OPVK CZ.1.07/2.2.00/28.0184
Základy ADME a toxického hodnocení léčiv v preklinickém vývoji OCH/ADME LS 2012/2013
Fyziologické bariéry distribuce PharmDr. Lucie Stejskalová, PhD
Biologické bariéry Ochrana citlivých tkání (mozek,plod, ) Funkční a mechanická složka (transportéry/enzymy) Hematoencefalická bariéra Hematolikvorová bariéra Likvoroencefalická bariéra Placentární bariéra Hematotestikulární bariéra
Opakování Nejdůležitější mechanizmy transportu léčiv přes biologické membrány: Pasivní difúze Prostup membránovými póry Facilitovaná difúze Aktivní transport Pinocytóza Endocytóza a exocytóza
Fyziologické bariéry specifické uspořádání kapilár a epitelií v některých orgánech, které má omezit distribuci látek do těchto tkání z centrálního kompartmentu a zároveň zachovávat stálé vnitřní prostředí v orgánu regulace přestupu endogenních látek omezení distribuce léčiv a jiných xenobiotik
Kapilární přestup Typy kapilár dle uspořádání endotelu: kontinuální (somatické) fenestrované (viscerální) diskontinuální (sinusoidální)
Kontinuální kapiláry: nervové tkáni, svalstvo, vazivo, HEB HEB -endotelie těchto kapilár jsou spojeny zonula occludens neboli tzv. tight junctions, které prakticky vylučují paracelulární přestup látek hlavním typem přestupu makromolekul pinocytóza Gap junction- ve svalstvu příčpr., srd. i hladkém
Fenestrované kapiláry: střevní mukóza, endokrinní žlázy, placenta, chorioideální plexus aj. obsahují zeslabení cytoplazmy, tzv. fenestrace, které jsou uzavřeny přepážkou (diafragmou) tvořenou plazmatickou membránou umožňují snazší přestup i pro větší molekuly specifickým typem těchto kapilár jsou kapiláry ledvinných glomerulů; fenestrace v tomto případě ztrácí diafragmu a jsou volně otevřené transepiteliálnímu transportu
Diskontinuální kapiláry: řada jiných orgánů např. játra postrádají souvislou bazální membránu přestup přes tyto póry se označuje jako bulk flow hnací silou přestupu je hydrostatický tlak krve
Hematoencefalická bariéra centrální nervový systém je izolován od ostatního vnitřního prostředí lidského těla hematoencefalickou bariérou (HEB), která zajišťuje stálé prostředí pro CNS z hlediska iontového složení, acidobazické rovnováhy a přísunu energie HEB: endotelové buňky mozkových kapilár (typ A), spojené tight junctions), omezená pinocytická, exo- a endocytická aktivita bazální membrána mozkových kapilár astrocytární výběžky (pedikly) neurogliových buněk astrocytů - velmi těsně přiléhají k endoteliím mozkových kapilár i k sobě navzájem
navíc přítomnost enzymů (monooxygenáza, acetylcholinesteráza) biotransformace někt. hormonů cirkumventrikulární oblasti mozku (oblasti kolem 3. a 4. mozkové komory, např. area postrema) - nechráněny HEB přítomnost fenestrací a gap junction v endotelu kapilár u dětí není HEB ještě zcela vyvinuta, hydrofilní léčiva pronikají do CNS a mohou způsobovat některé nežádoucí účinky (např. morfin, loperamid) meningitida a encefalitida zvyšuje permeabilitu mozkových kapilár v důsledku zánětu (např. penicilinová antibiotika)
transport přes HEB: prostá difúze (lipofilní látky, plyny) facilitovaná difúze (glukóza) aktivní transport, opačným směrem (hydrofilní produkty metabolismu) vysokomolekulární látky téměř neprostupují přes HEB hydrofilní xenobiotika, ionizovaná léčiva a jejich metabolity prostupují touto bariérou velmi obtížně vysoce lipofilní léčiva s malou molekulovou hmotností se distribuují do CNS snadno (např. celková anestetika, Et-OH)
