Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 24 Speciální metody Mikro HPLC, kapilární HPLC a LC na čipu Většina v současnosti používaných kolon má vnitřní průměr 4,6 mm, i když mají dvakrát větší spotřebu solventu a jejich účinnost není lepší než u kolon o průměru 3,2 mm. Je ale řada dobrých důvodů pro zmenšení jejich průměru: Spotřeba solventu klesá s druhou mocninou průměru kolony. Mikrokolony jsou nezbytné pro stopové analýzy a při malých množstvích vzorku. Některé spřažené techniky LC-MS preferují nízké průtoky eluentu. K dosažení vyššího počtu teoretických pater jsou třeba kolony s malým, dokonce velmi malým, vnitřním průměrem. Kolony se dají rozdělit do tří kategorií: Otevřené kapiláry (open capillaries). Kapilára s vnitřním průměrem menším nebo rovným 50 µm, která má chemicky modifikován povrch nebo kapalný film jako stacionární fázi, ta je normální nebo reverzní. Plněné kapiláry (packed capillaries). Je možné plnit kapiláry o rozměrech 15 cm 75 µm běžnými HPLC fázemi nebo monolity. Mikrokolony. Ty jsou podobné obvyklým HPLC kolonám, ale mají průměr do 1 mm. Otevřené kapiláry s průměrem do 5 µm a 10 6 teoretickými patry jsou poměrně snadno připravitelné. Teorie ukazuje, že kapiláry s průměrem menším než 10 µm vynikají nad
plněnými kolonami z hlediska separační kapacity píků, rozlišení a doby analýz. S malým průměrem kapilár ale souvisí mnohé problémy, které nicméně principiálně jsou technicky řešitelné (objem nástřiku pouze 50 pl, průtok 2 nl ml -1 ). Plněné kolony poskytují vyšší separační kapacitu, tzn. množství nástřiku vzorku může být větší než u otevřených kapilár. Nevýhodou kolon je nižší permeabilita. Mikrokolony o vnitřním průměru do 1 mm (ocelové kolony s vnějším průměrem 1/16 ) jsou komerčně dostupné a nabízejí výhody vyšší citlivosti a úspory solventu. Požadavky na instrumentaci jsou následující: čerpadlo 25 250 µl min -1 objem vzorku 0,2 1 µl (maximální zatížení kolony je 10 µl vzorku) objem detekční cely 0,5 1 µl Navíc jsou používány ještě kolony z taveného křemene (fused-silica) s vnitřním průměrem kolem 0,2 mm. V obrázku níže je ilustrována účinnost mikro HPLC s použitím této kolony (tzv. small-bore techniky). V tělních tekutinách bylo touto technikou identifikováno 15 žlučových kyselin, které jsou zásadní pro posouzení onemocnění jater. Tato konkrétní analýza se vyznačovala nízkou spotřebou solventu pouze 210 µl. V takto malém objemu je problematická tvorba a reprodukovatelnost gradientu. K detekci byl použit reakční detektor. V chromatogramu jsou píky popsány používanými zkratkami: UDCL = ursodeoxycholová kyselina, CL = cholová kyselina, CDCL = chenodeoxycholová kyselina, DCL = deoxycholová kyselina, LCL = lithocholová kyselina, G (předpona) = konjugát glycinu, T = kojugát taurinu.
Jinou oblastí jsou čipy s integrovanou HPLC separační cestou. Jednou možnou variantou je obdélníkový kanálek (např. 75 µm 50 µm, dlouhý několik cm), který je plněn klasickou stacionární 5 µm fází. Obdobný čipový modul velikosti kreditní karty vybavený odpovídajícím interface může být použit jako vstup do hmotnostního spektrometru s ionizací elektrosprejem. Nicméně opravdové čipy, které známe z technologie polovodičů, jsou konstruovány kompletně z křemíku litograficky nebo leptáním. Možné uspořádání je tvořeno pravidelně uspořádanými válci širokými 5 µm, které jsou umístěny ve směru toku. Mohou být provozovány v normálním módu (oxidovaný křemík) nebo v reverzním uspořádání (po derivatizaci). Na takovýchto čipech je možné provádět klasickou chromatografickou separaci, ale v současnosti jsou spíše ještě v experimentálním vývoji.
