UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI Přírodovědecká fakulta Katedra Biochemie Imobilizace proteinů na magnetické nanočástice a jejich praktické použití DISERTAČNÍ PRÁCE Autor: Mgr. Michaela Pečová Studijní program: P1416 Biochemie Studijní obor: Biochemie Forma studia: Prezenční Vedoucí práce: prof. Mgr. Marek Šebela, Dr. Termín odevzdání práce: 19.2.2013
Prohlašuji, že jsem předloženou disertační práci vypracovala samostatně za použití citované literatury. V Olomouci dne 19.2.2013. Poděkování Chtěla bych srdečně poděkovat svému školiteli prof. Mgr. Marku Šebelovi, Dr. za odborné vedení, za cenné rady a konzultace, které mi poskytl při řešení a vypracování předložené disertační práce. Děkuji také konzultantům prof. RNDr. Radku Zbořilovi, Ph.D. a doc. RNDr. Ludmile Zajoncové, Ph.D. za odborné diskuse k danému tématu. Dále děkuji za obětavou spolupráci Regionálnímu centru pokročilých technologií a materiálů PřF, UP v Olomouci. Konkrétně děkuji Mgr. Kateřině Polákové, Ph.D., Mgr. Jiřímu Tučkovi, Ph.D., Mgr. Zdence Markové, Mgr. Kateřině Holé, Mgr. Janu Čudovi za odbornou pomoc při řešení daného tématu. Za spolupráci na zahraniční studijní stáži bych chtěla poděkovat prof. Fabio Vianellovi z Univerzity v Padove. - 2 -
Bibliografická identifikace: Jméno a příjmení autora Mgr. Michaela Pečová Název práce Imobilizace proteinů na magnetické nanočástice a jejich praktické využití Typ práce disertační Pracoviště Katedra biochemie PřF UP Vedoucí práce prof. Mgr. Marek Šebela, Dr. Rok obhajoby práce 2013 Abstrakt Předložená disertační práce je zaměřena na imobilizaci proteinů na magnetické nanočastice a jejich praktické využití. První část teorie se zabývá vlastnostmi magnetických nanočástic oxidů železa, jejich přípravou, modifikací povrchu nanočástic a jejich strukturní, magnetickou, morfologickou a velikostní charakterizací. V další části teorie jsou popsány typy imobilizačních technik, chemické modifikace trypsinu a bioaplikace nanočástic oxidů železa zahrnující imobilizace proteinů, především trypsinu (EC 3.4.21.4), a jeho využití pro MALDI-TOF peptidové mapování. Z dalších aplikací je uvedeno využití nanočástic pro konstrukci amperometrického biosensoru a nanomedicínské obory patřící mezi in vivo aplikace. Druhá část práce se zabývá charakterizací enzymu sulfitoxidasy (EC 1.8.3.1) a jejím využitím pro stanovení siřičitanů v potravinářském průmyslu pomocí amperometrického biosensoru. Experimentální část je zaměřena na chemickou modifikaci hovězího trypsinu pomocí cyklodextrinů nebo biotinylačního činidla. Hodnota molekulové hmotnosti trypsinových konjugátů byla zhodnocena pomocí SDS-PAGE a MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie. Trypsin a jeho konjugáty byly kovalentně imobilizovány na povrch různých typů nanočástic magnetitu. Magnetometrická měření nanometrických materiálů byla provedena pomocí supravodivého kvantového interferenčního magnetometru (SQUID). Velikost nanočástic, morfologické a povrchové vlastnosti byly zhodnoceny pomocí technik elektronové mikroskopie. Volná a imobilizovaná forma trypsinu byla podrobena měření teplotní stability, ph optima, operační stability a stability při skladování. Byla rovněž stanovena vazebná kapacita funkcionalizovaných částic pro trypsin. Termostabilní imobilizované konjugáty trypsinu byly aplikovány pro rychlé a účinné štěpení proteinů v roztoku. Nanočástice biogenního magnetitu s imobilizovanou aminoxidasou a peroxidasou byly zvoleny pro konstrukci enzymové elektrody pro stanovení aminů. Dále byla z kuřecích jater izolována sulfitoxidasa. Hlavními kroky izolace byla příprava acetonového prášku a jeho extrakce, srážení - 3 -
