relativní %) P = 0,041 B-lymfocyty (CD21+) (relativní %) P = 0,011 Th-lymfocyty (CD4+) (relativní %)* P = 0,048 * Skupina psů (n = 9) léčena glukokortikoidy (4-6 týdnů před odběrem)
Počty lymfocytů (%) B-Lymfocyty CD 21+ P = 0,011 30 P = 0,0025 P = 0,041 0,4 70 25 0,3 60 20 15 80 Tc-lymfocyty CD8+ 0,5 90 40 35 T-lymfocyty CD3+ pyodermie kontroly 50 0,2 pyodermie kontroly pyodermie kontroly
Funkční testy fagocytů Chemiluminiscenční test Fagocytóza neutrofilů
Funkční testy lymfocytů Snížená aktivita lymfocytů v testu blastické transformace Nestimulované lymfocyty - (P = 0,042) Stimulované lymfocyty s PHA - (P = 0,018) Stimulované lymfocyty s ConA - (P = 0,0049) Stimulované lymfocyty s PWM - (P = 0,015)
Humorální odpovědi 60 CIK (P = 0,005) Interakce CIK s věkem (P = 0,014) 80 CIK (ARAB. J.) CIK (ARAB. J.) 50 40 30 20 60 40 20 0 10 pyodermie kontroly 1 2 3 4 5 6 7 8 stáří psů - roky 9 10
Dynamika imunitní odpovědi T-lymfocyty CD3+ Th-lymfocyty CD4+ 5000 3000 1200 3000 2000 2000 počet buněk počet buněk 4000 počet buněk Tc-lymfocyty CD8+ 1000 800 400 1000 0 I. II. intervaly odběru III. 0 I. II. intervaly odběru III. I. II. III. intervaly odběru Skupina psů s HP (n = 9) před, v průběhu a po ukončení léčby
Dynamika imunitní odpovědi γδ -TCR-lymfocyty NK-lymfocyty DC3-8+ 6000 400 40 20 300 počet buněk počet buněk počet buněk 60 200 100 0 II. intervaly odběru III. 4000 2000 0 0 I. B-lymfocyty CD21+ I. II. intervaly odběru III. I. II. intervaly odběru Skupina psů s HP (n = 9) před, v průběhu a po ukončení léčby III.
Klinické změny před zahájením léčby -> -> 1 po léčbě Synuloxem 12,5 mg.kg-1 2x denně p.o. (14 dní) Foto: Špruček 2 recidiva za 2 měsíce od začátku léčby -> 3
Klinické změny po léčbě glukokortikoidy Prednison 3 mg.kg-1 1x denně p.o. (14 dní) -> -> 4 5 týdnů od zahájení léčby Ceporex 30 mg.kg-1 1x denně p. o. a Baypamune 1 amp. pro toto 1x týdně Foto: Špruček B 5 za 10 týdnů od zahájení léčby -> Sus. Autoimunitní onemocnění (primární příčina) syndrom hluboké pyodermie 6C
Imunologické změny 1 Masivní kurstózní léze s četnými fisurami a erozemi s erytematózním ohraničením (kříženec, M, 4 roky) Foto: Špruček 1. Lymf. 2,1.10-9/l CD4(%)-52 CD8-12 CD21-19 NK-0,1 2. Lymf. 0,9.10-9/l CD4(%)-50 CD8-11 CD21-30 NK-0,9 IRI-4,5 3. Lymf. 1,9.10-9/l CD4(%)-55 CD8-17 CD21-20 NK-1,1 Sus.imunodeficience IRI-4,3 IRI-3,2
Imunologické změny 2 Masivní sepiginózně ohraničená nekrotická ložiska dermis s hyperpigmentací s supurací (boxer, F, 9 roků) Foto: Špruček 1. Lymf. 1,6.10-9/l CD4(%)-41 CD8-16 CD21-33 2. Lymf. 7,4.10-9/l CD4(%)-13 CD8-5 CD21-77 3. Lymf. 2,2.10-9/l CD4(%)-46 CD8-18 CD21-23 Sus. Imunosuprese po glukokortikoidech NK-0,0 IRI-2,5 NK-0,1 IRI-2,6 NK-0,6 IRI-2,5
Imunologické změny 3 Alopetické ložisko, lichenifikace s hyperpigmentací a disfuzními exsudativními (supurativními) pustulózními změnami (kříženec, M, 10 roků) Foto: Špruček 1. Lymf. 1,7.10-9/l CD4(%)-47 CD8-38 CD21-5 NK-0,1 2. Lymf. 4,1.10-9/l CD4(%)-22 CD8-7 IRI-1,2 CD21-65 NK-0,2 IRI-3,1 3. Lymf. 3,2.10-9/l CD4(%)-54 CD8-19 CD21-16 NK-0,2 IRI-2,8