Hematolikvorová bariéra likvor - čirá bezbarvá tekutina, zajišťuje stálé vnitřní prostředí pro mozek a míchu, poskytuje mechanickou ochranu CNS vyplňuje mozkové komory, centrální kanál ve spinální míše a subarachnoideální prostor tvoří se konstantní rychlostí ve specializovaných orgánech plexus chorioideus v mozkových komorách z postranních komor odtéká do III. komory, odtud přes aquaeductus cerebri do IV. komory, ze IV. komory dále proudí do subarachnoideálního prostoru obklopující mozek a míchu, absorbuje se do venózního systému prostřednictvím villi arachnoidales
bariéra se nachází v oblasti plexus chorioideus kapiláry jsou fenestrovaného typu, epiteliální buňky kryjící plexus chorioideus vytváří tight junctions transport: prostá difúze (lipofilní látky) aktivní transport (ionty, glukóza)
Likvoroencefalická bariéra její existence se předpokládá na základě poznatků o distribuci některých látek mezi likvorem a CNS, morfologické uspořádání je však diskutabilní mozkové komory a centrální kanál ve spinální míše jsou vystlány epitelem složeným z neurogliových ependymálních buněk, které však netvoří těsné spoje složení likvoru a EC tekutiny mozku a míchy je stejné, v podstatě se o bariéru nejedná
Placentární bariéra strukturálně funkční bariéra, která brání mísení fetální a mateřské krve v placentě, umožňuje přestup někt. látek mezi oběma krevními oběhy Lidská placenta: hemochoriálního (krev matky omývá trofoblast) Placentární bariéra je tedy tvořena výhradně tkání fetálního původu - tj. trofoblastem, pojivovou tkání a endotelem kapilár Plně vzrostlá placenta člověka dosahuje průměru 20 cm a hmotnosti až 0,5 kg Postupné ztenčování placenty během těhotenství
funkce placenty: fetální plíce probíhá zde difúze O2 a eliminace CO2 mezi matkou a plodem fetální játra buňky trofoblastu, přes které látky přecházejí do plodu, obsahují cytochrom P450 a další enzymy schopné částečné biotransformace léčiv fetální ledviny placenta se podílí na eliminaci látek z plodu fetální střevo placentou se dostávají živiny do fetální cirkulace imunologická obrana (mateřské imunoglobuliny, ochrana před infekcí) komplexní endokrinní orgán (choriogonadotropin, progesteron, somatotropin, estriol )
Placenta vývoj začíná po uhnízdění blastocysty v endometriu dělohy deciduální reakce přeměna vazivových b. endometria ve velké deciduální b. (obs. glykogen a kapénky lipidů), zmnožení kapilár v okolí blastocysty stěna blastocysty (trofoblast) diferenciace v cytotrofoblast (vnitřní) a syncytiotrofaoblast (vnější)
Primární choriové klky Sekundární choriové klky
syncytiotrofoblast výběžky do děložní sliznice (proteolytické enzymy) cytotrofoblast penetruje do syncytiotrofoblastu, vytváří primární choriové klky Primární choriové klky vz. 2. týden po implantaci syncytiotrofoblastu sekundární choriové klky vz. prorůstáním extraemryonálního mezodermu terciární choriové klky obsahují krevní kapiláry fetálního oběhu (umbilikální véna (1) a artérie (2))
Placenta vzniká spojením: 1) chorion frondosum tvoří pars fetalis placentae (fetální část) 2) decidua basalis tvoří pars materna placentae (mateřská část) fetální část placenty: epitel amnia (vnitřní plodový obal), choriová ploténka (vnější plodový obal), choriové klky, cytotrofoblast, syncytiotrofoblast maternální část placenty: decidua basalis (endometrium pod zárodkem), placentární septa na povrch trofoblastového obalu ústí arterie, ze kterých je pulsatilně vstřikována mateřská krev do intervilózního prostoru, odváděna je do děložních žil