síranem amonným, denaturace zahříváním a dialýza. Následovalo přečištění pomocí iontově výměnné chromatografie (Macro-Prep High Q, Resource Q), gelové permeační chromatografie (Superdex HR 10/30) a adsorpční chromatografie (Bio-Scale CHT5-I keramický hydroxyapatit). Sulfitoxidasa (stejně jako ostatní proteiny izolované v této práci) byla analyzována pomocí SDS-PAGE a potvrzena pomocí MALDI-TOF peptidového mapování. Výsledný enzym byl kovalentně imobilizován na povrch zlaté elektrody a vyzkoušen pro potenciální stanovení siřičitanů v biologických vzorcích pomocí amperometrického biosensoru. Klíčová slova bioelektroda, imobilizace a modifikace proteinů, magnetotaktické bakterie, magnetické mikro- a nanočástice, peptidové mapování, proteomika, trypsin, stabilita enzymů; purifikace proteinů, siřičitany, sulfitoxidasa Počet stran 207 Počet příloh 5 Jazyk Český - 4 -
Bibliographical identification: Autor s first name and surname Mgr. Michaela Pečová Title Immobilization of proteins on magnetic nanoparticles and their practical applications Type of thesis Ph.D. Department Department of Biochemistry, Faculty of Science Supervisor prof. Mgr. Marek Šebela, Dr. The year of presentation 2013 Abstract This Ph.D. thesis is focused on the immobilization of proteins on magnetic nanoparticles and their practical applications. In the beginning of a theoretical introduction, there are properties of nanoparticles of iron oxides described together with their preparation, surface modification and structural, magnetic, morphological and size characterization. Furthermore, immobilization techniques, chemical modification of trypsin and bioapplications of nanoparticles of iron oxides including immobilization of proteins, especially trypsin (EC 3.4.21.4), and their applications for MALDI-TOF peptide mass fingerprinting are mentioned. The usability of nanoparticles for the construction of an amperometric biosensor and in vivo applications within nanomedicine fields are described. The second part of the thesis deals with characterization of enzyme sulfite oxidase (EC 1.8.3.1) and its utilization for the determination of sulfite in food industry by means of an amperometric biosensor. The experimental part of the thesis is focused on chemical modification of bovine trypsin using cyclodextrins or a biotinylating agent. Molecular mass values of the resulting trypsin conjugates were evaluated by SDS-PAGE and MALDI-TOF MS. Both trypsin and its conjugates were covalently immobilized on the surface of different types of magnetite nanoparticles. Magnetometric measurements of the nanometric materials were performed by SQUID. Particle size, morphological and surface properties were evaluated using techniques of electron microscopy. All free and immobilized forms of trypsin were characterized by measurements of thermostability, ph optimum, operational and storage stability. Moreover, the binding capacity for trypsin of the functionalized magnetic particles was determined. The thermostable immobilized conjugates of trypsin were applied for a rapid and efficient in-solution digestion of proteins. Biogenic magnetite nanoparticles with attached amine oxidase and peroxidase were chosen for the construction of a carbon-paste electrode. In addition, a sulfite oxidase was isolated from chicken liver. The procedure of isolation - 5 -
involved acetone powder preparation and its extraction, ammonium sulfate precipitation, heat denaturation and dialysis. This was followed by ion-exchange chromatography (Macro-Prep High Q, Resource Q), gel permeation chromatography (Superdex HR 10/30) and adsorption chromatography (Bio-Scale CHT5-I ceramic hydroxyapatite). The obtained sulfite oxidase (as well as other proteins isolated in this study) was analyzed by SDS-PAGE and confirmed by MALDI-TOF peptide mass fingerprinting. The resulting enzyme was immobilized on the surface of a gold electrode and tested for possible determination of sulfite in biological samples using an amperometric biosensor. Keywords bioelectrode, immobilization and modification of proteins, magnetotactic bacteria, magnetic microand nanoparticles, peptide mass fingerprinting, proteomics, trypsin, stability of enzymes; protein purification, sulfite, sulfite oxidase Number of pages 207 Number of appendices 5 Language Czech - 6 -
