POKROČILÝ KURZ MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY NÁVODY KE CVIČENÍM BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. I. TURNUS: 22. 10. 26. 10. 2012 / II. TURNUS: 29. 10. 2. 11. 2012
POKROČILÝ KURZ MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY NÁVODY KE CVIČENÍM BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. I. TURNUS: 22. 10. 26. 10. 2012 II. TURNUS: 29. 10. 2. 11. 2012 MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY: POKROČILÉ PRAKTICKÉ VZDĚLÁVÁNÍ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII OPERAČNÍ PROGRAM VZDĚLÁVÁNÍ PRO KONKURENCESCHOPNOST ČÍSLO PROJEKTU: CZ.1.07/2.3.00/09.0046
POKROČILÝ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL návody ke cvičením editoval: Václav Brázda autoři: Václav Brázda, Marie Brázdová, Miroslav Fojta, Luděk Havran, Iva Kejnovská, Lucie Navrátilová, Petr Orság, Hana Pivoňková Vydal: Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Česká republika Brno 2012 Česká Republika První vydání ISBN: 978-80-87541-05-0-4 -
Obsah Kapitola 1: Studium vazby různých isoforem proteinu p73 na DNA... 7 I. Příprava rekombinantních proteinů p73 pomocí eukaryotického bezbuněčného expresního systému (in vitro transkripce/translace, IVTT)... 7 II. Separace rekombinantních proteinů p73 připravených pomocí IVTT na SDS PAGE a jejich následná detekce pomocí Western blotu... 10 III. Studium vazby dvou isoforem proteinu p73 na nadšroubovicovou a lineární DNA pomocí imunoprecipitace na magnetických kuličkách... 20 Kapitola 2: Elektrochemická detekce poškození DNA a monitorování látek poškozujících DNA... 23 I. Detekce poškození DNA na rtuťových elektrodách HMDE modifikovaná scdna jako senzor pro stanovení látek poškozujících DNA... 23 II. Detekce poškození DNA na uhlíkových elektrodách... 24 III. Kontrola štěpení DNA na agarózovém gelu... 25 Kapitola 3: Využití elektroaktivních značek pro identifikaci nukleotidových sekvencí... 27 I. Analýza nukleotidových sekvencí pomocí DNA značené terminální transferázou... 27 II. Analýza nukleotidové sekvence metodou primer extension... 30 Kapitola 4: Analýza proteinů a komplexů proteinů s DNA... 32 I. Elektroforéza proteinů v přítomnosti SDS SDS PAGE... 32 II. Stanovení koncentrace proteinů podle Bradfordové... 35 III. Přímé stanovení koncentrace proteinů při 280nm... 37-5 -
IV. EMSA Gelová retardační analýza... 38 Kapitola 5: Využití spektroskopie cirkulárního dichroismu při sledování konformačních přechodů DNA... 41 I. Kooperativní přechod... 41 II. Nekooperativní přechod... 42 III. Termální denaturace kvadruplexů DNA... 44-6 -
Kapitola 1: Studium vazby různých isoforem proteinu p73 na DNA I. Příprava rekombinantních proteinů p73 pomocí eukaryotického bezbuněčného expresního systému (in vitro transkripce/translace, IVTT) Princip úlohy: Využití bezbuněčných systémů patří k velmi rozšířeným metodám přípravy rekombinantních proteinů.tyto systémy dnes umožňují velice rychlou a snadnou přípravu relativně dostatečného množství rekombinantních proteinů, které lze následně využít v celé řadě funkčních studií. Tradičně se používá k ověření čtecích rámců, studia proteinových mutací, studia protein:proteinových, protein:dna vazebných interakcí, stanovení aktivity proteinů atd. V poslední době se těchto metod používá k potvrzení výsledků metod interakce proteinů ve 2-hybridních systémech, provedení in vitro expresního klonovaní a pro přípravu proteinových substrátů pro studium aktivity a modifikace enzymů atd. Bezbuněčné expresní systémy lze primárně rozdělit dle typu použitého expresního systému bud na prokaryotické (S30 E.coli extrakt) nebo eukaryotické {králičí retikulocytární extrakt (Rabbit reticulocyte extract), extrakt z pšeničných klíčků (wheat germ extract)}. V obou případech je příprava rekombinantních proteinů provedena translací in vivo nebo in vitro připravené mrna. V