V RÁMCI UDRŽITELNOSTI PROJEKTU POŘÁDÁME POKROČILÝ KURZ MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY NÁVODY KE CVIČENÍM BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. EDITOVAL: VÁCLAV BRÁZDA BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I.
POKROČILÝ KURZ MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY NÁVODY KE CVIČENÍM BIOFYZIKÁLNÍ ÚSTAV AV ČR, V.V.I. MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY: POKROČILÉ PRAKTICKÉ VZDĚLÁVÁNÍ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII OPERAČNÍ PROGRAM VZDĚLÁVÁNÍ PRO KONKURENCESCHOPNOST ČÍSLO PROJEKTU: CZ.1.07/2.3.00/09.0046
Editoval: Mgr. Václav Brázda, Ph.D. a,b a Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, v.v.i. Královopolská 135 612 65 Brno Česká republika b CEITEC - Středoevropský technologický institut Masarykova univerzita Kamenice 3 62500 Brno Česká republika POKROČILÝ KURZ ANALÝZY STRUKTURY A INTERAKCÍ BIOMAKROMOLEKUL návody ke cvičením editoval: Václav Brázda autoři: Václav Brázda, Marie Brázdová, Miroslav Fojta, Luděk Havran, Iva Kejnovská, Petr Orság, Hana Pivoňková Vydal: Biofyzikální ústav Akademie věd České republiky, v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Česká republika Brno 2013 Česká Republika Druhé upravené vydání ISBN: 978-80-87541-08-1-4 -
- 5 -
- 6 -
Obsah Kapitola 1: Studium vazby různých isoforem proteinu p73 na DNA... 9 I. Příprava rekombinantních proteinů p73 pomocí eukaryotického bezbuněčného expresního systému (in vitro transkripce/translace, IVTT)... 9 II. Separace rekombinantních proteinů p73 připravených pomocí IVTT na SDS PAGE a jejich následná detekce pomocí Western blotu... 12 III. Studium vazby dvou isoforem proteinu p73 na nadšroubovicovou a lineární DNA pomocí imunoprecipitace na magnetických kuličkách... 22 Kapitola 2: Elektrochemická detekce poškození DNA a monitorování látek poškozujících DNA... 25 I. Detekce poškození DNA na rtuťových elektrodách HMDE modifikovaná scdna jako senzor pro stanovení látek poškozujících DNA... 25 II. Detekce poškození DNA na uhlíkových elektrodách... 26 III. Kontrola štěpení DNA na agarózovém gelu... 27 Kapitola 3: Využití elektroaktivních značek pro identifikaci nukleotidových sekvencí... 29 I. Analýza nukleotidových sekvencí pomocí DNA značené terminální transferázou... 29 II. Analýza nukleotidové sekvence metodou primer extension... 32 Kapitola 4: Využití spektroskopie cirkulárního dichroismu při sledování konformačních přechodů DNA... 34 I. Kooperativní přechod... 34 II. Nekooperativní přechod... 35 III. Termální denaturace kvadruplexů DNA... 37 Kapitola 5: Analýza proteinů a komplexů proteinů s DNA... 38 I. Elektroforéza proteinů v přítomnosti SDS SDS PAGE... 38 II. Stanovení koncentrace proteinů podle Bradfordové... 41 III. Přímé stanovení koncentrace proteinů při 280nm... 43 IV. EMSA Gelová retardační analýza... 44-7 -
- 8 -
Kapitola 1: Studium vazby různých isoforem proteinu p73 na DNA I. Příprava rekombinantních proteinů p73 pomocí eukaryotického bezbuněčného expresního systému (in vitro transkripce/translace, IVTT) Princip úlohy: Využití bezbuněčných systémů patří k velmi rozšířeným metodám přípravy rekombinantních proteinů.tyto systémy dnes umožňují velice rychlou a snadnou přípravu relativně dostatečného množství rekombinantních proteinů, které lze následně využít v celé řadě funkčních studií. Tradičně se používá k ověření čtecích rámců, studia proteinových mutací, studia protein:proteinových, protein:dna vazebných interakcí, stanovení aktivity proteinů atd. V poslední době se těchto metod používá k potvrzení výsledků metod interakce proteinů ve 2-hybridních systémech, provedení in vitro expresního klonovaní a pro přípravu proteinových substrátů pro studium aktivity a modifikace enzymů atd. Bezbuněčné expresní systémy lze primárně rozdělit dle typu použitého expresního systému bud na prokaryotické (S30 E.coli extrakt) nebo eukaryotické {králičí retikulocytární extrakt (Rabbit reticulocyte extract), extrakt z pšeničných klíčků (wheat germ extract)}. V obou případech je příprava rekombinantních proteinů provedena translací in vivo nebo in vitro připravené mrna. V současné době se, zejména s ohledem na problémy s manipulací s in vivo izolovanou mrna, častěji uplatňuje přístup využívající kombinaci prokaryotické transkripce pomocí fágové RNA polymerázy (T7, T3, SP6) a následné translace během jediné reakce, tzv. systémy spojené in vitro transkripce a translace (in vitro transcription and translation systems, IVTT). Pro tyto spojené IVTT expresní systémy pak lze jako templáty pro transkripci a následnou translaci využít připravené DNA expresní vektory. Příslušná mrna daného proteinu se generuje transkripcí z úseku DNA z vektoru pod příslušným promotorem (T3, T7, SP6 součásti většiny expresních vektorů). - 9 -
Pro následnou translaci je v závislosti na použitém translačním systému nutná přítomnost dalších regulačních sekvencí v promotoru expresního vektoru: místo vazby ribozomu (RBS site, ribosome binding site) exprese v prokaryotických expresních systémech, Kozakova sekvence (Kozak sequence) exprese v eukaryotických expresních systémech. Cílem úlohy je příprava dvou rekombinantních isoforem proteinu p73 (p73alfa a p73delta) z připravených expresních vektorů pcdna3.1/p73alfa a pcdna3.1/p73delta pomocí eukaryotického expresního systému T7 TNT Quick Coupled Transcription/Translation System. Princip metody IVTT TNT Qick Master Mix + DNA templát Nuclease free voda inkubace 30 C, 60 min rekombinantní protein Postup: 1. Vyjmout kit T7 TNT Quick Coupled Transcription/Translation (Promega) z mrazáku -70 C. Rychle rozmrazit zkumavky s T7 TNT Quick master mix zahřátím v ruce, pak umístit na led. Rozmrazit ostatní komponenty reakce při laboratorní teplotě a umístit je na led. 2. Zapnout termostat a nastavit teplotu na 30 C 3. Přípravit a popsat dvě ependorky, označit číslem skupiny: zkumavka č.1 - p73 alfa a zkumavka č.2 - p73 delta. 4. Napipetovat postupně do připravených zkumavek jednotlivé komponenty reakce dle tabulky. Po napipetování všech komponent mírně promíchat pipetováním a následně krátce stočit na centrifuze pro odstranění případných bublin. 5. Zkumavky umístit do termostatu a inkubovat 60 minut při 30 C - 10 -