Placentární bariéra (přestup látek matka->plod): vrstva syncytiotrofoblastu (mnohojaderné soubunní vzniklé splynutím buněk, vlastní bariéra v užším slova smyslu) vrstva cytotrofoblastu (od poloviny těhotenství pouze jako nesouvislá vrstva) bazální membrána trofoblastu (není výraznější překážkou ani pro velké molekuly) fetální mezenchym bazální membrána endotelu fetálních kapilár (nepravidelný výskyt pojivové tkáně) endotelové buňky fetálních kapilár (není dokonale spojen těsnými spoji a obsahuje fenestrace)
transportní mechanismy v placentě: pasivní difúze (lipofilní látky) facilitovaná difúze (glukóza) aktivní transport (AMK, vit. B 12 ) endocytóza (Ig) Efluxní transportéry (BCRP, Pgp) lipofilní látky (např. thiopental) pronikají přes placentu snadno, stejně tak hydrofilní látky o velikosti do 600 Da slabě bazické látky se kumulují v plodu (ph 7,3) (např. aminopenicilin)
Prostup látek přes placentu důležitý: řada látek má tendenci vyvolávat vrozené anomálie, ovlivnit orgánové funkce plodu Placentární bariera nechrání plod před působením všech léčiv Plod je v určitém rozsahu vystaven působením prakticky všech LČ Propustnost placentární bariéry vyšší než u hematoencefalické bariery. Významnou roli v transplacentárním přenosu hraje i stupeň vývoje placenty V placentě transportéry léčiv - přenos LČ do fetální cirkulace (molekuly velké hmotnosti - protilátky matky, včetně protilátek při Rh inkompatibilite) Pgp přenáší zpět do mateřské cirkulace řadu léčiv (cytostatika). Blokace transportu vede k hromadění látek ve fetálním oběhu.
Poškození plodu xenobiotiky je možné po celou dobu jeho vývoje Kritické období pro působeni xenobiotik je období organogeneze (3-16 týden) tj. první trimestr těhotenství. V období vývoje orgánů plodu mohou xenobiotika vyvolat malformace-teratogenní poškození plodu. Typ malformace závisí na době a intenzitě expozici plodu teratogenu. V 2. a 3. trimestru, v období fetálního vývoje, xenobiotika nevyvolávají morfologické malformace, ale mohou působit toxicky na tkáně plodu a ovlivnit tak například jejich růst a funkční vývoj.
Podle FDA - klasifikace léčiv do 5 skupin rizik A: kontrolované studie u těhotných neprokázaly riziko pro plod v prvním trimestru B: studie na zvířatech neprokázaly riziko pro plod, kontrolované studie u těhotných nebyly provedeny C: prokázaná teratogenita nebo embryotoxicita u zvířat, nebyly provedeny kontrolované studie u žen D: existují doklady rizika pro lidsky plod (v těhotenství je lze užít jen v kritických život ohrožujících stavech a závažných onemocněních tam, kde nelze užít lék bezpečnějši X: riziko jednoznačně převažuje nad prospěchem
Perinatální farmakologie: cílovým místem působení není matka ale plod Př.: Kortikoidy - indukce vývoje plic plodu při předčasném porodu Antivirotika - snížení přenosu HIV na plod u pozitivních matek
Hematotestikulární bariéra chrání zárodečný epitel a jednotlivá stádia spermatogeneze před toxickými látkami obsaženými v krvi a zároveň vytváří imunologickou bariéru kapiláry snadno prostupné bariéra je tvořena pevnými spojeními v oblasti baze Sertoliho buněk v semenotvorných kanálcích varlat brání přestupu hydrofilních látek, lipofilní prostupují snadno prostou difúzí další funkcí bariéry je udržování stálého složení tekutiny uvnitř semenotvorných kanálků
Hematotestikulární bariéra
Při poruše hematotestikulární bariéry (úrazy nebo punkce varlat, záněty, nádorová onemocnění, AIDS apod.) dochází ke kontaktu povrchových epitopů spermií s imunokompetentními buňkami, které produkují příslušnou protilátku. Tyto protilátky se naváží na povrch spermie, a způsobí tak jejich aglutinaci nebo imobilizaci či cytotoxicitu
Metody studia in vitro in vivo in silico