současné době se, zejména s ohledem na problémy s manipulací s in vivo izolovanou mrna, častěji uplatňuje přístup využívající kombinaci prokaryotické transkripce pomocí fágové RNA polymerázy (T7, T3, SP6) a následné translace během jediné reakce, tzv. systémy spojené in vitro transkripce a translace (in vitro transcription and translation systems, IVTT). Pro tyto spojené IVTT expresní systémy pak lze jako templáty pro transkripci a následnou translaci využít připravené DNA expresní vektory. Příslušná mrna daného proteinu se generuje transkripcí z úseku DNA z vektoru pod příslušným promotorem (T3, T7, SP6 součásti většiny expresních vektorů). - 7 -
Pro následnou translaci je v závislosti na použitém translačním systému nutná přítomnost dalších regulačních sekvencí v promotoru expresního vektoru: místo vazby ribozomu (RBS site, ribosome binding site) exprese v prokaryotických expresních systémech, Kozakova sekvence (Kozak sequence) exprese v eukaryotických expresních systémech. Cílem úlohy je příprava dvou rekombinantních isoforem proteinu p73 (p73alfa a p73delta) z připravených expresních vektorů pcdna3.1/p73alfa a pcdna3.1/p73delta pomocí eukaryotického expresního systému T7 TNT Quick Coupled Transcription/Translation System. Princip metody IVTT + DNA templát Nuclease free voda inkubace 30 C, 60 min rekombinantní protein Postup: 1. Vyjmout kit T7 TNT Quick Coupled Transcription/Translation (Promega) z mrazáku -70 C. Rychle rozmrazit zkumavky s T7 TNT Quick master mix zahřátím v ruce, pak umístit na led. Rozmrazit ostatní komponenty reakce při laboratorní teplotě a umístit je na led. 2. Zapnout termostat a nastavit teplotu 30 C 3. Přípravit a popsat dvě ependorky, označit číslem skupiny: Zkumavka č.1 - p73 alfa a zkumavka č.2 - p73delta. 4. Napipetovat postupně do připravených zkumavek jednotlivé komponenty reakce dle tabulky. Po napipetování všech komponent mírně promíchat pipetováním a následně krátce stočit na centrifuze pro odstranění případných bublin. 5. Zkumavky umístit do termostatu a inkubovat 60 minut při 30 C - 8 -
Tabulka Zkumavka č.1: Zkumavka č.2: p73 alfa p73 delta Komponenty Objem (ul) Objem (ul) Nuclease-free voda 2,9 3 Methionin (1mM) 0,4 0,4 Plazmidová DNA: p73 alfa (872 ng/ul) 0,7 - Plazmidová DNA: p73 delta (1080 ng/ul) - 0,6 TNT Quick Master mix 16 16 Celkový objem 20 20 Seznam potřebného vybavení a chemikálií Kit T7 TNT Quick Coupled Transcription/Translation System (Promega) 1 mm Methionin Nuclease-free voda Plazmidová DNA pcdna3.1/p73alfa a pcdna3.1/p73delta Pipety Špičky Zkumavky 1,5 ml Nádobka na led a led Centrifuga Termoblok - 9 -
II. Separace rekombinantních proteinů p73 připravených pomocí IVTT na SDS-PAGE a jejich následná detekce pomocí Western blotu Princip úlohy: Western blot (česky označovaný někdy termínem imunoblot) je technika kombinující separaci proteinů pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE) s transferem proteinů na membránu a jejich následnou detekcí pomocí specifických protilátek. Je to v současné době rutinní technika, která se používá jak k detekci proteinů z komplexních směsí, tak k monitorování exprese a purifikace proteinů. Touto metodou se v praxi diagnostikuje řada infekčních onemocnění člověka a zvířat. Oproti běžným sérologickým metodám, jako je ELISA, je Western Blot sice časově náročnější a dražší, ale za to přesnější (větší specifičnost).western blot poskytuje jednak kvalitativní (velikost proteinu dle standartu) tak i semikvantitativní data (srovnání se vzorkem o známé koncentraci) o analyzovaném proteinu. Metodika Western blotu zahrnuje celkem 5. fází: 1. fáze: Gelová elektroforéza První část se skládá z polyakrylamidové gelové elektroforézy v přítomnosti dodecyl sulfátu sodného (SDS, laurylsíran sodný) SDS-PAGE. Proteiny jsou separovány v akrylamidovém gelu na základě jejich molekulové hmotnosti a tvoří