Tabulka Zkumavka č.1: Zkumavka č.2: p73 alfa p73 delta Komponenty Objem (ul) Objem (ul) Nuclease-free voda 2,9 3 Methionin (1mM) 0,4 0,4 Plazmidová DNA: p73 alfa (330 ng/ul) 2,3 - Plazmidová DNA: p73 delta (1080 ng/ul) - 0,7 TNT Quick Master mix 14,4 15,9 Celkový objem 20 20 Seznam potřebného vybavení a chemikálií Kit T7 TNT Quick Coupled Transcription/Translation System (Promega) 1 mm Methionin Nuclease-free voda Plazmidová DNA pcdna3.1/p73alfa a pcdna3.1/p73delta Pipety Špičky Zkumavky 1,5 ml Nádobka na led a led Centrifuga Termoblok - 11 -
II. Separace rekombinantních proteinů p73 připravených pomocí IVTT na SDS-PAGE a jejich následná detekce pomocí Western blotu Princip úlohy: Western blot (česky označovaný někdy termínem imunoblot) je technika kombinující separaci proteinů pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy (PAGE) s transferem proteinů na membránu a jejich následnou detekcí pomocí specifických protilátek. Je to v současné době rutinní technika, která se používá jak k detekci proteinů z komplexních směsí, tak k monitorování exprese a purifikace proteinů. Touto metodou se v praxi diagnostikuje řada infekčních onemocnění člověka a zvířat. Oproti běžným sérologickým metodám, jako je ELISA, je Western Blot sice časově náročnější a dražší, ale za to přesnější (větší specificita). Western blot poskytuje jednak kvalitativní (velikost proteinu dle standardu) tak i semikvantitativní data (srovnání se vzorkem o známé koncentraci) o analyzovaném proteinu. Metodika Western blotu zahrnuje celkem 5. fází: 1. Fáze: Gelová elektroforéza První část se skládá z polyakrylamidové gelové elektroforézy v přítomnosti dodecyl sulfátu sodného (SDS, laurylsíran sodný) SDS-PAGE. Proteiny jsou separovány v akrylamidovém gelu na základě jejich molekulové hmotnosti a tvoří tvz. bandy (z angl. proužky, pásky). Proteiny migrují v elektrickém poli na základě jejich tvaru (globulární proteiny migrují rychleji než vláknité) a hustoty náboje (poměr velikosti náboje k jednotce hmoty). SDS se váže na bílkovinný řetězec v poměru 1.4 g SDS na 1 g bílkoviny, přičemž délka komplexu SDS bílkovina je úměrná jeho molekulové hmotnosti. Často se disulfidické vazby v proteinu eliminují redukčním činidlem ( -merkaptoethanol) a denaturace se dokončí varem. Výsledně je jediným faktorem rozhodujícím o pohyblivosti proteinů při denaturačním SDS-PAGE jejich molekulová hmotnost. Na základě srovnání relativních mobilit neznámé bílkoviny a standardů je pak možné určit její relativní molekulovou hmotnost. - 12 -
2. Fáze: Transfer Po provedení SDS PAGE jsou rozdělené proteiny přeneseny z polyakrylamidového gelu na vhodnou membránu (PVDF, nitrocelulóza). Při kontaktu gelu s membránou v blotovacím zařízení dochází po aplikaci elektrického proudu k transferu proteinů z gelu a jejich ukotvení na membráně. Výsledkem je kopie proteinů separovaných na gelu. Efektivita přenosu závisí na celé řadě faktorů: složení gelu, doba přenosu, velikost a vlastnosti proteinů, přítomnosti detergentů a alkoholu v elektrodovém pufru. Optimální podmínky pro přenos proteinů jsou při použití pufrů s nízkou iontovou silou a nízkých proudových hodnot. Před dalším krokem je žádoucí kontrolovat efektivitu přenosu proteinů na membránu. Pro tuto kontrolu se využívají reversibilní barvení pomocí barviček, které neinterferují s vazbou protilátek v dalších krocích (Ponceau S) - 13 -
3. Fáze: Blokování Po transferu je nutné provést zablokování míst na membráně, kde nedošlo k navázání proteinů, a zabránit tak nespecifickým vazbám protilátek použitých v dalších krocích. Pro blokování se nejčastěji používají roztoky 1-5% odtučněného mléka nebo bovinního sérového albuminu (BSA) ve fosfátových (PBS) nebo trisových (TBS) pufrech s minimálními přídavky detergentů, jako je Tween 20 nebo Triton X-100. Použití blokačního pufru je specifické v závislosti na použitých protilátkách. 4. Fáze: Detekce V průběhu detekce je membrána inkubována s primární protilátkou, která rozeznává specifický protein(y) nebo epitop(y). Po promytí membrány (odstranění nenavázané primární protilátky) je následně inkubována se sekundární protilátkou, která rozeznává druhově specifiké struktury primární protilátky (např. anti-myší, anti-kozí, anti-králičí sekudární protilátky). Sekundární protilátka je nejčastěji konjugována s reportérovým enzymem (alkalická fosfatáza AP, křenová peroxidáza HRP). Pro vizualizaci vazby nejčastěji používané sekundární protilátky s HRP je použit chemiluminiscenční substrát. HRP katalyzuje reakci za vzniku luminiscenčního produktu, který je následně detekován pomocí rentgenových filmů nebo moderněji pomocí dokumentačních systémů 5. Fáze: Analýza Výsledkem analýzy western blotu by (v ideálním případě detekce určitého proteinu) mělo být zviditelnění jednoho,,bandu na membráně odpovídající tomuto proteinu (závisí zejména na volbě použité primární protilátky a na celkovém provedení - 14 -
metody). Na základě srovnání jeho pozice vůči standardu můžeme určit přibližnou velikost proteinu. V případě, že výsledkem western blotu je přítomnost více,,bandů, než by mělo odpovídat našemu proteinu, jedná se o nejčastěji o nespecifickou vazbu nebo kros-reaktivitu primární protilátky s epitopy jiných nebo příbuzných proteinů. Pracovní postup: 1. Příprava polyakrylamidového gelu akrylamid používaný na přípravu gelu je v monomerní formě silně neurotoxický jed. Proto celou dobu přípravy polyakrylamidového gelu budeme pracovat výhradně v rukavicích!!! a. Destilovanou vodou a etanolem důkladně očistíme a poté vysušíme skla, pro jeden gel vždy dvojice 1.5mm sklo se spacerem a krycí sklo, skla přiložím k sobě podle obrázku, umístíme do držáku, srovnáme spodní hranu skel a zaaretujeme v držáku, následně umístíme do nalévacího stojánku (viz. obrázek). - 15 -
b. Příprava separačního gelu (running gel) dle tabulky: připravit running gel podle tabulky v uvedeném pořadí nalít mezi skla do výšky asi 5 cm zakápnout 2-butanolem 1 gel 2 gely 4 gely 12,5% PAGE 10 ml 20 ml 40 ml 10% APS 50 μl 100 μl 200 μl Temed 25 μl 50 μl 100 μl c. Odsajeme butanol filtračním papírem, propláchneme destilovanou vodu a opět vysušíme filtračním papírem připravíme si koncentrační gel (stacking gel) podle tabulky promíchat směs vložíme 1,5 mm 10-ti jamkový hřebínek 1 gel 2 gely 4 gely 5,0% PAGE 2,5 ml 5 ml 10 ml 10% APS 25 μl 50 μl 100 μl Temed 12,5 μl 25 μl 50 μl d. Poté, co gel zpolymeruje (zkontrolujeme opět podle polymerizace nepoužitých zbytků směsi ve falkonce), opatrně vyjmeme hřebínek a starty promyjeme elektroforetickým pufrem, abychom se zbavili zbytků nezpolymerovaného akrylamidu. e. Gel se skly vložíme do aparatury a zalijeme elektrodovým pufrem 1xRB (naředit 1xRB ze zásobního roztoku 10xRB) - 16 -