Velmi rychlá a super rychlá HPLC Rutinní analýza vyžaduje krátké doby analýz obzvláště, pokud není potřeba vzorky složitě upravovat. Požadavky na instrumentaci jsou velmi vysoké, ale příslušné systémy jsou komerčně dostupné. Jsou rozlišovány tři kategorie: Konvenční HPLC Mrtvý čas t 0 1 min Velmi rychlá HPLC Super rychlá HPLC 10 s 1 s Pro velmi a super rychlou HPLC musí být splněny následující podmínky: Musí být vysoký difúzní koeficient molekul solutu v mobilní fázi, proto musí být použita mobilní fáze s nízkou viskozitou. Žádoucí mohou být i separace za vyšší teploty. Metoda je neslučitelná se vzorky o vysoké molekulové hmotnosti. Rychlá separace je závislá na malém rozměru částic. Teorie říká, že minimální možný retenční čas je úměrný druhé mocnině průměru částic. Zajímavou možností je použití vyšších tlaků než je běžné (tedy UHPLC). Kolona musí být co nejkratší. Nejvhodnější stacionární fázi tvoří perfůzní částice a monolity. Mimokolonové objemy chromatografu musí být naprosto minimální. Nejlepším řešením je uspořádání, kde je kolona připojena k detektoru a injektoru bez dalších vnějších objemů (obrázek níže). Čerpadlo musí být schopno zajistit požadovaný průtok a tlak. Lineární tok pro daný objemový průtok roste se snižováním průměru kolony. Autosampler musí pracovat s cyklem 10 s a menším. Časová konstanta i objem cely detektoru musí být dostatečně malé, aby neovlivňovaly samotnou separaci, tzn. neměly by mít vliv na tvar píků nebo rozlišení. Zpracování dat musí být velmi rychlé.
Je zřejmé, že u velmi a super rychlé HPLC pracuje kolona daleko od svého van Deemterova minima, a tudíž nemůže pracovat s maximální účinností. Ačkoli je super rychlá HPLC spíše vhodná pro izokratickou eluci, lze ji provádět i se super rychlým gradientem. Příkladem velmi a super rychlé chromatografie je separace farmaceutických produktů v obrázku níže. Metoda je výrobcem používána rutinně pro určení rychlosti rozpuštění a uniformnosti obsahu tablety. Separovány jsou látky na snížení hypertenze, 1-clopamid, 2- dihydroergocristin, 3-reserpine, kolona rozměru 100 mm x 2.1 mm, 3 ml min -1.
Ještě rychlejší je separace zobrazená v níže uvedeném obrázku. Testovaná směs pěti komponent je rozdělena během 3 s, relativní směrodatná odchylka kvantitativní analýzy je lepší než 1,5%. Separace proběhla na koloně 25 mm x 2,6 mm, 13 ml min -1, tlak 36 MPa; 1= p-xylen, 2= anisol, 3= nitrobenzene, 4= acetophenone, 5= dipropyl phthalate.
Rychlé separace při tlaku 1000 barů: UHPLC Za zvýšeného pracovního tlaku můžeme docílit většího počtu teoretických pater. Na druhou stranu je za vyššího tlaku možné provádět i rychlejší separace se stejnou separační účinností. (Ačkoli pokud je průtok zvýšen bez ohledu na rozměr kolony, bude separace mírně horší kvůli van Deemterovu vztahu. Zvyšování průtoku není samo o sobě řešením pro optimalizaci metody.) Zkonstruovat čerpadla pro tlaky kolem 1000 barů, tak aby splnila základní požadavky na bezpulzní tok nezávislý na tlakovém spádu, není jednoduché. Nicméně dnes je to proveditelné. Požadavek vysokých píkových kapacit (např. potřebných v proteomice) vedl k tomu, že taková čerpadla jsou dnes na trhu dostupná. Technika, která využívá takto vysoké tlaky je nazývána ultra vysokoúčinná kapalinová chromatografie (ultrahigh performance liquid chromatography - UHPLC). Pořídit UHPLC čerpadlo a používat je s běžným HPLC vybavením nemá smysl. V systému musí všechny komponenty odpovídat zvýšeným tlakovým nárokům. Navíc k uspokojivým výsledkům je doporučeno použít i speciální UHPLC kolony s UHPLC fází. Obrázek níže ukazuje profil metabolitů vzorku plazmy, který byl pořízen s UHPLC-MS. Teoretické základy pro separaci až do 3000 bar byly detailně diskutovány Martinem a Guiochonem. Zdá se, že při tlacích nad 1000 bar musí být brány v potaz některé další jevy, jako je stlačitelnost mobilní fáze nebo termální efekty, které znesnadňují vývoj a optimalizaci technik v této oblasti.