tvz. bandy (z angl. proužky, pásky). Podrobněji k SDS-PAGE viz. K Proteiny migrují v elektrickém poli na základě jejich tvaru (globulární proteiny migrují rychleji než vláknité) a hustoty náboje (poměr velikosti náboje k jednotce hmoty). SDS se váže na bílkovinný řetězec v poměru 1.4 g SDS na 1 g bílkoviny, přičemž délka komplexu SDS bílkovina je úměrná jeho molekulové hmotnosti. Často se disulfidické vazby v proteinu eliminují redukčním činidlem ( -merkaptoethanol) a denaturace se dokončí varem. Výsledně je jediným faktorem rozhodujícím o pohyblivosti proteinů při denaturačním SDS-PAGE jejich molekulová hmotnost. Na základě srovnání relativních mobilit neznámé bílkoviny a standardů je pak možné určit její relativní molekulovou hmotnost. - 10 -
2. fáze: Transfer Po provedení SDS PAGE jsou rozdělené proteiny přeneseny z polyakrylamidového gelu na vhodnou membránu (PVDF, nitrocelulóza). Při kontaktu gelu s membránou v blotovacím zařízení dochází po aplikaci elektrického proudu k transferu proteinů z gelu a jejich ukotvení na membráně. Výsledkem je kopie proteinů separovaných na gelu. Efektivita přenosu závisí na celé řadě faktorů: složení gelu, doba přenosu, velikost a vlastnosti proteinů, přítomnosti detergentů a alkoholu v elektrodovém pufru. Optimální podmínky pro přenos proteinů jsou při použití pufrů s nízkou iontovou silou a nízkých proudových hodnot. Před dalším krokem je žádoucí kontrolovat efektivitu přenosu proteinů na membránu. Pro tuto kontrolu se využívají reversibilní barvení pomocí barviček, které neinterferují s vazbou protilátek v dalších krocích (Ponceau S) - 11 -
3. fáze: Blokování Po transferu je nutné provést zablokování míst na membráně, kde nedošlo k navázání proteinů, a zabránit tak nespecifickým vazbám protilátek použitých v dalších krocích. Pro blokování se nejčastěji používají roztoky 1-5% odtučněného mléka nebo bovinního sérového albuminu (BSA) ve fosfátových (PBS) nebo trisových (TBS) pufrech s minimálními přídavky detergentů, jako je Tween 20 nebo Triton X-100. Použití blokačního pufru je specifické v závislosti na použitých protilátkách. 4. fáze: Detekce V průběhu detekce je membrána inkubována s primární protilátkou, která rozeznává specifický protein(y) nebo epitop(y). Po promytí membrány (odstranění nenavázané primární protilátky) je následně inkubována se sekundární protilátkou, která rozeznává druhově specifiké struktury primární protilátky (např. anti-myší, anti-kozí, anti-králičí sekudární protilátky). Sekundární protilátka je nejčastěji konjugována s reportérovým enzymem (alkalická fosfatáza AP, křenová peroxidáza HRP). Pro vizualizaci vazby nejčastěji používané sekundární protilátky s HRP je použit chemiluminiscenční substrát. HRP katalyzuje reakci za vzniku luminiscenčního produktu, který je následně detekován pomocí rentgenových filmů nebo moderněji pomocí dokumentačních systémů 5. fáze: Analýza Výsledkem analýzy western blotu by (v ideálním případě detekce určitého proteinu) mělo být zviditelnění jednoho,,bandu na membráně odpovídající tomuto proteinu (závisí zejména na volbě použité primární protilátky a na celkovém provedení - 12 -
metody). Na základě srovnání jeho pozice vůči standardu můžeme určit přibližnou velikost proteinu. V případě, že výsledkem western blotu je přítomnost více,,bandů, než by mělo odpovídat našemu proteinu, jedná se o nejčastěji o nespecifickou vazbu nebo kros-reaktivitu primární protilátky s epitopy jiných nebo příbuzných proteinů. Pracovní postup: 1. Příprava polyakrylamidového gelu akrylamid používaný na přípravu gelu je v monomerní formě silně neurotoxický jed. Proto celou dobu přípravy polyakrylamidového gelu budeme pracovat výhradně v rukavicích!!! a. Destilovanou vodou a etanolem důkladně očistíme a poté vysušíme skla, pro jeden gel vždy dvojice 1.5mm sklo se spacerem a krycí sklo, skla přiložím k sobě podle obrázku, umístíme do držáku, srovnáme spodní hranu skel a zaaretujeme v držáku, následně umístíme do nalévacího stojánku (viz. obrázek). - 13 -