2. Příprava vzorků 2xCSB obsahuje -merkaptoetanol, který silně zapáchá, proto pokud jej budeme přidávat do vzorku budeme pracovat v digestoři!!! a. Ze vzorků připravených IVTT rekcí (viz. První úloha) odebereme z každé zkumavky po 5 l: IVTT-p73alfa 5 l a IVTT-p73alfa 5 l. Do každé zkumavky přidáme 7,5 l vody a přidáme 12,5 l 2xCSB (100 mm Tris-HCl, ph 6,8; 100 mm -merkaptoetanol; 2% SDS; 0,1% bromfenolová modř; 20% glycerol). Připravit 1x CSB* (viz. Tabulka) b. Vzorky poté povaříme na termobloku při 99 C po dobu 5 min, zcentrifugujeme. c. Vzorky naneseme do sestavené elektroforetické aparatury s již připravenými gely, které jsou zality elektrodovým pufrem (1xRB). Do první dráhy naneseme 3,5 l směsi markerů molekulových hmotností (BioRad). Do dalších startů budeme pipetovat vlastní připravené vzoky a kontrolní vzorky dle následující tabulky. Tabulka - nanášení vzorků na SDS-PAGE jamka Objem (ul) 1 Marker 3,5 2 IVTT - p73 alfa 10 3 IVTT - p73 alfa 5 4 IVTT - p73 delta 10 5 IVTT - p73 delta 5 6 Kontrolní vzorek - 1 10 7 Kontrolní vzorek - 1 5 8 Kontrolní vzorek - 2 10 9 Kontrolní vzorek - 2 5 10 1x CSB* 10 *1xCSB připravit naředěním 2XCSB (1 díl 2xCSB a 1 díl vody) - 17 -
3. Elektroforéza a. Elektroforetickou aparaturu s nanesenými vzorky uzavřeme víkem s konektory a připojíme na zdroj napětí. b. Na zdroji nastavíme nejprve napětí 80 V (15-20 min) poté zvýšíme napětí na 170 V (50-60 min) a necháme probíhat elektroforézu dokud čelo představované bromfenolovou modří nedosáhne spodního okraje gelu. 4. Transfer proteinů z gelu na membránu bloting V mezičase než doběhne elektroforéza, připravíme nitrocelulozovou membránu a blotovací papíry, které budeme potřebovat v následujícím kroku. a. Připravit 4 blotovací papíry velikosti 10x7 cm. b. Připravit nitrocelulozou membránu velikosti 9x6 cm (membrána je mezi dvěma papíry, nedotýkat se přímo membrány, stříhat v rukavicích, následně manipulovat s membránou pomocí pinzety) c. Blotovací papíry a membránu ponoříme do roztoku Transferového pufru (TB) a necháme stát. Do TB ponoříme i 2 blotovací polštářky (pro 1 gel), které budeme potřebovat pro sestavení blotovací kazety. Zbylý TB dáme vychladit do ledničky. Pokračování po dokončení SDS-PAGE d. Vypneme zdroj, vyjmeme skla z apratury a poté opatně odělíme gel. e. Gel necháme 5 minut ekvilibrovat v Transferovém pufru (TB) f. Sestavení blotovací kazety (viz. Obrázek) Na podnos umístíme blotovací držák černou stranou dolů Na spodní stranu umístíme nejprve blotovací polštářek, na něj 2 ekvilibrované blotovací papíry. Přes blotovací papíry přejedeme zkumavkou abychom odstranili případné vzduchové bubliny. Na blotovací papíry umístíme gel, na gel položíme membránu (brát pinzetou). Následně opět položíme 2 blotovací papíry a odstraníme případné vzduchové bubliny. Nakonec opět přidáme blotovací polštářek. Celou kazetu uzavřeme a zajistíme. - 18 -
g. Blotovací kazetu umístíme do blotovací aparatury černou stranu kazety na černou stranu aparatury. (viz. Obrázek). Aparaturu umístíme do vany a zalijeme vychlazeným TB pufrem. Do vany přidáme míchadlo. h. Celou blotovací aparaturu umístíme do komorové lednice (4 C) na míchačku a připojíme ke zdroji napětí i. Blotujeme 60 minut při napětí 100 V - 19 -
5. Kontrola transferu proteinů pomocí Ponceau S a. Vypneme zdroj, rozebereme blotovací aparaturu a blotovací kazetu. Membránu ostřihneme dokola přesně na velikost gelu. Označíme vrchní stranu membrány (číslo skupiny). Pokud správně proběhl bloting měli bychom vidět na membráně přeblotované standardy. b. Membránu umístíme do krabičky a necháme barvit v Ponceau S asi 1 minutu. Membránu přemístíme do krabičky s 1xPBS a lehce odmyjeme zbytky Ponceau (nesmíme promývat příliš dlouho, barvení je reverzibilní a rychle bledne). Provedeme vizuelní kontrolu provedeného blotingu. c. Membránu následně kompletně odbarvíme v PBS 6. Blokování membrány Pro blokování membrány dopředu připravíme blokovací roztok: 1xPBS + 5% sušeného mléka (Na jeden gel budeme potřebovat 100 ml, je nutné dobře rozmíchat mléko) a. Membránu vložíme do blokovacího roztoku (30-40 ml) a umístíme na třepačku (100 rpm, RT). Blokujeme 1 hodinu 7. Inkubace s protilátkami Primární protilátka (Ab) monoklonální Ab, anti-ha, supernatant Sekundární protilátka (Ab) purifikovaná polyklonální anti-myší Ab konjugovaná s POD (křenová peroxidasa) a. Membránu opláchneme pomocí PBS (30-40 ml, 2 min). Přidáme 15 ml blokovacího roztoku s primární protilátkou (ředění 1:100). Umístíme na třepačku (100 rpm a inkubujeme přes noc v komorové lednici (4 C) b. Další den slijeme primární protiláku Promyjme membránu (3x7 min.) 1x PBS + 0,05% Tween-20 2x PBS c. Přidáme 15 ml blokovacího pufru se sekundární protilátkou (ředění 1:5000). Umístíme na třepačku (100 rpm,1h) d. Promyjme membránu (3x7 min.) 1x PBS + 0,05% Tween-20 2x PBS - 20 -
8. Detekce Western blotu a. Membránu umístíme na filtrační papír, lehce vysušíme a umístíme do euroslohy. b. Připravíme detekční substrát připravit těsně před vlastní detekcí Připravíme 3 ml detekční substrátu (množství na jeden gel) smícháním složky A a B v poměru (1:1) z kitu ECL Western blot detection. c. Detekční směs nalijeme na membránu a inkubujeme 1 minutu. Poté ji odsajeme pomocí filtračního papíru. Uzavřeme euroslohu a vložíme do detekčního zařízení. d. V detekčním zařízení snímáme chemiluminiscenční signál. Seznam potřebného vybavení a chemikálií Zásobní roztok pro přípravu separačního gelu: 12.5% akrylamid:bisakrylamid 19:1; 0,375 M Tris-HCl, ph 8,8; 0,1% SDS Zásobní roztok pro koncentrační gel: 5% akrylamid:bisakrylamid 19:1; 0,125 M Tris-HCl, ph 6,8; 0,1% SDS 10% persíran amonný (APS) TEMED (N,N,N,N -tetrametyletylendiamin) RB (Elektrodový pufr): 25 mm Tris; 0,192 M glycin; 0,1% SDS, ph 8,3 IVTT směsi p73 alfa a p73 delta Proteinové standardy Prestained SDS-PAGE standards, High range (Biorad) 2xCSB: 50 mm Tris-HCl, ph 6,8; 100 mm -merkaptoetanol; 2% SDS; 0,1% bromfenolová modř; 10% glycerol odtučněné sušené mléko (Laktina): 25 mm Tris; 0,192 M glycin TB (blokovací pufr) : 25 mm Tris; 0,192 M glycin, ph 8,3, 20% methanol ECL Western blot detection kit (Amersham) Filtrační papír Pinzeta Nůžky, pravítko, euroshloha Pipety Špičky Ependorfky 1,5 ml Termoblok Elektroforetická aparatura - 21 -