Metody studia placentární bariéry In vivo: zvířecí modely (myš, potkan) In situ: perfundovaná lidská placenta perfundovaná zvířecí placenta perfundovaný placentární kotyledon In vitro: placentární mikrozomy/membránové vezikuly kultura primárních trofoblastů kultura maligního trofoblastu (BeWo, JEG-3, JAR) potkaní placentární buňky (HRP-1) placentární explanty
In vivo metody: potkan, myš (při využití zvířecího modelu je potřeba brát ohled na anatomické a funkční odlišnosti) Potkan: délka březosti 21 dní, placenta je hemotrichoriálního typu (obsahuje tři vrstvy trofoblastu). U vyvinuté placenty potkana lze rozlišit dvě morfologicky odlišné vrstvy - labyrint a spongiotrofoblast Myš: hemotrichoriální typ placenty
In vitro metody: Primární kultura lidského trofoblastu: odvozena přímo z placentární tkáně a svými vlastnostmi se nejvíce blíží placentárnímu syncytiotrofoblastu. Během kultivace dochází vzájemnému splývání a přeměně na syncytiotrofoblast (syncitium). Mají nízkou životaschopnost (asi 1 týden) a kultura může být kontaminována i jinými typy buněk (fibroblasty)
Placentární nádorová linie (JEG-3, BeWo, JAR): obdobné vlastnosti jako syncytiotrofoblast (Př.: zachování tvorby hormonu hcg, laktogenu, progesteronu, estrogenů.. ) Buňky mají morfologické vlastnosti a expresi biochemických markerů podobných trofoblastu. Používají se například ke studiu metabolismu buněk a transportních vlastností.
Placentrání mikrosomy pro přeměnu xenobiotik má největší význam systém lokalizovaný v endoplazmatickém retikulu buněk při homogenizaci buněk se endoplazmatické retikulum rozpadá a vytváří frakci složenou z měchýřků, které jsou fragmenty membrán této buněčné složky. Tato frakce se označuje jako mikrosomy. Mikrosomální frakce lze získat z homogenátu buněk po odstranění těžších složek (jader, mitochondríí, lysozomů) Klíčová úloha v systému: P-450
Perfundovaná placenta Placenta je relativně málo diferencovaný orgán, a jako takový má nízké požadavky na kyslík. Proto může přežívat i několik hodin po porodu za pokojové teploty a při opětovné umělé reperfúzi se bezprostředně projeví příznaky "života" jako jsou utilizace glukozy a produkce ATP. Neobvyklá vitalita placenty se využívá v experimentální farmakologii pro studium transplacentárního průniku látek na in situ perfundované placentě.
Metody studia hematoencefalické bariéry (Blood Brain Barrier) In silico model BBB: počítačové programování In vitro model BBB používaní různých typů epitelových nebo endotelových buněk necerebrálního původu často používané buňky MDCK (Madin-Darby canine kidney) MDCK buňky mají dobrou paracelulární permeabilitu. Nicméně, tam jsou velké rozdíly mezi MDCK a endoteliálními buňkami v mozku
další buněčné kultury HUVEC (Human umbilical endothelial cells) výhoda, že jde o lidské, ale opět nejde o cerebrální buňky primární kultury endoteliální buňky mozku potkanů, myší a prasat (cena, úspěšnost izolace) mozková endoteliální buněčná linie RBE4 linie - získaná transfekcí potkaních mikrovaskulárních endoteliálních buněk mozku s plasmidem obsahujícím adenovirus E1A gen, GP8 linie - získaná imortalizací potkaních cerebrálních endoteliálních buněk s využitím SV40 T antigenu
Ko-kultura buněk: endoteliové buňky (primárni kultura) + gliové buňky (primární kultury nebo linie C6) Izolace kapilár z mozkové kortikální šedé hmoty: stejně není zaručena integrita a funkce BBB (vyzžití pro identifikaci mechanismů a biochemických signálů které hrají roli v regulaci funkce BBB Immobilized artificial membrane (IAM) chromatography phases Parallel artificial membrane permeability assays (PAMPAs)
Hematotestikulární bariéra Potkaní/lidská primární kultura Sertoliho buněk
Děkuji za pozornost