b. Příprava separačního gelu (running gel) dle tabulky: připravit running gel podle tabulky v uvedeném pořadí nalít mezi skla do výšky asi 5 cm zakápnout 2-butanolem 1 gel 2 gely 4 gely 12,5% PAGE 10 ml 20 ml 40 ml 10% APS* 50 μl 100 μl 200 μl Temed* 25 μl 50 μl 100 μl c. Odsajeme butanol filtračním papírem, propláchneme destilovanou vodu a opět vysušíme filtračním papírem připravíme si koncentrační gel (stacking gel) podle tabulky promíchat směs vložíme 1,5 mm 10-ti jamkový hřebínek 1 gel 2 gely 4 gely 5,0% PAGE 2,5 ml 5 ml 10 ml 10% APS 25 μl 50 μl 100 μl Temed 12,5 μl 25 μl 50 μl d. Poté, co gel zpolymeruje (zkontrolujeme opět podle polymerizace nepoužitých zbytků směsi ve falkonce), opatrně vyjmeme hřebínek a starty promyjeme elektroforetickým pufrem, abychom se zbavili zbytků nezpolymerovaného akrylamidu. e. Gel se skly vložíme do aparatury a zalijeme elektrodovým pufrem 1xRB (10xRB: 25 mm Tris; 192 mm glycin; 0,1% SDS, ph 8,3). - 14 -
2. Příprava vzorků 2xCSB obsahuje -merkaptoetanol, který silně zapáchá, proto pokud jej budeme přidávat do vzorku budeme pracovat v digestoři!!! a. Ze vzorků připravených IVTT rekcí (viz. První úloha) odebereme z každé zkumavky po 5 ul: IVTT-p73alfa 5 ul a IVTT-p73alfa 5 ul. Do každé zkumavky přidáme 7,5 l vody a přidáme 12,5 l 2xCSB (100 mm Tris-HCl, ph 6,8; 100 mm -merkaptoetanol; 2% SDS; 0,1% bromfenolová modř; 20% glycerol). Připravit 1x CSB (viz. Tabulka) b. Vzorky poté povaříme na termobloku při 99 C po dobu 5 min, zcentrifugujeme. c. Vzorky naneseme do sestavené elektroforetické aparatury s již připravenými gely, které jsou zality elektrodovým pufrem (RB). Do první dráhy naneseme 3,5 l směsi markerů molekulových hmotností (BioRad). Do dalších startů budeme pipetovat vlastní připravené vzoky a kontrolní vzorky dle následující tabulky. Tabulka - nanášení vzorků na SDS-PAGE jamka Objem (ul) 1 Marker 3,5 2 IVTT - p73 alfa 10 3 IVTT - p73 alfa 5 4 IVTT - p73 delta 10 5 IVTT - p73 delta 5 6 Kontrolní vzorek - 1 10 7 Kontrolní vzorek - 1 5 8 Kontrolní vzorek - 2 10 9 Kontrolní vzorek - 2 5 10 1x CSB* 10 *1xCSB připravit naředěním 2XCSB (1 díl 2xCSB a 1 díl vody) - 15 -
3. Elektroforéza a. Elektroforetickou aparaturu s nanesenými vzorky uzavřeme víkem s konektory a připojíme na zdroj napětí. b. Na zdroji nastavíme nejprve napětí 80 V (15-20 min) poté zvýšíme napětí na 170 V (50-60 min) a necháme probíhat elektroforézu dokud čelo představované bromfenolovou modří nedosáhne spodního okraje gelu. 4. Transfer proteinů z gelu na membránu bloting V mezičase než doběhne elektroforéza, připravíme nitrocelulozovou membránu a blotovací papíry, které budeme potřebovat v následujícím kroku. a. Připravit 4 blotovací papíry velikosti 10x7 cm. b. Připravit nitrocelulozou membránu velikosti 9x6 cm (membrána je mezi dvěma papíry, nedotýkat se přímo membrány, stříhat v rukavicích, následně manipulovat s membránou pomocí pinzety) c. Blotovací papíry a membránu ponoříme do roztoku Transferového pufru (TB) a necháme stát. Do TB ponoříme i 2 blotovací polštářky (pro 1 gel), které budeme potřebovat pro sestavení blotovací kazety. Zbylý TB dáme vychladit do ledničky. Pokračování po dokončení SDS-PAGE d. Vypneme zdroj, vyjmeme skla z apratury a poté opatně odělíme gel. e. Gel necháme 5 minut ekvilibrovat v Transferovém pufru (TB) f. Sestavení blotovací kazety (viz. Obrázek) Na podnos umístíme blotovací držák černou stranou dolů Na spodní stranu umístíme nejprve blotovací polštářek, na něj 2 ekvilibrované blotovací papíry. Přes blotovací papíry přejedeme zkumavkou abychom odstranili případné vzduchové bubliny. Na blotovací papíry umístíme gel, na gel položíme membránu (brát pinzetou). Následně opět položíme 2 blotovací papíry a odstraníme případné vzduchové bubliny. Nakonec opět přidáme blotovací polštářek. Celou kazetu uzavřeme a zajistíme. - 16 -
