Základy imunologických metod: interakce antigen-protilátka využití v laboratorních metodách

Imunoglobuliny membránově vázané a solubilní receptory

Epitopy Antigen = částice rozpoznávaná protilátkou Epitop (antigenní determinanta) = část antigenu, na který se váže protilátka. Většina antigenů má více epitopů (multivalentní) Fig. 2.9 Většinou cukr nebo peptid.

Epitopy rozpozávané protilátkami jsou obvykle lokalizovány na povrchu antigenu Fig. 2.8

Konformační vs. lineární epitopy Fig. 2.11

Epitopy heat, acid Konformační epitopy zničení při denaturaci Lineární epitopy neovlivněné denaturací

Základní struktura imunoglobulinů 2 lehké řetězce -lambda (λ) -kappa (κ) 2těžké řetězce Fig. 2.2

Základní struktura imunoglobulinů Fig. 2.2 Fig. 2.2

Štěpení protilátek Antigen-binding Fragment (Fragment vážící protilátku) Crystallizable Fragment (krystalizovatelný fragmen

Třída imunoglobulinů (izotypy) H: γ µ δ α ε (IgG1 4) (IgA1 2) L-chain: κ or λ

Rozdíly mezi imunoglobuliny

Fyzikální vlastnosti imunoglobulinů

IgM Membránově vázaný monomer and sekretovaný pentamer. První třída protilátek syntetizovaná během ontogeneze a při imunitní odpovědi Aktivace komplementu; aglutinace. Může být transportována na slizniční povrch

IgG Nejvyšší koncentrace v séru 4 podtřídy: IgG1-4 Aktivace komplementu Binds to Fcγ -receptors on neutrophils, macrophages and NK cells

IgA Obvykle dimer Sekreční IgA je dimer se sekreční komponentou 2 podtřídy: IgA1 and IgA2 Nejčastější imunoglobulin ve slizničních sekretech Neutralizace; Zabraňuje vazbě mikroorganismů na receptory Není efektivní v aktivaci komplementu

IgE Velmi nízká sérová koncentrace u zdravých lidí. Koncentrace je vyšší u pacientů s parazitárními infekcemi a u pacientů s alergiemi Váže se na receptory na žírných buňkách a bazofilech. Následuje degranulace a uvolňování zánětlivých mediátorů

IgD Velmi nízká koncentrace v séru Primárně nalézána spolu s IgM na naivních B buňkách Neznámá funkce

Funkce imunoglobulinů

Funkce imunuglobulinů

Polyklonální vs. monoklonální protilátky Polyklonální protilátky Purifikace ze séra imunizovaných zvířat (koza, králík) Proti mnoha epitopům, různe affinitní Rozdíly mezi šaržemi Monoklonální protilátky Produkce imortalizovanými plazmatickými buňkami, většinou myší původ Jedna specificita, definovaná afinita

Monoklonální protilátky Imortalizace jednoho klonu B buněk produkujících určitou protilátku Fúze B buněk s buňkami myelomu

Interakce antigen - protilátka Nekovalentní vazba: Elektrostatická Vodíkové můstky Van der Waalsovy síly Hydrofobní síly Afinita: Síla interakce mei epitopem a jedním vazebným místem protilátky Avidita: Suma všech interkací meyi protilátkou a antigenem

Crosreaktivita A B Antiserum vyrobené proti antigenu A reaguje také s antigenem B Antigen A a B mají stejný epitop Antigen A a B mají podobný (ale ne stejný) epitop

Metody, kde se využívájí protilátky Neznačený antigen/protilátka Precipitace Aglutinace Značený antigen/protilátka Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Radioimmunoassay (RIA) Western blotting Immunofluorescence Průtoková cytometrie

Sensitivita metod precipitace - 30 µg/ml aglutinace - 1 µg/ml radioimunoassay, ELISA - 1 pg/ml

Agregáty vzniklé interakcí multivalentních protilátek a multivalentních makromolekulárních antigenů Precipitation reaction Poměr reagujících složek, při němž je doba flokulace nejkratší nebo precipitace nejvýrazněj ší, se nazývá optimální poměr a j e obvyke tvořen ekvivalentními množstvími antigenu a protilátky.