Blokovací aparatura Zdroj napětí Třepačka Dokumentační systém III. Studium vazby dvou isoforem proteinu p73 na nadšroubovicovou a lineární DNA pomocí imunoprecipitace na magnetických kuličkách Princip metody: Magnetické kuličky nesoucí různé rozpoznávací částice (např. protein G, protilátky, streptavidin, oligonukleotidy, ) jsou vhodným nástrojem pro vysoce specifické zachycení, izolaci a analýzu různých molekul (DNA, RNA nebo proteinů) nebo celých buněk. Magnetické kuličky jsou využívány k různým účelům, např. ke studiu hybridizace DNA, DNA-protein interakcí, imunoprecipitace. + + capture DNA release detection antibody protein DNA magnetic beads - 22 -
Princip úlohy: V této úloze budeme sledovat vazbu dvou isoforem proteinu p73 s nadšroubovicovou DNA v přítomnosti lineární DNA (obsahující, ppgm1, nebo neobsahující, pbsk, p53 vazebnou sekvenci). Pomocí magnetických kuliček pokrytých proteinem G zachytíme imunokomplex protilátka-protein-dna vytvořený za optimálních podmínek v roztoku. Působením SDS a zahřátím vzorku na 65 C uvolníme navázanou DNA z komplexu, a tu pak analyzujeme pomocí gelové elektroforézy (barvení ethidium bromidem nebo SYBR Greenem). POSTUP: 1) do 4 eppendorfek připravíme vzorky dle rozpisu, ve vazebném prostředí (5 mm Tris, 50 mm KCl, 2 mm DTT, 0,01% Triton) smícháme nejdříve danou protilátku a protein p73, necháme inkubovat 15 minut v ledové lázni 2) přidáme DNA podle rozpisu a necháme na ledové lázni 20 minut 3) mezitím připravíme do 1 eppendorfky 50 ul magnetických kuliček 4) promyjeme (na vortexu) 3x400 ul pufrem (5 mm Tris, 50 mm KCl, 2 mm DTT, 0,01% Triton), tzn. resuspendování kuliček na vortexu, na magnetu odebrání špinavého pufru a přidání čistého 5) roztok kuliček před posledním odebráním pufru rozpipetujeme do 4 eppendorfek a odebereme pufr 6) ke kuličkám (bez pufru) přidáme preinkubovaný imuno-komplex 7) necháme inkubovat v termomixeru 2 cykly 10 minut při 10 C (1 cyklus = 1 min třepat při 900 ot/min, 9 min třepat při 450 ot/min) 8) dáme do magnetu, odebereme roztok, promyjeme 3x100 ul pufru (protřepeme v ruce) 9) zároveň necháme zahřát termomixer na 65 C, nastavíme 5 minut, 500 ot/min 10) ke kuličkám přidáme 15 ul 0.5% SDS, protřepeme 11) necháme zahřát na 65 C, 5 min, 500 ot/min. 12) stočíme na minicentrifuze, epp. dáme do magnetu a roztok odebereme do čistých epp. s 2 ul barvy 13) naneseme na gel (1,3% agarozový gel, pufr 1xTAE) 14) necháme jet 30 min při 120 V, lab. teplota) 15) obarvení gelu Et-Br nebo SYBR Greenem, snímání gelu na LAS-3000-23 -
KONTROLY: scdna a lindna, které nebyly vázané přes magnetické kuličky Příprava: 1 ul sc nebo lindna (200 ng) + 1 ul barvičky (obs. SDS) + 9 ul vody vzorek č. 1 2 3 4 5 6 7 8 vých. konc. sc pbsk (ul) 200 g/ml 2 2 - - 2 2 - - sc ppgm1 (ul) 200 g/ml - - 2 2 - - 2 2 lin pbsk (ul) 200 g/ml 2-2 - 2-2 - lin ppgm1 (ul) 200 g/ml - 2-2 - 2-2 KCl 500 mm 2 2 2 2 2 2 2 2 VP 10x 2 2 2 2 2 2 2 2 DTT 20 mm 2 2 2 2 2 2 2 2 protilátka 1000 g/ml 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 protein p73α 3 3 3 3 - - - - protein p73δ - - - - 3 3 3 3 voda 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 Příprava agarózového gelu GEL: 0,33 g agarózy 0,5 ml 50xTAE 25 ml vody smícháme vše v erlenmayerově nádobě, necháme rozvařit v mikrovlnné troubě, dovážíme na původní objem, erlenku mírně zchladíme pod tekoucí vodou, nalejeme do gelového nosiče s hřebínkem pro 8 startů, necháme ztuhnout Seznam potřebného vybavení a chemikálií Pipety, špičky, mikrozkumavky Termoblok Zdroj napětí Dokumentační systém Zásobní roztok 50xTAE, DNA, vazebný pufr, KCl, DTT, protilátka anti-ha Magnetické kuličky s proteinem G, magnet - 24 -
Kapitola 2: Elektrochemická detekce poškození DNA a monitorování látek poškozujících DNA Živé organizmy jsou neustále vystavovány působení chemických a fyzikálních vlivů, které často vedou k poškození DNA. Různým způsobem poškozená DNA pak přestává plnit svoji hlavní úlohu v buňce, kterou je uchovávání a přenos genetické informace. Toto poškození často vede ke změně genetické informace (mutaci), která může být příčinou vzniku zhoubného bujení. Jedním z významných důsledků poškození DNA je přerušení cukrfosfátové páteře (dochází ke vzniku jedno nebo dvojřetězcových zlomů). Tento druh poškození DNA lze velmi citlivě detekovat měřením elektrochemických signálů DNA citlivých ke změnám její struktury (pík CA v cyklické voltametrii, pík 3 v AC voltametrii (ACV) na visící rtuťové kapkové elektrodě (HMDE)). I. Detekce poškození DNA na rtuťových elektrodách HMDE modifikovaná scdna jako senzor pro stanovení látek poškozujících DNA Princip a cíl: Měření ACV píku 3 na HMDE je jednou z nejcitlivějších elektrochemických metod pro detekci výskytu jedno nebo dvojřetězcových zlomů v DNA. Díky ireverzibilní adsorpci nukleových kyselin na povrch rtuti lze připravit HMDE modifikovanou superhelikální DNA (scdna). Takto modifikovaná HMDE pak může sloužit jako senzor pro stanovení koncentrace látek poškozujících DNA. Jako modelové vzorky budou použity tzv. chemické nukleázy (komplexy přechodných kovů, které poskytují Fentonovu reakci, při které vznikají hydroxylové radikály) a enzym DNasa I, který do DNA zavádí jedno a dvouřetězcové zlomy. Cílem úlohy je stanovení koncentrace neznámého vzorku látky poškozující DNA. - 25 -
Pracovní postup: 1. Připravíme vzorek scdna (C = 40 g/ml, V = 60 l) v 0,2 M NaCl. 2. Provedeme kontrolní měření nepoškozené scdna, pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí ACV (AdTS ACV). 3. Za použití AdTS ACV naměříme kalibrační závislost pro tři koncentrace modelového vzorku poškozujícího činidla (detaily experimentu budou sděleny na základě výběru činidla). 4. Změříme neznámý vzorek a z kalibračního grafu určíme koncentraci poškozujícího činidla. Seznam potřebného vybavení a chemikálií: - potenciostat (Autolab) - elektrodový systém (663 VA-stand), pracovní elektroda: HMDE, referentní elektroda: Ag/AgCl/3M KCl, pomocná elektroda: platinový drát - základní elektrolyt: roztok 0,3 M NaCl a 50 mm Na 2 HPO 4 - roztoky: CuSO 4, FeCl 2, EDTA, 1,10 fenanthrolin, kyselina askorbová, H 2 O 2, MgSO 4, CaCl 2, Tris (ph 7,5) - DNasa I - scdna II. Detekce poškození DNA na uhlíkových elektrodách Princip a cíl: Na uhlíkových elektrodách (např. elektroda z pyrolytického grafitu, PGE) podléhají zbytky purinových bází (A a G) elektrochemické oxidaci za vzniku analyticky využitelných voltametrických signálů (pík A ox a G ox ). Tyto signály nejsou citlivé ke změnám ve struktuře DNA. Cílem úlohy je ověřit, že strukturní změny způsobené účinkem látek zavádějících do DNA jedno a dvouřetězcové zlomy nejsou pomocí měření oxidačních signálů scdna detekovatelné. - 26 -