g. Blotovací kazetu umístíme do blotovací aparatury černou stranu kazety na černou stranu aparatury. (viz. Obrázek). Aparaturu umístíme do vany a zalijeme vychlazeným TB pufrem. Do vany přidáme míchadlo. h. Celou blotovací aparaturu umístíme do komorové lednice (4 C) na míchačku a připojíme ke zdroji napětí i. Blotujeme 60 minut při napětí 100 V - 17 -
5. Kontrola transferu proteinů pomocí Ponceau S a. Vypneme zdroj, rozebereme blotovací aparaturu a blotovací kazetu. Membránu ostřihneme dokola přesně na velikost gelu. Označíme vrchní stranu membrány (číslo skupiny). Pokud správně proběhl bloting měli bychom vidět na membráně přeblotované standardy. b. Membránu umístíme do krabičky a necháme barvit v Ponceau S asi 1 minutu. Membránu přemístíme do krabičky s 1xPBS a lehce odmyjeme zbytky Ponceau (nesmíme promývat příliš dlouho, barvení je reverzibilní a rychle bledne). Provedeme vizuelní kontrolu provedeného blotingu. c. Membránu následně kompletně odbarvíme v PBS 6. Blokování membrány Pro blokování membrány dopředu připravíme blokovací roztok: 1xPBS + 5% sušeného mléka (Na jeden gel budeme potřebovat 100 ml, je nutné dobře rozmíchat mléko) a. Membránu vložíme do blokovacího roztoku (30-40 ml) a umístíme na třepačku (100 rp, RT). Blokujeme 1 hodinu 7. Inkubace s protilátkami Primární protilátka (Ab) monoklonální Ab, anti-ha, supernatant Sekundární protilátka (Ab) purifikovaná polyklonální anti-myší Ab konjugovaná s POD (křenová peroxidasa) a. Membránu opláchneme pomocí PBS (30-40 ml, 2 min). Přidáme 15 ml blokovacího roztoku s primární protilátkou (ředění 1:100). Umístíme na třepačku (100 rpm a inkubujeme přes noc v komorové lednici (4 C) b. Další den slijeme primární protiláku Promyjme membránu (3x7 min.) 1x PBS + 0,05% Tween-20 2x PBS c. Přidáme 15 ml blokovacího pufru se sekundární protilátkou (ředění 1:5000). Umístíme na třepačku (100 rpm,1h) d. Promyjme membránu (3x7 min.) 1x PBS + 0,05% Tween-20 2x PBS - 18 -
8. Detekce Western blotu a. Membránu umístíme na filtrační papír, lehce vysušíme a umístíme do euroslohy. b. Připravíme detekční substrát připravit těsně před vlastní detekcí Připravíme 3 ml detekční substrátu (množství na jeden gel) smícháním složky A a B v poměru (1:1) z kitu ECL Western blot detection. c. Detekční směs nalijeme na membránu a inkubujeme 1 minutu. Poté ji odsajeme pomocí filtračního papíru. Uzavřeme euroslohu a vložíme do detekčního zařízení. d. V detekčním zařízení snímáme chemiluminiscenční signál. Seznam potřebného vybavení a chemikálií Zásobní roztok pro přípravu separačního gelu: 12.5% akrylamid:bisakrylamid 19:1; 0,375 M Tris-HCl, ph 8,8; 0,1% SDS Zásobní roztok pro koncentrační gel: 5% akrylamid:bisakrylamid 19:1; 0,125 M Tris-HCl, ph 6,8; 0,1% SDS 10% persíran amonný (APS) TEMED (N,N,N,N -tetrametyletylendiamin) RB (Elektrodový pufr): 25 mm Tris; 0,192 M glycin; 0,1% SDS, ph 8,3 IVTT směsi p73 alfa a p73 delta Proteinové standardy Prestained SDS-PAGE standards, High range (Biorad) 2xCSB: 50 mm Tris-HCl, ph 6,8; 100 mm -merkaptoetanol; 2% SDS; 0,1% bromfenolová modř; 10% glycerol odtučněné sušené mléko (Laktina): 25 mm Tris; 0,192 M glycin TB (blokovací pufr) : 25 mm Tris; 0,192 M glycin, ph 8,3, 20% methanol ECL Western blot detection kit (Amersham) Filtrační papír Pinzeta Nůžky, pravítko, euroshloha Pipety Špičky Ependorfky 1,5 ml Termoblok Elektroforetická aparatura - 19 -
Blokovací aparatura Zdroj napětí Třepačka Dokumentační systém III. Studium vazby dvou isoforem proteinu p73 na nadšroubovicovou a lineární DNA pomocí imunoprecipitace na magnetických kuličkách Princip metody: Magnetické kuličky nesoucí různé rozpoznávací částice (např. protein G, protilátky, streptavidin, oligonukleotidy, ) jsou vhodným nástrojem pro vysoce specifické zachycení, izolaci a analýzu různých molekul (DNA, RNA nebo proteinů) nebo celých buněk. Magnetické kuličky jsou využívány k různým účelům, např. ke studiu hybridizace DNA, DNA-protein interakcí, imunoprecipitace. + + capture DNA release detection antibody protein DNA magnetic beads - 20 -