OBSAH Cíle práce 10 ČÁST I Imobilizace proteinů na magnetické nanočástice a jejich praktické využití 11 1. Úvod 12 2. Teoretická část 14 2.1. Magnetické nanočástice oxidů železa magnetit, maghemit 14 2.2. Příprava magnetických mikro- a nanočástic oxidů železa 16 2.2.1. Metody syntézy magnetických částic oxidů železa 16 2.2.2. Izolace magnetosomů z magnetotaktických bakterií 18 2.3. Povrchová modifikace magnetických nanočástic 20 2.4. Charakterizace magnetických nanočástic oxidů železa 21 2.5. Imobilizace proteinů na magnetické nosiče 23 2.5.1. Typy imobilizačních technik 24 2.6. Biologické aplikace magnetických nanočástic oxidů železa 28 2.6.1. Proteiny imobilizované na magnetických nosičích 29 2.6.2. Proteomika imobilizace proteolytických enzymů 30 2.6.2.1. Hovězí trypsin pojem, vlastnosti a výskyt 31 2.6.2.2. Chemické modifikace proteolytických enzymů 32 2.6.2.3. Využití imobilizovaného trypsinu pro MALDI-TOF peptidové mapování 35 2.6.3. Imobilizace mikrobiálních buněk jako celobuněčných biokatalyzátorů 38 2.6.4. Využití magnetických nanočástic pro konstrukci amperometrického 39 biosensoru 2.6.5. Nano-medicínské obory 42 2.6.5.1. Kontrastní látky pro MRI 42 2.6.5.2. Magnetické nosiče léčiv 43 2.6.5.3. Metoda magnetické hyperthermie 44 3. Materiál a metody 45 3.1. Materiál 45 3.2. Příprava a modifikace magnetických mikro- a nanočástic oxidů železa 45 3.2.1. Příprava biogenního magnetitu modifikovaného chitosanem 45 3.2.2. Příprava syntetických nanočástic magnetitu modifikovaných chitosanem 46 3.2.3. Příprava silanizovaných syntetických nanočástic magnetitu 47 3.2.4. Enkapsulace nanočástic magnetitu do prostředí celulosy 47 3.3. Chemické modifikace hovězího trypsinu 48-7 -
3.3.1. Glykace trypsinu prostřednictvím cyklodextrinů 48 3.3.2. Biotinylace trypsinu s využitím aminoskupin 48 3.4. SDS-PAGE 49 3.5. Stanovení molekulové hmotnosti proteinů pomocí MALDI-TOF MS 50 3.6. Imobilizace trypsinu na magnetické nosiče 50 3.6.1. Glutaraldehydová metoda 50 3.6.2. Karbodiimodová metoda 51 3.6.3. Epoxidová metoda 51 3.6.4. Jodistanová metoda 52 3.6.5. Bioafinitní interakce 53 3.7. Charakterizace magnetických částic 53 3.7.1. Superconducting QUantum Interference Device SQUID 53 3.7.2. Transmisní a skenovací elektronová mikroskopie 54 3.8. Stanovení aktivity, vazebné kapacity částic, teplotní stability a hodnoty ph optima trypsinu 56 3.9. Stanovení operační a funkční stability trypsinu a stability při skladování 57 3.10. MALDI-TOF peptidové mapování ( peptide mass fingerprinting, PMF) 58 3.11. Příprava bioelektrod s využitím nanočástic magnetitu 59 3.11.1 Cyklická voltametrie a chronoamperometrie 61 4. Výsledky a diskuse 62 4.1. Stanovení molekulové hmotnosti modifikovaného trypsinu 62 4.2. Charakterizace magnetických částic 64 4.2.1. SQUID 64 4.2.2. TEM a SEM 68 4.3. Specifická aktivita, vazebná kapacita částic, teplotní stabilita a ph optimum trypsinu 76 4.4. Stanovení operační a funkční stability trypsinu a stability při skladování 81 4.5. MALDI-TOF peptidové mapování 87 4.6. Příprava bioelekrody s obsahem nanočástic magnetitu 92 4.6.1. Cyklická voltametrie a chronoamperometrie 92 4.6.2. Stanovení kinetických parametrů oxidoreduktas 97 4.6.3. TEM analýza imobilizovaných oxidoreduktas 99 5. Závěr 100 6. Použitá literatura 102 ČÁST II Izolace sulfitoxidasy z kuřecích jater 113 7. Úvod 114 7.1. Charakterizace enzymu sulfitoxidasy 115-8 -