Pracovní postup: 1. Připravíme vzorek scdna (C = 40 g/ml, V = 60 l) v 0,2 M NaCl. 2. Provedeme kontrolní měření nepoškozené scdna, pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí square wave voltametrie (AdTS SWV) na PGE. 3. Připravíme tři vzorky obsahující scdna a různé koncentrace vybraného poškozujícího činidla. Po inkubaci (1 min) budou vzorky proměřeny pomocí AdTS SWV na PGE (detaily experimentu budou sděleny na základě výběru činidla). Seznam potřebného vybavení a chemikálií: potenciostat (Autolab) elektrodový system (663 VA-stand), pracovní elektroda: PGE, referentní elektroda: Ag/AgCl/3M KCl, pomocná elektroda: platinový drát základní elektrolyt acetátový pufr (ph 5,0) roztoky: CuSO 4, FeCl 2, EDTA, 1,10 fenanthrolin, kyselina askorbová, H 2 O 2, MgSO 4, CaCl 2, Tris (ph 7,5) Dnasa I scdna III. Kontrola štěpení DNA na agarózovém gelu Princip a cíl: Elektroforéza v agarózovém gelu je jednou z klasických metod studia struktury a strukturních přechodů DNA. V silném elektrickém poli dochází k rozdělení nabitých molekul biopolymerů. Cílem úlohy je ověřit míru poškození scdna vybraným činidlem. Pracovní postup: 4. Připravíme vzorky scdna a scdna po inkubaci (1 min.) s různými koncentracemi vybraného poškozovacího činidla. (detaily experimentu budou sděleny na základě výběru činidla) 5. Provedeme elektroforézu v agarózovém gelu. 6. Gel obarvíme a vyhodnotíme. - 27 -
Seznam potřebného vybavení a chemikálií: zdroj napětí elektroforetická aparatura roztoky: CuSO 4, FeCl 2, EDTA, 1,10 fenanthrolin, kyselina askorbová, H 2 O 2, MgSO 4, CaCl 2, Tris (ph 7,5) DNasa I scdna - 28 -
Kapitola 3: Využití elektroaktivních značek pro identifikaci nukleotidových sekvencí Princip: Některé analytické a diagnostické aplikace nedovolují studovat nativní DNA přímo. Proto je vhodné DNA označit, tj. připojit molekulu (nebo molekuly)- značky umožňující převést detekci nativní DNA na detekci této značky. Dosud byla navržena řada molekul ve funkci značky, možností jejich navázání na DNA i metod jejich detekce. Jedním z možných způsobů přípravy značené DNA je navázání deoxynukleotidů nesoucích značku k řetězeci DNA pomocí enzymů (nejčastěji polymeráz). I. Analýza nukleotidových sekvencí pomocí DNA značené terminální transferázou Princip a cíl: Terminální deoxynukleotidyl transferáza (TnT) je enzym podobný polymerázám, který je schopen připojovat nukleotidy k 3 konci řetězce DNA. Na rozdíl od polymeráz však pracuje bez přítomnosti templátu. Nukleotidy jsou připojovány náhodně a tak dlouho, dokud není reakce limitována nějakým faktorem (např. množstvím nukleotidů v reakční směsi, velikostí značky,...). Cílem této úlohy je připravit DNA nesoucí úsek elektroaktivně značených nukleotidů pomocí TnT. Použitím této DNA, která pak bude sloužit jako sonda pro elektrochemickou detekci hybridizace DNA s využitím magnetických částic, určete, ke které z cílových DNA je tato sonda komplementární. - 29 -
Pracovní postup: A) Značení DNA sondy (60 minut) 7. Každá skupina připraví vzorek o celkovém obsahu 50 μl, který bude obsahovat: 10 μg/ml DNA (sondy - wt273-tnt) (zásobní roztok 100 μg/ml) 1x pufr pro terminální transferázu (zásobní roztok 10x koncentrovaný) 1x CoCl 2 (zásobní roztok 10x koncentrovaný) 0,75 μl enzymu TnT voda 100 μm nukleotid - skupina a) dgtp (zásobní roztok 1mM) b) dgtp-no 2 (zásobní roztok 1mM) c) deaza-dgtp (zásobní roztok 1mM) 8. Nechte inkubovat v termobloku 30 min / 37 C / netřepat. B) Hybridizace na magnetických částicích (MBT) (75 minut) Příprava MBT a hybridizace 1. Odeberte 40 μl rozotku MBT (Magnetic beads d(t) 25 - částice nesoucí oligonukleotidy polyt 25 ) do čistých eppendorfek, postavte je do magnetického koncentrátoru, počkejte až se MBT přitáhnou ke stěně, odeberte roztok, přidejte 100 μl 0,3 M NaCl / 10 mm Tris, protřepejte na vortexu, stočte na centrifuze. Postup 2x opakujte. - 30 -
2. Rozdělte MBT na poloviny do 2 čistých eppendorfek. 3. Připravte vzorky značené sondy s 2 cílovými DNA, aby obsahovaly 20 μl značené sondy (připraveno v A) ) + 6,7 μg/ml cílové DNA X a Y (zás. roztok 100 μg/ml, jen jedna z nich je komplementární k sondě) + 0,3 M NaCl (zás. roztok 2,5 M) + doplňte vodou do 30 μl. 4. Odeberte roztoky od MBT připravených v bodu 2 pomocí magnetu. K MBT přidejte vzorky připravené podle bodu 3. 5. Nechte inkubovat v termobloku zchlazeném na 20 C / 20 min / třepat 1000 rpm. Promytí: 6. Vzorky dejte na magnet, odeberte roztok, přidejte 100 μl PBS + Tween 20, protřepejte na vortexu, stočte na centrifuze. Postup 3x opakujte. Poté proveďte 3x totéž s roztokem 0,3 M NaCl / 10 mm Tris. Denatrurace: 7. Na magnetu odeberte roztok od MBT a přidejte do každé eppendorfky 20 μl vody (Sigma), dejte do termobloku vyhřátého na 75 C / 2 min / 1200 rpm. 8. Pomocí magnetu přeneste roztoky nad MBT do čistých eppendorfek = vaše vzorky, MBT vyhoďte. 9. Ke vzorkům přidejte NaCl, aby výsledná konc. byla 0,3 M (zás. roztok 2,5 M). C) Měření (40 min) Skupina a) a b) provede měření pomocí visící rtuťové kapkové elektrody na potenciostatu Autolab metodou cyklická voltametrie v mravenčanu jako základním elektrolytu. Skupina c) provede měření pomocí pyrolitické grafitové elektrody na potenciostatu CH Instruments metodou square wave voltametrie v acetátovém pufru jako základním elektrolytu. Získané výsledky porovnejte mezi skupinami. - 31 -