Princip úlohy: V této úloze budeme sledovat vazbu dvou isoforem proteinu p73 s nadšroubovicovou DNA v přítomnosti lineární DNA (obsahující, ppgm1, nebo neobsahující, pbsk, p53 vazebnou sekvenci). Pomocí magnetických kuliček pokrytých proteinem G zachytíme imunokomplex protilátka-protein-dna vytvořený za optimálních podmínek v roztoku. Působením SDS a zahřátím vzorku na 65 C uvolníme navázanou DNA z komplexu, a tu pak analyzujeme pomocí gelové elektroforézy (barvení ethidium bromidem nebo SYBR Greenem). POSTUP: 1) do 4 eppendorfek připravíme vzorky dle rozpisu, ve vazebném prostředí (5 mm Tris, 50 mm KCl, 2 mm DTT, 0,01% Triton) smícháme nejdříve danou protilátku a protein p73, necháme inkubovat 15 minut v ledové lázni 2) přidáme DNA podle rozpisu a necháme na ledové lázni 20 minut 3) mezitím připravíme do 1 eppendorfky 50 ul magnetických kuliček 4) promyjeme (na vortexu) 3x400 ul pufrem (5 mm Tris, 50 mm KCl, 2 mm DTT, 0,01% Triton), tzn. resuspendování kuliček na vortexu, na magnetu odebrání špinavého pufru a přidání čistého 5) roztok kuliček před posledním odebráním pufru rozpipetujeme do 4 eppendorfek a odebereme pufr 6) ke kuličkám (bez pufru) přidáme preinkubovaný imuno-komplex 7) necháme inkubovat v termomixeru 2 cykly 10 minut při 10 C (1 cyklus = 1 min třepat při 900 ot/min, 9 min třepat při 450 ot/min) 8) dáme do magnetu, odebereme roztok, promyjeme 3x100 ul pufru (protřepeme v ruce) 9) zároveň necháme zahřát termomixer na 65 C, nastavíme 5 minut, 500 ot/min 10) ke kuličkám přidáme 15 ul 0.5% SDS, protřepeme 11) necháme zahřát na 65 C, 5 min, 500 ot/min. 12) stočíme na minicentrifuze, epp. dáme do magnetu a roztok odebereme do čistých epp. s 2 ul barvy 13) naneseme na gel (1,3% agarozový gel, pufr 1xTAE) 14) necháme jet 30 min při 120 V, lab. teplota) 15) obarvení gelu Et-Br nebo SYBR Greenem, snímání gelu na LAS-3000-21 -
KONTROLY: scdna a lindna, které nebyly vázané přes magnetické kuličky Příprava: 1 ul sc nebo lindna (200 ng) + 1 ul barvičky (obs. SDS) + 9 ul vody vzorek č. 1 2 3 4 5 6 7 8 sc/lin DNA B/B B/P B/B B/P P/B P/P P/B P/P vých. konc. sc DNA 660 ug/ml 0,6 0,6 0,6 0,6 2,5 2,5 2,5 2,5 linb DNA 127 ug/ml 3,1-3,1-3,1-3,1 - linp DNA 190 ug/ml - 2,1-2,1-2,1-2,1 KCl 500 mm 2 2 2 2 2 2 2 2 VP 10x 2 2 2 2 2 2 2 2 DTT 20 mm 2 2 2 2 2 2 2 2 protilátka 1100 ug/ml 0.4 0.4 0.4 0.4 0,4 0,4 0,4 0,4 p73 alfa 5 5 - - 5 5 - - p73 delta - - 5 5 - - 5 5 voda 4,9 5,9 4,9 5,9 3 4 3 4 Příprava agarózového gelu GEL: 0,33 g agarózy 0,5 ml 50xTAE 25 ml vody smícháme vše v erlenmayerově nádobě, necháme rozvařit v mikrovlnné troubě, dovážíme na původní objem, erlenku mírně zchladíme pod tekoucí vodou, nalejeme do gelového nosiče s hřebínkem pro 8 startů, necháme ztuhnout Seznam potřebného vybavení a chemikálií Pipety, špičky, mikrozkumavky Termoblok Zdroj napětí Dokumentační systém Zásobní roztok 50xTAE, DNA, vazebný pufr, KCl, DTT, protilátka anti-ha Magnetické kuličky s proteinem G, magnet - 22 -
Kapitola 2: Elektrochemická detekce poškození DNA a monitorování látek poškozujících DNA Živé organizmy jsou neustále vystavovány působení chemických a fyzikálních vlivů, které často vedou k poškození DNA. Různým způsobem poškozená DNA pak přestává plnit svoji hlavní úlohu v buňce, kterou je uchovávání a přenos genetické informace. Toto poškození často vede ke změně genetické informace (mutaci), která může být příčinou vzniku zhoubného bujení. Jedním z významných důsledků poškození DNA je přerušení cukrfosfátové páteře (dochází ke vzniku jedno nebo dvojřetězcových zlomů). Tento druh poškození DNA lze velmi citlivě