7.2. Siřičitany význam jejich stanovení 116 8. Materiál a metody 119 8.1. Materiál 119 8.2. Izolace sulfitoxidasy z kuřecích jater 119 8.3. Chromatografická purifikace kuřecí sulfitoxidasy 119 8.4. Stanovení aktivity sulfitoxidasy, SDS-PAGE 119 8.5. MALDI-TOF peptidové mapování 121 8.6. Imobilizace kuřecí sulfitoxidasy na povrch zlaté elektrody 121 9. Výsledky a diskuse 122 9.1. Extrakce sulfitoxidasy z kuřecích jater 122 9.2. Chromatografická purifikace sulfitoxidasy z kuřecích jater 122 9.3. Identifikace proteinů pomocí MALDI-TOF peptidového mapování 124 9.4. Imobilizace kuřecí sulfitoxidasy na povrch zlaté elektrody 126 10. Závěr 131 11. Použitá literatura 132 12. Seznam použitých zkratek 134 13. Životopis 136 14. Přílohy 139 14.1. Superparamagnetic maghemite nanoparticles from solid-state synthesis Their functionalization towards peroral MRI contrast agent and magnetic carrier for trypsin immobilization 14.2. Biologicky aktivní látky imobilizované na magnetických nosičích a jejich využití v biochemii a biotechnologiích 14.3. Thermostable Trypsin Conjugates Immobilized to Biogenic Magnetite Show a High Operational Stability and Remarkable Reusability for Protein Digestion 14.4 Surface engineering of iron oxide nanoparticles isolated from Magnetospirillum gryphiswaldense for biochemical and biomedical applications 14.5. Purification of chicken liver sulfite oxidase: a study on performance of conventional chromatography - 9 -
Cíle práce vypracovat literární rešerši o magnetických mikro- a nanočásticích oxidů železa, metody přípravy magnetitových a maghemitových nanočástic, jejich funkcionalizace povrchu, charakterizace a bioaplikace; přehled imobilizačních technik, využití imobilizovaného trypsinu v proteomice a aplikace nanočástic magnetitu pro konstrukci bioelektrod amperometrického biosensoru; charakterizace enzymu sulfitoxidasy a význam monitorování siřičitanů v potravinářském průmyslu provést chemickou modifikaci hovězího trypsinu prostřednictvím cyklodextrinů nebo biotinylačních činidel. Porovnání trypsinových konjugátů s nativní formou enzymu kovalentně imobilizovat trypsin a jeho konjugáty na bakteriální a syntetické nanočástice magnetitu s různými typy funkcionalizující vrstvy. Provést charakterizaci nanočástic s imobilizovanými proteiny pomocí magnetizačního měření (SQUID), pomocí transmisní a skenovací elektronové mikroskopie oproti nanočásticím bez přítomnosti proteinu; charakterizace imobilizovaného trypsinu a jeho konjugátů v porovnání s volnou formou enzymu (teplotní stabilita, ph optimum, stabilita při skladování) aplikovat modifikovaný trypsin imobilizovaný na biogenním magnetitu pro MALDI-TOF peptidové mapování připravit bioelektrody pro amperometrický biosensor na bázi modifikované uhlíkové pasty s obsahem magnetitu s imobilizovanými oxidoreduktasami; její potenciální využití pro stanovení biogenních aminů v potravinářském průmyslu purifikovat sulfitoxidasu z kuřecích jater a její kovalentní imobilizace na zlatou elektrodu pro stanovení siřičitanů v biologických vzorcích - 10 -
ČÁST I IMOBILIZACE PROTEINŮ NA MAGNETICKÉ NANOČÁSTICE A JEJICH PRAKTICKÉ VYUŽITÍ - 11 -
1. Úvod Nanotechnologie a nanomateriály představují v dnešní době nové možnosti rozvoje v řadě oborů lidské činnosti. Nanotechnologiemi se rozumí aplikace vědeckého poznání vedoucí k syntéze, manipulaci a použití materiálů v rozmezí 1 100 nm, které vykazují nové unikátní vlastnosti, takové, které se u objemových protějšků těchto nanomateriálů nevyskytují (Filipová et al., 2012). Jde o nové moderní technologie, které se rozšířily po celém světě a nachází využití téměř ve všech vědeckých i průmyslových oborech (Invernizzi, 2011). Ukazuje se, že tyto nadstandardní technologie a materiály přinesou převrat také v biomedicíně jako magnetické nosiče cytostatik či jako kontrastní látky, v informačních technologiích, při čištění pitných a podzemních vod s využitím nanofiltrů, ale i v potravinářském průmyslu jako nové obalové materiály. Během posledních let se rozšiřují nanotechnologie z laboratoří do průmyslu a konkrétních aplikací. Často používanými magnetickými materiály se staly