II. Analýza nukleotidové sekvence metodou primer extension Princip a cíl: DNA polymerázy jsou enzymy, jejichž úkolem je vytvořit kopii DNA v dělící se buňce. Tato schopnost je využita i při metodě zvané prodlužování primeru (PEx, primer extension). Polymerázy se posouvají po původním řetězci DNA, tj. templátu, a podle něj na základě komplementarity, připojují nukleotidy k 3 konci nově vznikajícího řetězce, tj. primeru, čímž ho prodlužují. Cílem této úlohy je určit komplementární sekvence metodou primer extension s využitím primeru, který bude naznačen pomocí Vent (exo-) polymerázy. Pracovní postup: A) Primer extension (60 minut) 9. Připravte 2 vzorky, každý o celkovém objemu 30 μl, které budou obsahovat: 10 μg/ml templátu X (vzorek 1) / Y (vzorek 2) (zásobní roztok 100 μg/ml) 5 μg/ml primeru (zásobní roztok 100 μg/ml) 3x 75 μm nukleotidy - datp, dctp, dttp (zásobní roztoky 1mM) 75 μm nukleotid - skupina a) dgtp (zásobní roztok 1mM) b) dgtp-no 2 (zásobní roztok 1mM) c) deaza-dgtp (zásobní roztok 1mM) 1x pufr pro enzym Vent (exo-) (zásobní roztok 10x koncentrovaný) + 0,3 μl enzymu Vent (exo-) voda 10. Nechte inkubovat v termobloku 30 min / 60 C / netřepat. - 32 -
B) Purifikace na kolonkách (30 minut) Postup podle QIAquick Nucleotide Removal Kit: 11. Ke vzorkům připraveným podle A) přidejte 300 μl PN pufru, promíchejte, přeneste na kolonky. Dejte do centrifugy, zavřete víčkem, stočte 60 s / 6000 rpm. 12. Roztok, co protekl kolonkou, odlijte. Na kolonky naneste 700 μl PE pufru. Kolonky stočte podle 1. 13. Roztok, co protekl kolonkou, odlijte. Kolonky centrifugujte 60 s / 13 000 rpm na sucho, aby byl odstraněn všechen zbylý PE pufr. 14. Kolonky dejte do čistých eppendorfek, naneste na ně 30 μl vody o ph 7-8 a nechejte 60 s stát. Pak centrifugujte 60 s / 13 000 rpm. C) Měření (40 minut) Skupina a) a b) provede měření pomocí visící rtuťové kapkové elektrody na potenciostatu Autolab metodou cyklická voltametrie v mravenčanu jako základním elektrolytu. Skupina c) provede měření pomocí pyrolitické grafitové elektrody na potenciostatu CH Instruments metodou square wave voltametrie v acetátovém pufru jako základním elektrolytu. Získané výsledky porovnejte mezi skupinami. - 33 -
Kapitola 4: Využití spektroskopie cirkulárního dichroismu při sledování konformačních přechodů DNA I. Kooperativní přechod Princip a cíl: Spektroskopická metoda cirkulárního dichroismu (CD) je velmi citlivá ke vzájemné orientaci bazí ležících nad sebou ve šroubovici nukleových kyselin. Jednotlivé struktury poskytují charakteristická spektra CD. Postupným přidáváním činidel je možné vyvolat přechod z jedné uspořádané struktury do druhé. Kooperativnost spočívá v tom, že v úzkém rozmezí měnících se podmínek dojde ke změně natočení bazí a přitom je překonána energetická bariéra mezi lokálními enegetickými minimy. Příkladem kooperativního přechodu je přechod dvoušroubovice formy B do formy A působením dehydratačního účinku trifluoretanolu (TFE). Pracovní postup: (120 minut) 1. Do křemenné 0,1 cm kyvety napipetujte 60 l připraveného heteroduplexu DNA: GCGGCGACTGGTGAGTACGC. GCGTACTCACCAGTCGCCGC a přidejte 90 l 100% TFE. Opatrně promíchejte a změřte CD spektrum. 2. V programu zadejte v General rozmezí vlnových délek 200 330 nm, krok 0,5 nm, s rychlostí posuvu 100 nm/min, 4 akumulace. Dále zvolte Information a do Sample name vepište název ukládaného souboru, např. T1. 3. Během měření vypočítejte koncentraci přidaného TFE dle vzorečku: V 1 c 1 = V 2 c 2 : V 1 - přidaný objem TFE, c 1 - % koncentrace přidanéhotfe, V 2 - celkový objem v kyvetě c 2 - je koncentrace TFE v kyvetě 4. Pokračujte v přidávání TFE podle tabulky a měřte jednotlivá CD spektra s názvy Tn - 34 -
Přídavek TFE Přidaný objem Celkový Koncentrace Název CD l] TFE celkem objem TFE [%] spektra l] v kyvetě l] 90 30 30 35 45 Výsledek 1: poslední CD spektra odpovídají DNA ve formě A, výchozí formě B. Seznam potřebného vybavení a chemikálií: dichrograf křemenné kyvety oligonukleotidy trifluoretanol II. Nekooperativní přechod Princip a cíl: Při změně podmínek v roztoku přechází DNA malými změnami jednotlivých torzních úhlů v rámci příslušných lokálních energetických minim do poněkud odlišné geometrie. Tyto změny postupného charakteru jsou označovány jako nekooperativní. Příkladem může být zavíjení nebo odvíjení dvoušroubovice. Zvyšováním iontové síly budete sledovat zavíjení vlásenky tvořené sekvencí (CAG) 4. Pracovní postup: (90 minut) 1. Napipetujte do křemenné 1 cm kyvety 1,4 ml 1 mm sodného fosfátového pufru, ph 7 a přidejte 10 l zásobního roztoku DNA. Opatrně promíchejte a změřte CD spektrum. 2. V programu zadejte v General rozmezí vlnových délek 210 330 nm, krok 0,5 nm, s rychlostí posuvu 100 nm/min, 4 akumulace. Dále zvolte Information a do - 35 -
Sample name vepište název ukládaného souboru, např. V1. 3. Přidejte 150 l 10x koncentrovaného Britton-Robinson pufru, ph 7, aby byl roztok pufrován, a změřte další CD spektrum. 4. Další zvyšování iontové síly bude prováděno přidáváním pevného NaCl: s navážkou m (v gramech) se zvýší objem v kyvetě; proto navážku m v gramech vynásobte objemovým faktorem f = 0.309 (který je určen empiricky rozpuštěním navážky v přesném objemu) a přičtením k předchozímu objemu v ml získáte objem (V) v kyvetě molaritu přidaného NaCl vypočtěte podle vzorečku c = m(g) / M w / V(ml)*1000 [mol/l], kde M w je molekulová hmotnost NaCl = 58.44 Navažte cca 100 mg NaCl, přidejte do kyvety a po úplném rozpuštění změřte CD spektrum a vypočtěte koncentraci NaCl. 5. Dalšími třemi přídavky postupně zvyšujte koncentraci NaCl až do 4 M. Přídavek Objem [ml] Koncentrace NaCl [M] Název CD spektra Výsledek 2: CD spektrum vlásenky (CAG) 4 odpovídá formě B a s přidáváním soli se výrazně nemění Seznam potřebného vybavení a chemikálií: dichrograf křemenné kyvety oligonukleotid pufry, NaCl - 36 -
III. Termální denaturace kvadruplexů DNA Princip a cíl: Denaturace DNA je dalším příkladem kooperativního přechodu, kdy DNA přechází z určitého uspořádaného stavu (duplex, vlásenka, kvadruplex apod.) do stavu neuspořádaného, kterým je jednořetězcová DNA. Kvadruplexy, tedy čtyřřetězcová uspořádání DNA, vznikají v oblastech bohatých na guanin po přidání sodných nebo draselných iontů k neuspořádanému jednořetězci. Absorpční spektrofotometrie se používá ke sledování termálních denaturací, ze kterých lze na základě teploty tání usuzovat na pevnost vazeb mezi řetězci DNA. Pro guaninové kvadruplexy je typické, že během denaturace dochází k výraznému poklesu absorpce okolo 295 nm, kdežto zvýšení okolo 260 nm odpovídá denaturaci jakékoliv uspořádané struktury. Pracovní postup: (60 minut) 1. Napipetujte do ependorfky 1,2 ml 1 mm sodného fosfátového pufru, ph 7 a přidejte 10 l zásobního roztoku DNA o sekvenci G 3 T 2 G 3 T 2 G 3 T 2 G 3 a totéž s druhým oligonukleotidem G 4 T 4 G 4 do druhé ependorfky. 2. Promíchejte a vzorky zahřejte v termobločku na 90 C, aby se zdenaturovaly vyšší struktury vzniklé v koncentrovaném zásobním roztoku. 3. U vzorku G 3 T 2 G 3 T 2 G 3 T 2 G 3 zvyšte iontovou sílu na 10 mm K-fosfátový pufr přidáním 45 l ze zásobního roztoku 0,3 M K-fosf, ph 7 a u vzorku G 4 T 4 G 4 zvyšte iontovou sílu na 100 mm NaCl přidáním 45 l ze zásobního roztoku 3M NaCl. Promíchejte. 4. Přepipetujte do 1 cm zúžených kyvet. 5. Spusťte termální denaturaci vzorků na spektrofotometru. Výsledek 3: Porovnání absorpčních spekter v nativním a denaturovaném stavu a tání obou vzorků mezi sebou. Seznam potřebného vybavení a chemikálií: absorpční spektrofotometr křemenné kyvety oligonukleotidy pufry, NaCl - 37 -