detekovat měřením elektrochemických signálů DNA citlivých ke změnám její struktury (pík CA v cyklické voltametrii, pík 3 v AC voltametrii (ACV) na visící rtuťové kapkové elektrodě (HMDE)). I. Detekce poškození DNA na rtuťových elektrodách HMDE modifikovaná scdna jako senzor pro stanovení látek poškozujících DNA Princip a cíl: Měření ACV píku 3 na HMDE je jednou z nejcitlivějších elektrochemických metod pro detekci výskytu jedno nebo dvojřetězcových zlomů v DNA. Díky ireverzibilní adsorpci nukleových kyselin na povrch rtuti lze připravit HMDE modifikovanou superhelikální DNA (scdna). Takto modifikovaná HMDE pak může sloužit jako senzor pro stanovení koncentrace látek poškozujících DNA. Jako modelové vzorky budou použity tzv. chemické nukleázy (komplexy přechodných kovů, které poskytují Fentonovu reakci, při které vznikají hydroxylové radikály) a enzym DNasa I, který do DNA zavádí jedno a dvouřetězcové zlomy. Cílem úlohy je stanovení koncentrace neznámého vzorku látky poškozující DNA. - 23 -
Pracovní postup: 1. Připravíme vzorek scdna (C = 40 g/ml, V = 60 l) v 0,2 M NaCl. 2. Provedeme kontrolní měření nepoškozené scdna, pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí ACV (AdTS ACV). 3. Za použití AdTS ACV naměříme kalibrační závislost pro tři koncentrace modelového vzorku poškozujícího činidla (detaily experimentu budou sděleny na základě výběru činidla). 4. Změříme neznámý vzorek a z kalibračního grafu určíme koncentraci poškozujícího činidla. Seznam potřebného vybavení a chemikálií: - potenciostat (Autolab) - elektrodový systém (663 VA-stand), pracovní elektroda: HMDE, referentní elektroda: Ag/AgCl/3M KCl, pomocná elektroda: platinový drát - základní elektrolyt: roztok 0,3 M NaCl a 50 mm Na 2 HPO 4 - roztoky: CuSO 4, FeCl 2, EDTA, 1,10 fenanthrolin, kyselina askorbová, H 2 O 2, MgSO 4, CaCl 2, Tris (ph 7,5) - DNasa I - scdna II. Detekce poškození DNA na uhlíkových elektrodách Princip a cíl: Na uhlíkových elektrodách (např. elektroda z pyrolytického grafitu, PGE) podléhají zbytky purinových bází (A a G) elektrochemické oxidaci za vzniku analyticky využitelných voltametrických signálů (pík A ox a G ox ). Tyto signály nejsou citlivé ke změnám ve struktuře DNA. Cílem úlohy je ověřit, že strukturní změny způsobené účinkem látek zavádějících do DNA jedno a dvouřetězcové zlomy nejsou pomocí měření oxidačních signálů scdna detekovatelné. - 24 -
Pracovní postup: 1. Připravíme vzorek scdna (C = 40 g/ml, V = 60 l) v 0,2 M NaCl. 2. Provedeme kontrolní měření nepoškozené scdna, pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí square wave voltametrie (AdTS SWV) na PGE. 3. Připravíme tři vzorky obsahující scdna a různé koncentrace vybraného poškozujícího činidla. Po inkubaci (1 min) budou vzorky proměřeny pomocí AdTS SWV na PGE (detaily experimentu budou sděleny na základě výběru činidla). Seznam potřebného vybavení a chemikálií: potenciostat (Autolab) elektrodový system (663 VA-stand), pracovní elektroda: PGE, referentní elektroda: Ag/AgCl/3M KCl, pomocná elektroda: platinový drát základní elektrolyt acetátový pufr (ph 5,0) roztoky: CuSO 4, FeCl 2, EDTA, 1,10 fenanthrolin, kyselina askorbová, H 2 O 2, MgSO 4, CaCl 2, Tris (ph 7,5) Dnasa I scdna III. Kontrola štěpení DNA na agarózovém gelu Princip a cíl: Elektroforéza v agarózovém gelu je jednou z klasických metod studia struktury a strukturních přechodů DNA. V silném elektrickém poli dochází k rozdělení nabitých molekul biopolymerů. Cílem úlohy je ověřit míru poškození scdna vybraným činidlem. Pracovní postup: 4. Připravíme vzorky scdna a scdna po inkubaci (1 min.) s různými koncentracemi vybraného poškozovacího činidla. (detaily experimentu budou sděleny na základě výběru činidla) 5. Provedeme elektroforézu v agarózovém gelu. 6. Gel obarvíme a vyhodnotíme. - 25 -