nanočástice oxidů železa, které představují vysoce atraktivní nanomateriály nejen v průmyslu, ale především v biomedicíně a to pro své výhodné magnetické, elektrické, katalytické a netoxické vlastnosti. V případě nanočástic oxidů železa se využívá oxid železnato-železitý (Fe 3 O 4 zvaný magnetit) a oxid železitý ( -Fe 2 O 3 zvaný maghemit) (Pankhurst et al., 2003). Jednou ze specifických výhod těchto nanomateriálů je možnost jejich cílené manipulace prostřednictvím vnějšího magnetického pole. Důležitými posuzovanými parametry nanočástic jsou biokompatibilita, biodegradabilita, netoxičnost, chemická stabilita, velká plocha povrchu a rozměr částic (Marková et al., 2012). Z důvodu zlepšení biokompatibility a pro omezení mezičásticových interakcí je povrch nanočástic oxidů železa chemicky modifikován (Ansari & Husain, 2012; Selim et al., 2007). Jako materiály pro úpravu povrchu nanočástic lze aplikovat chitosan a jeho deriváty (Kalkan et al., 2012), polyethylenglykol, dextran, celulosu nebo agarosu. Cílem obalových materiálů je také zavedení vhodných funkčních skupin na povrch nanočástic (funkcionalizace) pro následnou imobilizaci biosubstancí (Hong et al., 2007). Z aplikací in vivo se nabízí využití nanočástic jako kontrastních látek při magnetické rezonanci MRI (angl. Magnetic Resonance Imaging ), nosičů kancerostatik, léčba tumorů a magnetická hyperthermie (Ma et al., 2003). Nanočástice oxidů železa lze připravit syntetickými metodami, jsou však i komerčně dostupné. Nanometrické oxidy železa vytváří tzv. procesem biomineralizace také řada mikroorganismů, ze kterých se dané nanočástice izolují a upravují pro příslušné bioaplikace (Faivre & Schüler, 2008). Vhodně povrchově modifikované nanočástice lze využít pro imobilizaci různých enzymů. V proteomickém výzkumu nabývá významu imobilizace proteasy trypsinu (EC - 12 -
3.4.21.4). Z důvodu nízké teplotní stability trypsinu a nežádoucí autolýzy se provádí jeho chemická modifikace a následná imobilizace na pevné nosiče (Sun et al., 2012; Šebela et al., 2006). Z dalších tříd enzymů lze imobilizovat např. oxidoreduktasy využitelné při konstrukci enzymových elektrod amperometrických biosensorů (Gasparini et al., 1994; Sinigaglia et al., 2012). - 13 -
2. Teoretická část 2.1. Magnetické nanočástice oxidů železa magnetit, maghemit Magnetické nanočástice oxidů železa jsou středem velkého zájmu pro své potenciální použití v biologických disciplínách, lékařství, v oblastech biotechnologií, v environmentálních technologiích a analytických aplikacích. V přírodě nacházíme oxidy železa v různých strukturních formách. Oxidy železa se staly součástí řady minerálů a archeologických nálezů. K přípravě nosičů lze zvolit nejrůznější materiály, nejčastěji oxidy železa -Fe 2 O 3, Fe 3 O 4, čisté kovy (Fe, Co, Ni) a jejich slitiny (Suh et al., 2006) nebo ferity. Magnetické nanočástice oxidů železa (obr. 1) vykazují velikost v rozmezí 1 100 nm, které vykazují velký povrch a tím větší vazebnou kapacitu pro navázání různých biosubstancí. V současné době se nanočástice oxidů železa stávají žádaným materiálem v oboru nanotechnologií. Nejznámějším a často používaným magnetickým oxidem železa je černý ferimagnetický minerál magnetit (Fe 3 O 4 ) obsahující ionty Fe 2+ i Fe 3+. Tento nerost byl prokázán také v meteoritech pocházejících z Marsu. Magnetit se vyskytuje u mikroorganismů, ale i u eukaryot, jako jsou ryby, plazi, ptáci a savci, kde napomáhá k orientaci podle směru magnetického pole Země. Zajímavostí je, že magnetit byl nalezen i v mozku člověka (Kirschvink et al., 1992). První biomineralizovaný magnetit, který sloužil jako radula zubů chitonů byl objeven v roce 1962 H. A. Lowenstamem u mořského plže třídy Polyplacophora (chroustnatky), kde typickým zástupcem je Chiton olivaceus (Wal et al., 2000). Hojně se také využívá syntetický maghemit ( -Fe 2 O 3 ), představující jeden ze čtyř