HPLC s mobilní fází v nadkritickém stavu Čistá látka může být ve fázi plynné, pevné nebo kapalné (nebo dokonce v kombinaci těchto fází) v závislosti na tlaku a teplotě, vztahy jsou ukázány v grafu dole. Na konci křivky vymezující teplotu varu a rozdělující plynnou a kapalnou fázi je vyznačena oblast, kde je hustota obou fází stejná. Od kritického bodu P (šrafovaná oblast) pokračuje oblast fluidní, nebo také nadkritická, ve které není látka ani v plynném ani kapalném skupenství. Tato tekutina/fluidum může být použita/o, jako mobilní fáze pro chromatografii, v modu který je označen jako chromatografie s tekutinou v nadkritickém stavu (supercritical fluid chromatography, SFC). Mobilní fáze v nadkritickém stavu zpřístupňuje kombinaci plynové a kapalinové chromatografie, má ale i své vlastní zákonitosti. Některé efekty jsou neobvyklé a zajímavé: Difúzní koeficient analytu leží mezi difúzními koeficienty v kapalině (poměrně nízké, pro HPLC je potřeba nízký průtok) a plynu (poměrně vysoké, v GC velké rychlosti průtoku). Viskozita mobilní fáze je větší než u plynů, ale mnohem nižší než u kapalin.
Rozpustnost molekul vzorku roste s rostoucím tlakem. Gradient, ovlivňující retenční časy, může být realizován nejen změnou složení mobilní fáze, ale také změnou tlaku. Silně zadržované složky jsou rychle eluovány zvýšením tlaku. Tlak par zplyněných analytů má velký vliv na retenční časy, tato skutečnost je stejná v GC. Potenciální látky použitelné jako mobilní fáze v SFC jsou uvedeny v tabulce níže. První dvě nejsou pochopitelně vhodné pro teplotně citlivé analyty. Zatím je nejběžnější využití oxidu uhličitého jako mobilní fáze v SFC. Jelikož je oxid uhličitý nepolární, je často používán přídavek solventu, např. methanolu. Pro chromatografii v nadkritickém stavu je nezbytná instrumentace schopná zajistit přesnou kontrolu tlaku a teploty. Mobilní fáze je na správnou teplotu vyhřívána ve spirále před nástřikovým ventilem. Spirála, ventil, kolona i detektor by měly být umístěny v termostatu. Za detektorem musí být restriktor, který v celém sytému zajistí dostatečný tlak. K chromatografii mohou být použity jak kolony typu otevřených kapilár, na kterých lze dosáhnout vysokého počtu teoretických pater, tak plněné kolony, jedna z nich byla použita v případě obrázku níže pro separaci alkaloidů. Typicky používanými detektory pro SFC jsou
UV, polarimetr (pro separaci enantiomerů), MS, MS/MS a plamenový ionizační detektor (jako v GC). SFC separace alkaloidů na náplňové koloně: 1=narcotine, 2=thebaine, 3=codeine, 4=cryptopine, 5=morphine Pro SFC jsou méně vhodné polární analyty. Rozpouštědlem vzorku může být methanol, nebo jakékoli jiné méně polární rozpouštědlo. Preparativní aplikace SFC jsou možné a to i v průmyslovém měřítku (nenasycené mastné kyseliny, cyklosporiny, pythol). Předmětem zvláštního zájmu jsou také separace enantiomerů na chirálních stacionárních fázích, které mohou být provozovaných v normálním módu.