Kapitola 5: Analýza proteinů a komplexů proteinů s DNA I. Elektroforéza proteinů v přítomnosti SDS SDS PAGE Cíl úlohy: Srovnat naměřené koncentrace izolovaných proteinů p53 a porovnat zjištěné údaje s proteinem o známé koncentraci. Princip: Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE) patří mezi nejběžnější způsoby dělení proteinů. Proteiny migrují v elektrickém poli na základě jejich tvaru (globulární proteiny migrují rychleji než vláknité) a hustoty náboje (poměr velikosti náboje k jednotce hmoty). K určení relativní molekulové hmotnosti se využívá elektroforézy v přítomnosti SDS. SDS (laurylsíran sodný) se zde váže na bílkovinný řetězec v poměru 1.4 g SDS na 1 g bílkoviny, přičemž délka komplexu SDS bílkovina je úměrná jeho molekulové hmotnosti. Často se disulfidické vazby eliminují redukčním činidlem (beta-merkaptoethanol) a denaturace se dokončí varem. Tedy výsledně je jediným faktorem rozhodujícím o pohyblivosti proteinů při denaturačním SDS-PAGE jejich molekulová hmotnost. Elektroforéza v přítomnosti SDS (SDS-PAGE) je jednoduchá, rychlá a reprodukovatelná metoda pro kvalifikovanou charakterizaci a srovnání bílkovin. Na základě srovnání relativních mobilit neznámé bílkoviny a standardů je pak možné určit její relativní molekulovou hmotnost. detergent SDS je určen pro solubilizaci proteiny s podjednotkami protein s jednou - 38 -
Pracovní postup: 1. Příprava polyakrylamidového gelu c. Destilovanou vodou a etanolem důkladně očistíme skla, pro jeden gel vždy dvojice 1.5mm sklo se spacerem a krycí sklo a k tomu hřebínek (1.5mm). d. Příprava separačního (running) gelu dle tabulky v uvedeném pořadí nalít mezi skla do výšky asi 5cm zakápnout 2-butanolem. 1 gel 2 gely 10 % PAGE 10 ml 20 ml 10 % APS 30 μl 60 μl Temed 10 μl 20 μl e. Připravíme si koncentrační (stacking) gel podle tabulky odsát butanol filtrákem promíchat směs hřeben. 1 gel 2 gely 5,0 % PAGE 2,5 ml 5 ml 10 % APS 7,5 μl 15 μl Temed 2,5 μl 5 μl f. Když gel zpolymeruje, opatrně vyjmeme hřeben a starty promyjeme elektroforetickým pufrem, abychom se zbavili zbytků nezpolymerovaného akrylamidu. g. Gel se skly vložíme do aparatury a zalijeme pufrem 1xRB (10xRB: 0,25M Tris; 1,92M glycin; 1% SDS, ph 8,3). 2. Příprava vzorků a elektroforéza h. K 9 ul vzorku obsahujícího protein přidáme 3 ul 4xCSB. vzorek marker p53 (5ug) BSA (1ug/1ul) Voda 4xCSB 1 3 ul 2 E285V 3,96 ul 5,04 ul 3ul 3 R175H 3,46 ul 5,54 ul 3ul 4 N268D 3,28 ul 5,72 ul 3ul 5 R273H 2,68 ul 6,32 ul 3ul 6 E285K 3,72ul 5,28 ul 3ul 7 wt 3,48 ul 5,52 ul 3ul 8 2ul 7 ul 3ul 9 4ul 5 ul 3ul 10 8ul 1 ul 3ul - 39 -
i. Směs povaříme při 99 C po dobu 5 min, zcentrifugujeme a naneseme na gel. j. Elektroforetickou aparaturu s nanesenými vzorky uzavřeme víkem s konektory a připojíme na zdroj napětí. k. Na zdroji nastavíme program 3 (15 min 70 V a 45 min 150 V) a jedeme elektroforézu, dokud čelo představované bromfenolovou modří nedosáhne spodního okraje gelu. l. Vypneme zdroj, vyjmeme gel a opatrně oddělíme skla. 3. Barvení gelu a dokumentace m. Gel vložíme do roztoku Coomassie Briliant Blue G a za mírného třepání necháme barvit asi 15-20 min. n. Barvící roztok slijeme zpět do láhve (opatrně, abychom se nepotřísnili barvící schopnosti jsou značné a skvrny na rukou nebo oděvu lze odstranit velmi obtížně) a gel přelijeme odbarvovacím roztokem. Za mírného třepání při laboratorní teplotě necháme gel odbarvovat. o. Po zmodrání odbarvovacího roztoku jej vyměníme a necháme třepat do úplného vymizení modrého pozadí podle potřeby několikrát vyměníme odbarvovací roztok. p. Gel naskenujeme na skeneru a v počítačovém programu ImageJ změříme intenzitu jednotlivých bandu. q. Srovnáme naměřené hodnoty. Seznam potřebného vybavení a chemikálií Zásobní roztok pro přípravu separačního gelu: 10% akrylamid:bisakrylamid 19:1; 0,375 M Tris-HCl, ph 8,8; 0,1% SDS Zásobní roztok pro koncentrační gel: 5% akrylamid:bisakrylamid 19:1; 0,125 M Tris-HCl, ph 6,8; 0,1% SDS 10% persíran amonný (APS) TEMED (N,N,N,N -tetrametyletylendiamin) RB (Elektrodový pufr): 25 mm Tris; 0,192 M glycin; 0,1% SDS, ph 8,3 Izolovaný rekombinantní protein 4 x CSB: 50 mm Tris-HCl, ph 6,8; 100 mm -merkaptoetanol; 2% SDS; 0,1% bromfenolová modř; 10% glycerol - 40 -
Roztok Coomassie Briliant Blue G: 0,25% Coomassie Briliant G (Serva); 45% (v/v) metanol; 10% (v/v) kyselina octová Odbarvovací roztok: 25% (v/v) metanol; 10% kyselina octová Pipety Špičky Mikrozkumavky Termoblok Zdroj napětí Třepačka Dokumentační systém II. Stanovení koncentrace proteinů podle Bradfordové Cíl úlohy: Stanovení koncentrace proteinů rodiny p53 na spektrofotometru Princip: Stanovení koncentrace proteinu pomocí Bradfordova činidla je rychlá a relativně přesná metoda stanovení koncentrace proteinu například v buněčných lyzátech či pro použití při gelové elektroforéze.tato metoda je založena na kolorimetrické reakci, která proběhne po smíchání Bradfordova činidla s roztokem obsahujícím proteiny. Bradfordovo činidlo obsahuje barvivo Brilliant Blue G-250, které se váže na bazické a aromatické aminokyselinové zbytky v proteinech, zejména na arginin. Vzniklý komplex proteinu s Brilliant Blue G-250 má posunuté absorbční maximum z 465 na 595 nm. Pokud vytvoříme ředící řadu o známé koncentraci proteinu v každém ředění, je možné sestavit z hodnot koncentrace proteinu a jim příslušejících absorbancí kalibrační přímku a z ní stanovit koncentraci proteinu v neznámých vzorcích na základě znalosti hodnoty jejich absorbance. Závislost mezi koncentrací a absorbancí je lineární a vychází z Lambert-Beerova zákona. Jako standard pro konstrukci - 41 -