strukturních polymorfů oxidu železnatého (kromě -Fe 2 O 3 - hematit, -Fe 2 O 3, a - Fe 2 O 3 ), které ovšem nevykazují žádoucí magnetické vlastnosti (Tuček et al., 2006). Maghemit představuje kvůli své spinelové struktuře se dvěma podmřížkami typického představitele ferimagnetických látek, které udílejí velkou susceptibilitu vzorkům, v nichž jsou obsaženy, tudíž se maghemit stal důležitým magnetickým materiálem v medicíně a v průmyslu. Maghemit je teplotně nestabilní a v rozmezí teplot 600 1300 K se transformuje na hematit. Pro některé bioaplikace lze zvolit speciální magnetické kapaliny tzv. ferrofluidy, což je koloidální suspenze jemných magnetických nanočástic (magnetit, maghemit) ve vhodné nemagnetické kapalině (Šafaříková & Šafařík, 1995). Ferrofluidy bývají označovány jako tekuté magnety. Hlavní výhodou magnetických nanomateriálů je možnost cílené manipulace působením vnějšího magnetického pole, (obr. 2) (Safarik & Safarikova, 2009). V praxi se používají různé typy magnetických separátorů (obr. 3). - 14 -
A) B) Obr. 1. A) Snímek ze skenovací elektronové mikroskopie (SEM) magnetických nanočástic Fe 3 O 4 ; B) Snímek z transmisní elektronové mikroskopie (TEM) magnetických nanočástic -Fe 2 O 3 (Li et al., 2010; Kluchová et al., 2009). Obr. 2. Zobrazení magnetické separace bakteriálních nanočástic cíleným působením vnějšího magnetického pole. Obr. 3. Různé typy magnetických separátorů používaných pro laboratorní účely. - 15 -
2.2. Příprava magnetických mikro- a nanočástic oxidů železa V současné době je k dispozici celá řada syntetických metod pro přípravu magnetických mikro- a nanočástic oxidů železa, které mohou být potenciálně využívány v medicíně, biologických vědách a biotechnologiích. Metody syntézy jsou zaměřeny na přípravu práškových materiálů, které obsahují mikro- nebo nanočástice magnetitu, maghemitu, směsných oxidů železa nebo feritů. Často se připravují i magnetické kapaliny tzv. ferrofluidy a provádí se syntéza magnetických částic přímo v prostředí polymerního materiálu, který stabilizuje, disperguje a vhodně modifikuje povrch částic pro další bioaplikace (Laurent et al., 2008). Magnetické mikro- a nanočástice oxidů železa nabízí i celá řada komerčních firem. Zajímavou možností přípravy vysoce čistého magnetitu o uniformní velikosti je izolace magnetosomů z magnetotaktických bakterií. 2.2.1. Metody syntézy magnetických částic oxidů železa Ze syntetických metod přípravy částic oxidů železa pro bioaplikace se často využívají chemické reakce zahrnující termické rozklady prekurzorů obsahujících železo, sol-gel reakce, srážecí reakce solí železa, sonochemické syntézy, aerosolové, elektrochemické a mikroemulzní techniky a laserová pyrolýza aj. (Laurent et al., 2008). Jednou z nejvíce používaných metod syntézy částic magnetitu nebo maghemitu ve velkém množství je jednoduchá a účinná metoda tzv. koprecipitace (spolusrážení), kdy dochází k reakci železnatých a železitých iontů v bazickém prostředí. Pro kompletní precipitaci je požadováno ph v rozmezí hodnot 8 14, stechiometrický poměr 2:1 (Fe 3+ /Fe 2+ ) a nepřítomnost vzdušného kyslíku. Tyto uvedené podmínky jsou vyžadovány z toho důvodu, že magnetit je nestabilní a citlivý k oxidaci. V přítomnosti kyslíku je magnetit transformován na maghemit (Thanh, 2011). Chemickou reakci přípravy Fe 3 O 4 ukazuje obr. 4. Z reakčních podmínek je důležitá hodnota ph, teplota, iontová síla, typ použité soli a poměr koncentrací železnatých a železitých iontů. Na těchto faktorech závisí tvar a velikost vzniklých oxidů železa. Hlavní výhodou koprecipitačního procesu je zisk částic ve velkém množství. Koprecipitační metody poskytují většinou částice rozdílné velikosti. Monodisperzity částic lze docílit přídavkem chelatujících organických aniontů (kyseliny olejová, glukonová nebo citronová) anebo polymerů jako je dextran, karboxydextran a polyvinylalkohol. První kontrolovaná příprava superparamagnetických částic oxidu železa s použitím FeCl 3 a FeCl 2 v alkalickém prostředí byla provedena Massartem (Massart, 1981). Při Massartově procesu přípravy vodných magnetických kapalin se částice stabilizují přítomností kyseliny chloristé nebo hydroxidu tetramethylamonia. - 16 -