HPLC s přehřátou vodou Přehřáté kapaliny se vyznačují zajímavými vlastnostmi i pod svým kritickým bodem. Přehřátá voda při teplotách nad 100 C je obzvláště atraktivní médium. Obrázek dole ukazuje vztah mezi tlakem a bodem varu. Je např. vidět, že při teplotě 200 C je potřeba udržet tlak téměř 16 bar, aby nedošlo k varu vody. Vyšší teploty jsou používány jen vzácně, ačkoli kritický bod vody je 374 C a 220 bar. Chromatografické podmínky mohou být voleny libovolně, ale tlak musí být minimálně odpovídající hodnotě na křivce bodu varu, rovněž je možné provádět separace kdekoli v oblasti nad křivkou. S rostoucí teplotou polarita vody znatelně klesá, při 200 C je její polarita srovnatelná s polaritou methanolu. Z tohoto důvodu je možné provádět gradient s reverzní fází prostou změnou teploty čisté vody (obrázek níže). Cela detektoru musí být tlakově odolná. Jako restriktor tlaku funguje kapilára odpovídající délky a vnitřního průměru.
Separace v gradientu teploty vody použité jako mobilní fáze, teplota se měnila lineálně v rozsahu 130-220C. 1=propazin, 2=atrazin, 3=simazin, 4=ametryn, 5-terbutryn. Výhody přehřáté vody jsou evidentní: je levná, dostupná, bez negativního vlivu na životní prostředí, má výbornou transparentnost v UV oblasti a je kompatibilní s univerzálním plamenovým ionizačním detektorem. Vzrůstající teplota vede k poklesu viskozity, a tím umožňuje rychlý přenos hmoty. Většina analytů je i při vysokých teplotách stabilní, alespoň po dobu průběhu separace. Nejsou vhodné tradiční reverzní fáze, ale musí být použity speciální modifikace. Polystyreny, fáze založené na oxidu zirkoničitém nebo porézní grafit jsou také vhodné, nicméně je třeba uvažovat individuální tepelnou stabilitu těchto fází. Separace s přehřátou vodou mohou být prováděny na plněných kapilárách i na HPLC kolonách klasických průměrů. Elektrochromatografie Mobilní fáze nemusí být přes kapiláru nebo kolonu hnána pouze pomocí čerpadla, ale můžeme použít i elektroosmotický tok. To znamená využít skutečnosti, že elektrická dvojvrstva se vytvoří na všech vrstvách rozhraní. Křemenné sklo má povrch pokrytý vázaným negativním nábojem a roztok v kontaktu s povrchem tvoří pozitivní náboj na rozhraní. Jestliže
je aplikován potenciálový gradient kolem 50 kv m -1, roztok protéká směrem k negativně nabité elektrodě. Technika má zřejmé následující výhody: Rychlostní profil není parabolický, jako při aplikaci čerpadla, ale obdélníkový. Rozšiřování píků způsobené příspěvkem nerovnoměrné distribuce proudění (A) klesá. Z tohoto důvodu není třeba používat otevřené kapiláry s velmi malým průměrem. Získaná účinnost separace je nezávislá na průměru kapilár. Jejich délka může být volena s ohledem na požadavky a nemusí být brán v úvahu odpor proti proudění. Účinnost separace je stejně vysoká jako v plynové chromatografii. Tím, že se nemusí uvažovat odpor, mohou být kapiláry plněny velmi malými částicemi ( 1 µm). Redukovaná výška patra h je nižší než 2, to znamená lepší než u klasické HPLC. Mobilní fáze musí být vodivá. Používají se pufry o koncentracích mezi 0,001 a 0,1 mol l -1. Lineární rychlost toku je řádově 1 mm s -1. Nevýhodou je silné zahřívání mobilní fáze během toku. Z tohoto důvodu je nezbytné zajistit efektivní chlazení a plyne z něj i omezení v průměru kapilár. Přechod ke kapilární elektroforéze, kde musí mít molekuly vzorku náboj (na rozdíl od kapilární elektrochromatografie) není přesně definován.