Seznam potřebného vybavení a chemikálií: zdroj napětí elektroforetická aparatura roztoky: CuSO 4, FeCl 2, EDTA, 1,10 fenanthrolin, kyselina askorbová, H 2 O 2, MgSO 4, CaCl 2, Tris (ph 7,5) DNasa I scdna - 26 -
Kapitola 3: Využití elektroaktivních značek pro identifikaci nukleotidových sekvencí Princip: Některé analytické a diagnostické aplikace nedovolují studovat nativní DNA přímo. Proto je vhodné DNA označit, tj. připojit molekulu (nebo molekuly)- značky umožňující převést detekci nativní DNA na detekci této značky. Dosud byla navržena řada molekul ve funkci značky, možností jejich navázání na DNA i metod jejich detekce. Jedním z možných způsobů přípravy značené DNA je navázání deoxynukleotidů nesoucích značku k řetězeci DNA pomocí enzymů (nejčastěji polymeráz). I. Analýza nukleotidových sekvencí pomocí DNA značené terminální transferázou Princip a cíl: Terminální deoxynukleotidyl transferáza (TnT) je enzym podobný polymerázám, který je schopen připojovat nukleotidy k 3 konci řetězce DNA. Na rozdíl od polymeráz však pracuje bez přítomnosti templátu. Nukleotidy jsou připojovány náhodně a tak dlouho, dokud není reakce limitována nějakým faktorem (např. množstvím nukleotidů v reakční směsi, velikostí značky,...). Cílem této úlohy je připravit DNA nesoucí úsek elektroaktivně značených nukleotidů pomocí TnT. Použitím této DNA, která pak bude sloužit jako sonda pro elektrochemickou detekci hybridizace DNA s využitím magnetických částic, určete, ke které z cílových DNA je tato sonda komplementární. - 27 -
Pracovní postup: A) Značení DNA sondy (60 minut) 7. Každá skupina připraví vzorek o celkovém obsahu 50 μl, který bude obsahovat: 10 μg/ml DNA (sondy - wt273-tnt) (zásobní roztok 100 μg/ml) 1x pufr pro terminální transferázu (zásobní roztok 10x koncentrovaný) 1x CoCl 2 (zásobní roztok 10x koncentrovaný) 0,75 μl enzymu TnT voda 100 μm nukleotid - skupina a) dgtp (zásobní roztok 1mM) b) dgtp-no 2 (zásobní roztok 1mM) c) deaza-dgtp (zásobní roztok 1mM) 8. Nechte inkubovat v termobloku 30 min / 37 C / netřepat. B) Hybridizace na magnetických částicích (MBT) (75 minut) Příprava MBT a hybridizace 1. Odeberte 40 μl rozotku MBT (Magnetic beads d(t) 25 - částice nesoucí oligonukleotidy polyt 25 ) do čistých eppendorfek, postavte je do magnetického koncentrátoru, počkejte až se MBT přitáhnou ke stěně, odeberte roztok, přidejte 100 μl 0,3 M NaCl / 10 mm Tris, protřepejte na vortexu, stočte na centrifuze. Postup 2x opakujte. - 28 -
2. Rozdělte MBT na poloviny do 2 čistých eppendorfek. 3. Připravte vzorky značené sondy s 2 cílovými DNA, aby obsahovaly 20 μl značené sondy (připraveno v A) ) + 6,7 μg/ml cílové DNA X a Y (zás. roztok 100 μg/ml, jen jedna z nich je komplementární k sondě) + 0,3 M NaCl (zás. roztok 2,5 M) + doplňte vodou do 30 μl. 4. Odeberte roztoky od MBT připravených v bodu 2 pomocí magnetu. K MBT přidejte vzorky připravené podle bodu 3. 5. Nechte inkubovat v termobloku zchlazeném na 20 C / 20 min / třepat 1000 rpm. Promytí: 6. Vzorky dejte na magnet, odeberte roztok, přidejte 100 μl PBS + Tween 20, protřepejte na vortexu, stočte na centrifuze. Postup 3x opakujte. Poté proveďte 3x totéž s roztokem 0,3 M NaCl / 10 mm Tris. Denatrurace: 7. Na magnetu odeberte roztok od MBT a přidejte do každé eppendorfky 20 μl vody (Sigma), dejte do termobloku vyhřátého na 75 C / 2 min / 1200 rpm. 8. Pomocí magnetu přeneste roztoky nad MBT do čistých eppendorfek = vaše vzorky, MBT vyhoďte. 9. Ke vzorkům přidejte NaCl, aby výsledná konc. byla 0,3 M (zás. roztok 2,5 M). C) Měření (40 min) Skupina a) a b) provede měření pomocí visící rtuťové kapkové elektrody na potenciostatu Autolab metodou cyklická voltametrie v mravenčanu jako základním elektrolytu. Skupina c) provede měření pomocí pyrolitické grafitové elektrody na potenciostatu CH Instruments metodou square wave voltametrie v acetátovém pufru jako základním elektrolytu. Získané výsledky porovnejte mezi skupinami. - 29 -