Další hojně využívanou možností může být mikroemulzní technika, při které termodynamicky stálá disperze dvou nemísitelných fází vyrobí micely obklopující magnetické částice. Vhodnou úpravou velikosti nitra micely obsahující vodnou fázi může být řízena velikost vzniklých částic. Při provedení sol-gel reakce se prekurzor podrobí sadě hydrolytických a polymeračních reakcí, vzniklá koloidní suspenze se převádí na viskózní gel a pak na pevný materiál (Xu et al., 2009). Magnetické mikro- a nanočástice s vhodně modifikovaným povrchem jsou i komerčně dostupné, ovšem pro denní výzkumné účely jsou poměrně finančně náročné. Mezi hlavní firmy, které vyrábí magnetické nosiče patří Advanced Magnetics (USA) a Miltenyi Biotec (Německo). Nanočástice magnetitu nabízí firma Sigma-Aldrich (Německo), lze zakoupit i modifikované magnetické mikročástice s amino- nebo karboxyskupinou, ale i mikročástice funkcionalizované biotinem nebo streptavidinem. Českým výrobcem magnetických nosičů (obr. 5) modifikovaných např. celulosou je firma Iontosorb Bead Cellulose Derivates (www.iontosorb.cz). Fe 2+ + 2 Fe 3+ + 8 OH - Fe 3 O 4 + 4 H 2 O 4 Fe 3 O 4 + O 2 6 Fe 2 O 3 Obr. 4. Schéma přípravy magnetitu koprecipitací železnatých a železitých iontů v bazickém prostředí. Transformace magnetitu na maghemit v přítomnosti kyslíku (Thanh et al., 2011). Obr. 5. SEM snímek makroporezních magnetických mikročástic modifikovaných celulosou (http://www.iontosorb.cz/; http://www.rcptm.com/). - 17 -
2.2.2. Izolace magnetosomů z magnetotaktických bakterií Zajímavou metodou přípravy unikátních magnetických nanočástic uniformní velikosti (50 100 nm) je produkce tzv. magnetosomů (částice magnetitu obalené fosfolipidovou membránou) magnetotaktickými bakteriemi (MTB). MTB byly poprvé izolovány v roce 1975 z rybniční vody R. Blakemorem. Magnetosomy bakterie tvoří pomocí biomineralizace, což je proces, při kterém organismy produkují biogenní minerály, které se stávají součástí jejich organismu. Biogenní magnetit je významný hlavně pro budoucí potenciální aplikace v lékařství i jiných oborech, proto se jeho produkcí zabývá několik výzkumných týmů. Podle typu prostředí, ve kterém se mikroorganismy nachází, tvoří uvnitř buňky magnetit (Fe 3 O 4 ) nebo greigit (Fe 3 S 4 ). Magnetit se vyskytuje u bakterií, které žijí aerobně, krystalky greigitu nebo pyritu u mikroorganismů, které žijí v sulfidické a anaerobní zóně. MTB tvoří různé morfologické typy zahrnující vibria, koky, spirály a tyčky (Schüler Frankel, 1999). Různé druhy MTB produkují rozdílné tvary, velikost a uspořádání magnetosomů. Na druhu a kmenu dané bakterie a na typu přírodních a růstových podmínkách závisí výsledný tvar, velikost a složení magnetických krystalů. MTB patří mezi gramnegativní prokaryota a nachází se v mnoha prostředích po celém světě. MTB mohou být sladkovodní i mořské a pohybují se podél geomagnetického pole Země. Magnetosomy tvoří mechanismus, který pomáhá k orientaci bakterií tzv. magnetotaxi, když bakterie je vytržena z místa s optimálními a životně důležitými podmínkami. S využitím magnetitového kompasu bakterie hledá nejvhodnější prostředí k životu (Schüler, 1999). Magnetosomy uvnitř bakterie mohou být rozptýlené anebo uspořádané v řetízku. Kultivovatelné MTB patří do rodu Magnetospirillum. Mezi nejznámější kultivovatelné kmeny řadíme M. gryphiswaldense MSR-1 (obr. 6), M. magnetotacticum MS-1 a M. magnetotacticum AMB-1 (Schleifer et al., 1991; Matsunaga et al., 1991). Magnetosomální membrána je složena z fosfolipidů. Z anorganického pohledu obsahuje prvky uhlík, fosfor a vápník, z