kalibrační přímky se obvykle používá hovězí sérový albumin (BSA, bovine serum albumine). Pracovní postup: a. Připravíme si v 1,5ml mikrozkumavkách koncentrační řadu proteinu BSA v triplikátu v množství 0.625, 1.25, 2.5, 5 a 10 ug na reakci a objem doplníme vodou do 800ul celkem. b. Od každého měřeného proteinu odebereme 8 ul a spolu se 792 ul vody dáme do nové mikrozkumavky. Jako slepý vzorek (blank) použijeme 800 ul vody. c. Ke všem připraveným vzorkům (BSA, voda a proteiny) přidáme 200 ul Bradfordova činidla o pokojové teplotě a necháme inkubovat 5-10 min. d. Napipetujeme od každého vzorku 150ul do jamky v ELISA destičce dobře popsat, nepoplést!!! e. Vzorky odeseme k ELISA readeru, přičemž vzorek s vodou nastavíme v přístrojí jako Blank. f. Z naměřených hodnot absorbance a známých koncentrací BSA nám přístroj vypočítá rovnici kalibrační křivky a dopočítáme kontentrace neznámých vzorků. Vzorek Absorbance 1 Absorbance 2 Absorbance 3 Průměr BSA 0,625 BSA 1,25 BSA 2,5 BSA 5 BSA 10 p53a X X p53b X X Seznam potřebného vybavení a chemikálií Izolovaný rekombinantní protein BSA (bovine serum albumine) Bradfordovo činidlo Voda ELISA reader Pipety Špičky Mikrozkumavky - 42 -
III. Přímé stanovení koncentrace proteinů při 280nm Cíl úlohy: Stanovení koncentrace proteinu p53 na nanodropu Princip: Absorpce záření v blízké UV oblasti závisí na přítomnosti chromoforů v proteinu, tedy na přítomnosti aromatických aminokyselin tyrosinu a tryptofanu (v menší míře na fenylalaninu a disulfidických vazbách, které ale absorbují slabě a jejich absorbanci je možné v řadě případů Vlnová délka (nm) zanedbat). Při vhodném naředění vzorku je tak možné stanovit celkový obsah proteinů z hodnoty absorbance v této oblasti spektra. Metoda je citlivá pro stanovení čistých proteinů nebo jejich směsí v koncentračním rozsahu 0,1 1 mg/ml. U řady čistých proteinů je znám molární absorpční koeficient, který dovoluje stanovit poměrně přesně jejich molární koncentraci. Proteiny, které vykazují absorpční maximum při 280 nm, se často nacházejí ve směsích s nukleovými kyselinami, které zde také absorbují. Poměr absorbancí 280/260 nm se používá k eliminaci vlivu nukleových kyselin na stanovení. Molární absorpce Pracovní postup: a. Na internetové stránce www.uniprot.org najdeme ve vyhledávači protein p53 a zjistíme jeho sekvenci aminokyselin. b. Sekvenci vložíme do programu ProtParam, kde zjistíme extinkční koeficient (ε) a molekulovou hmotnost (M.W.) proteinu (www.expasy.ch/tools/protparam.html). c. Stejným způsobem zjistíme ε a M.W. také pro ostatní měřené proteiny. d. Zapneme Nanodrop a vybereme měření proteinu při 280 nm. e. Poté vybereme z možností měření typ Other protein, u níž je nutno zadat extinkční koeficient a molekulovou hmotnost. Naneseme 2 ul čistého pufru a nastavíme jej jako Blank. f. Poté nanášíme vždy 2 ul od každého měřeného proteinu, zadáme odpovídající údaje a změříme koncentraci daného vzorku. - 43 -
Vzorek Ext. koeficient Mol. hmotnost Koncentrace (ug/ul) p53a p53b Seznam potřebného vybavení a chemikálií Internet s přístupnou databází proteinů Izolovaný rekombinantní protein Nanodrop Pipety Špičky Mikrozkumavky Dokumentační system IV. EMSA - Gelová retardační analýza Cíl úlohy: Detekce vazby proteinu p53 N268D na specifickou/nespecifickou sekvenci DNA pomocí EMSA (gelová retardační analýza) Princip úlohy: Gelová retardační analýza je jednou z technik pro studium genové regulace a určení interakce DNA-protein. Tato metoda je založena na pozorování, že komplex DNAprotein putuje v nedenaturačním polyakrylamidovém či agarózovém gelu výrazně pomaleji, než samotná DNA. Často se využívá krátké DNA, představující studovanou cílovou sekvenci pro testovaný protein. Nejběžnější variantou byla metoda využívající radioaktivně značeného oligonukleotidu s předpokládanou cílovou sekvencí, kterou v současnosti vytlačuje použití fluorescenčně značených DNA. Nejdříve je DNA inkubována s proteinem (jaderný nebo buněčný lyzát, purifikovaný protein, in vitro transitovaný protein) v DNA vazebném pufru, a reakční směs je potom analyzována na nedenaturačním gelu. Při studiu specifity dané reakce se uplatňují nejčastěji 4 přístupy: a) studovaný protein je přidáván ve zvyšujícím se množství (vazba na danou DNA roste); b) do reakce se kromě studovaného proteinu přidá také specifická protilátka, v tomto případě pozorujeme tak zvaný supershift ; c) specifita interakce daného proteinu ke studované DNA bývá ověřována kompetičními experimenty, kdy je - 44 -
k reakční směsi přidán specifický či nespecifický kompetitor (obvykle neznačená DNA), d) blotting. Schéma: EMSA s využitím zmíněných přístupů pro studium specifičnosti reakce Pracovní postup: 1. Příprava agarózového gelu (do baňky navážíme 1 g agarózy, přidáme 3,3 ml 10xTBE pufru a do 100 g vody - rozvaříme, doplníme vyvařenou vodu, vychladlý gel naléváme do misky s hřebínkem) a příprava vany s pufrem (1 l 0.33xTBE 33 ml 10xTBE do 1 l vody) 2. Rozmražení DNA, vazebného pufru (20x koncentrovaný) a proteinu DNA a vazebný pufr necháme roztát na stole, protein položíme do ledové lázně. 3. Příprava DNA-protein komplexů a) příprava DNA 200 ng DNA na reakci, rozmrazit stočit na led, ředit ve vodě pblue/pvuii (B/P), 2800 ng/µl nespecifická DNA - ppgm1/pvuii (M/P), 350 ng/µl specifická DNA b) příprava proteinů 20/100/200 ng na reakci, uchovávat na ledu!, ředit v 1x vazebném pufru p53 N268D 153 ng/ul stabilní mutant - 45 -
c) pipetování podle tabulky (µl) Vzorek DNA(200ng) Vaz. pufr Protein H2O 40 C celkový objem reakce 1 B/P1ul 0,5ul - 8,5 ul - 10ul 2 B/P1ul 0,5ul 100ng 7,86-10ul 3 B/P1ul 0,75ul 200ng 7,22-15ul 4 M/P1ul 0,5ul - 8,5-10ul 5 M/P1ul 0,5ul 20ng 8,38-10ul 6 M/P1ul 0,5ul 100ng 7,86-10ul 7 M/P1ul 0,5ul 100ng 7,86 vzniklý komplex 10ul 8 M/P1ul 0,5ul 100ng 7,86 protein před vazbou 10ul - vortex centrifugace 20 minut na ledu - přidat 2 μl (vzorek 3. 3ul) nanášecího pufru (6x LB) 4. Elektroforéza v 0.33xTBE (nanést na gel v pořadí podle tabulky 45 min / 120 V / 4 C) 5. Detekce DNA-protein komplexů gel obarvit v EtBr (1 g/ml), 20min promýt vodou vyfotit pod UV světlem Seznam potřebného vybavení a chemikálií DNA, protein vazebný pufr 20x (100mM Tris HCl ph 7.6, 10 mm EDTA ph 8; 0,2% TritonX100 1 M KCl) ledová lázeň, agaróza, 10x TBE elektroforetická aparatura, zdroj napětí, mikrozkumavky, špičky, pipety, rukavice - 46 -