Precipitační reakce Ab + solubilní Ag Síť antigenů a protilátek Precipitace Stanovení imunoprecipitace: vizuálně metodami rozptylu světla (nefelometrické nebo turbidimetrické stanovení) Metody Flokulační : postupné ředění jedné z reagujících složek - ve zkumavce Imunodifuzní (ID) : ředění se dosahuje difuzí do prostředí gelu Radiální imunodifúze Dvojitá difúze Imunoelektroforéza

Radiální imunodifúze Protilátka je rozpuštěná v gelu; Ag je přidán do jamek Měření koncentrace různých sérových proteinů, např. hladiny imunoglobulinů

Dvojitá difúze Ab a Ag difundují proti sobě Stanovení homogenity systému antigen-protilátka Diagnostika specifických autoimunitních onemocnění Používáno následně po purifikaci směsi antigenů Hledání reakcí mezi serologicky příbuznými antigeny Identické Neidentické Částečně identické

Dvojitá difúze

Imunoelektoforéza Kombinace separace antigenů elektroforézou s identifikací pomocí dvojité difúze detekce presence nebo absence proteinu v seru

Aglutinační reakce Ab + částicový Ag Aglutinace (shlukování) Přímá aglutinace Pasivní aglutinace Aglutinační inhibice

Přímá aglutinace Ag je přirozenou složkou částice Např. testování pacientova séra na přítomnost protilátek proti určité bakterii: Pacientovo serum je seriově ředěno do zkumavek s danou bakterií. Poslední zkumavka s viditelnou aglutinací určuje titr protilátky v séru

Přímá aglutinace Stanovení protilátek proti erytrocytům Erytrocyty: negativně nabité (zeta potenciál), může být ovlivněna agluginační reakce (zejména IgG protilátky) Řešení: Coombsův test - použití anti imunoglobulinového séra Eg. Detection of anti-rh antibodies in the blood of an Rh- woman

Coombsův Test Přímý: přidá se protilátka proti lidskému imunoglobulinu (Coombsovo činidlo) k červeným krvinkám. Aglutinace se objeví, pokud jsou erytrocyty pokryty protilátkami Nepřímý: inkubuje se testované sérum s erytrocyty zdravého dárce. Incubate test serum with red blood cells. Promytí. přidá se Coombsovo činidlo. stanovení Rh protilátek diagnostika získané hemolytické anémie - průkaz volných antierytrocytárních protilátek v plazmě (séru)

Přímý a nepřímý Coombsův test Měření vázané protilátky Měření sérové protilátky

Pasivní aglutinace Aglutinace mezi protilátkou a solubilním antigenem vázaným na nesolubilní částici (latexová částice) Mnohonásobně zvýšení citlivosti oproti precipitační reakce Diagnostika autoprotilátek u autoimunitních onemocnění Diagnostika autoimunitní thyroitidy: Thyroglobulin je připojen k latexové částici a je použit k detekci anti-thyroidních protilátek v séru pacienta - Diagnostika revmatoidní artritidy

Inhibice aglutinace velmi citlivá metoda, umožňující detekci malých množství antigenu. Ag je navázán např. na latexové partikule a v testu je přítomná protilátka proti tomuto Ag, která aglutinuje. Přítomnost totožného Ag ve zkoumaném vzorku inhibuje aglutinaci, protože tento Ag obsadí vazebná místa Ab. Průkaz užívání drog (kokain, heroin). Některé viry spontánně hemaglutinují a proto inhibice hemaglutinace sérovými protilátkami může být využita k diagnostice (zarděnky, chřipka).

Hemaglutinace

radioaktivní fluorescenční enzymatické Metody se značeným antigenem/protilátkou Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Radioimmunoassay (RIA) Western blotting Imunofluorescence Průtoková cytometrie

Enzyme-linked immunosorbent Principle of assay ELISA/RIA (ELISA) 1 2 3 4 1. Potažení jamek antigenem 2. Přidání vzorku séra 3. Přídání enzymem značené protilátky (anti-human IgG) 4. Přidání substrátu 5. Odečtení barevné reakce

Western blotting Western blot

Imunofluorescence Přímá vazba značené protilátky Nepřímá vazba primární protilátky a značené sekundární protilátky k detekci autoprotilátek. Sérum pacienta se nechá reagovat se substrátem. (normální tkáň jiného pacienta nebo tkáň zvířecí nebo buňky standardních buněčných kult). Detekce navázaných protilátek pomocí značených sekundárních protilátek, specifických vůči jednotlivým třídám lidských protilátek.

Průtoková cytometrie

Průtoková cytometrie: stanovení CD4 T buněk

Monitoring CD4 T buněk u HIV pacienta