organických látek jsou nejdůležitější transmembránové proteiny. Zajímavými proteiny membrány, které nebyly nalezeny v buněčných orgánech jiných mikroorganismů je Mag A, Mam a Msm (Jogler & Schüler, 2007). Magnetosomální membrána je znázorněna na obr. 7. Magnetosomy se získávají v laboratorních podmínkách kultivací vhodných kmenů MTB a následnou izolací, nebo lze využít možnosti genového inženýrství. Závěrem lze říci, že tvorba specifických magnetických nanokrystalů je ohromujícím příkladem, jak jednoduchý mikroorganismus tvoří anorganické struktury na základě informací kódovaných v genomu. Nanokrystaly magnetitu se nachází i u vyšších organismů včetně člověka. - 18 -
0,5 m Obr. 6. Snímek bakterie Magnetospirillum gryphiswaldense, která obsahuje magnetosomy seskupené do řetízku (Schüler Frankel, 1999). 25 nm Obr. 7. Magnetosomy vyizolované z Magnetospirillum gryphiswaldense. Krystalky magnetitu mají v průměru 42 nm. Šipka označuje magnetosomální membránu, kterou je biogenní magnetit obklopen (Schüler Frankel, 1999). - 19 -
2.3. Povrchová modifikace magnetických nanočástic Magnetické nanočástice oxidů železa vykazují reaktivní a poměrně velkou plochu povrchu (řádově 100 m 2.g -1 ). Aby nedocházelo k nežádoucím povrchovým jevům, provádí se chemická modifikace povrchu nanočástic, která navíc umožnuje zvýšit jejich využitelnost v řadě aplikací. Velký povrch částic je vhodný pro navázání biologicky významných látek. Obecně platí, čím je magnetická nanočástice menší, tím vyšší vykazuje vazebnou kapacitu pro navázání biokomponent. Pro imobilizaci biologicky významných látek na povrch magnetických částic je nutné jejich povrch chemicky modifikovat určitými chemickými komponentami, které umožní vytvořit vazbu pro navázání specifických biomolekul a zároveň se povrch modifikuje pro aplikace in vivo. Povrch částic se obaluje nejčastěji organickými látkami, jedná se o tzv. funkcionalizující obal (obr. 8; Tuček et al., 2006). Jako povrchové materiály se používají přírodní a syntetické polymery, organické a anorganické materiály nebo některé vitaminy (biotin). Především pro biomedicínské aplikace musí používané povrchové materiály splňovat řadu důležitých kriterií. Při in vivo aplikaci musí být zajištěna biokompatibilita, biodegradabilita a netoxičnost funkcionalizujícího obalu. Povrchová modifikace dále zabraňuje mezičásticové interakci a chrání magnetické jádro před chemickou transformací. Příkladem může být agregace nemodifikovaných nanočástic a adsorpce proteinů plazmy v krevním řečišti. Takové nanočástice jsou okamžitě eliminovány makrofágy, ještě dříve, než se dostanou k cílové buňce. Z tohoto důvodu se částice pro lékařské aplikace často modifikují polyethylenglykolem (PEG) (Zhang et al., 2002). V chemických oborech a biotechnologiích je chemická modifikace povrchu částic požadována pro imobilizaci biomolekul z důvodu obsahu příslušných funkčních (aktivních) skupin. Po povrchové modifikaci jsou magnetické vlastnosti ovlivněny nejen vlastnostmi magnetického jádra, ale i vlastnostmi diamagnetického funkcionalizujícího obalu (Lemarchand et al., 2004). Jako povrchové materiály se často používají přírodní látky zahrnující chitin, chitosan a jeho deriváty, dextran, alginát, celulosu, agarosu, škrob, želatinu aj. Častým obalujícím materiálem je biopolymer chitosan (Kalkan et al., 2012), což je deacetylovaná forma chitinu. Chitosan se vyznačuje výbornými biologickými, chemickými a fyzikálními vlastnostmi a jeho reaktivní amino- a hydroxyskupiny jsou využitelné pro imobilizaci biokomponent (Verheul et al., 2009). Ze skupiny syntetických sloučenin se pro povrchovou modifikaci používají PEG, polyvinylalkohol, polyethylenimin a polyvinylpyrrolidon. Zajímavou technikou je silanizace povrchu magnetických částic s využitím silanizačních činidel jako je -aminopropyltriethoxysilan (APTES), glycidoxypropyltriethoxysilan, 3-(2- - 20 -