Leukocyty Neutrofily Fagocytóza Chl. aktiv (%) Neutrofily (%) Monocyty Monocyty (%) Chl. spont B (MV) B-lymfocyty (CD21+) (%) Lymfocyty T-lymfocyty (CD3+) T-h (CD4+) BLT klidov (CPM) PHA (CPM) ConA 2 (CPM) ConA 1 (CPM) PWM (CPM) Lymfocyty (%) T-cytotoxick (CD8+) T-lymfocyty (CD3+) (%) Fagocytóza Ig (g/l) Lysozym (g/l) B-lymfocyty (CD21+) PHA (SI) ConA 1 (SI) ConA 2 (SI) CB (g/l) Gd-TCR + (%) Gd-TCR + Eosinofily Eosinofily (%) DP-buňky (CD4+8+) (%) DP-buňky (CD4+8+) PWM 1 (SI) NK-buňky (CD3-8+) (%) NK-buňky (CD3-8+) SIM (SI) SII (SI) T-helpery (CD4+) (%) CIK (jednotky) T-cytotoxick (CD8+) (%) T/B (CD3+/21+) (%) T/B (CD3+/21+) Shluková analýza Kříženec (M,4) Americký korkšpaněl (M,9) Boxer (F,9) Zlatý retrívr (M, 2) Anglický buldog (M, 3) Labrador retrívr (M, 8) Rhodészký ridgebeg (M, 6) Labrador retrívr (F, 8) Kříženec (M, 10) 100% 100% 50% 25% 50% % podobnosti
Terapie 100 (n =11) (n =8) (n =10) (n = 29) Vyléčeni psi (%) 80 60 40 20 0 a b a b a b a b první výskyt HP Recidiva recidiva pyodermie Cefalexin Cefalexin Cefalexin + Baypamune celkem (a) % vyléčených psů s hlubokou pyodermií po ukončení terapie za 10 týdnů (b) % vyléčených psů po ukončení léčby za 8 týdnů (snížené o recidivy)
Vyhodnocení terapie Psi s recidivou se vyléčili o 14 dní později - 10,5 týdne, než psi s prvním výskytem HP - 8,4 týdne (P < 0,001) Dřívější vymizení pruritu indikovalo kratší dobu léčby (P = 0,004) Délka léčby u samců 9,8 týdne a u samic 9,4 týdne. (P = 0,51) Délka srsti a % postižené plochy kůže neprokázala vliv na délku léčby (P = 0,79) Hmotnost zvířete neměla vliv na délku léčby (P = 0,19) Vyšší hladiny subpopulací Tc-lymfocytů s CD8+ měly tendenci být asociovány s kratší dobou léčby (P = 0,08) Nebyl zjištěn statisticky významný efekt věku na délku léčby (P = 0,64) Nebyl zjištěn statisticky významný efekt topické léčby (šampony) na dobu léčby
Souhrn a závěr Signifikantní snížení abs. a rel. hodnot lymfocytů a zvýšení rel. zastoupení neutrofilů Signifikantní zvýšení rel. zastoupení CD3+ T-lymfocytů subpopulace CD8+ Tc-lymfocytů Snížení relativního zastoupení CD21+ B-lymfocytů Psi léčení glukokortikoidy (4 6 týdnů) před zahájením léčby vykazovali signifikantní pokles CD4+ Th-lymfocytů Dynamika individuální imunitní odpovědi byla nekonzistentní, což naznačuje nejednotnou etiologii onemocnění V testu blastické transformace byla signifikantně snížená aktivita nestimulovaných lymfocytů a snížená odpověď lymfocytů na stimulaci PHA, ConA a PWM
Souhrn a závěr Neprokázala se zvýšená hladina CIK s výskytem HP. Statisticky významná klesající tendence byla prokázána v souvislosti s věkem CIK byly podmíněny věkem zvířat, tato závislost byla odlišná u zdravých se zvyšujícím se věkem psů, u nemocných jedinců byly hodnoty CIK nízké u všech věkových tříd. Odlišné hodnoty proto platí pouze pro mladé věkové kategorie Při léčbě imunomodulátorem (Baypamune) v kombinaci s antibiotiky (Ceporex) došlo ke snížení počtu recidiv u rekurentních HP Nebyly signifikantně prokázány vlivy pohlaví, věku, celkového postižení povrchu těla, pruritu, počtu zánětlivých lézí apod. na imunitní systém
Poděkování Chtěl bych poděkovat prof. MVDr. Miroslavu Svobodovi, CSc. za odborné vedení práce prof. MVDr. Miroslavu Tomanovi, CSc. MVDr. Martinu Faldynovi, Ph.D. za cenné rady a připomínky prof. MVDr. Emilu Tkadlecovi, CSc. za technickou podporu a statistické zpracování ing. Lence Levé za vyšetření vzorků Danu Špručkovi za pomoc při zpracování materiálů k disertační práci.
Děkuji za pozornost