Chromatografické metody základní rozdělení a instrumentace

PŘEHLED CHROMATOGRAFICKÝCH TECHNIK ============================================================== Mobilní Stacionární Chromatografická technika fáze fáze ============================================================== plyn kapalina plynová rozdělovací chromatografie (GLC) (plynová ch.) ------------------------------------------------------------------------------------ GC tuhá látka plynová adsorpční chromatografie (GSC) ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ kapalina kapalina kapalinová rozdělovací chromatografie (LLC) (kapalinová ch.) gelová permeační chromatografie (GPC) LC ------------------------------------------------------------------------------------- tuhá látka kapalinová adsorpční chromatografie (LSC) iontově výměnná chromatografie (IEC) ------------------------------------------------------------------------------------------------- kapalina papírová rozdělovací chromatografie (PC) tenkovrstvá rozdělovací chromatografie (TLC) ------------------------------------------------------------------------------------ tuhá látka tenkovrstvá adsorpční chromatografie (TLC) ==============================================================

Plynová chromatografie separace organických látek s bodem varu do 400 C není vhodná k separaci biomakromolekul detekce produktů enzymových reakcí

nosný plyn: inertní plyn helium, argon, dusík, vodík kolony: nejčastěji kapilární tloušťka vrstvy - 0,1 až 2,5 μm vliv teploty na průběh GC a. při 45 C b. při 145 C c. od 30 C do 180 C

ADSORBENTY v GC aktivní uhlí, grafitizované uhlí - dělení plynů a lehkých uhlovodíků silikagel - dělení anorganických plynů a nízkovroucích kapalin molekulová síta (krystalické hlinitokřemičitany) - dělení plynů a lehčích uhlovodíků porézní polymery (vinylbenzenové kopolymery), komerčně tzv. Porapaky dělení nízkomolekulárních uhlovodíků,anorganických plynů, alkoholů, esterů a ketonů KAPALNÉ STACIONÁRNÍ FÁZE v GC Carbowaxy (polyethylenglykoly) Ucony (polypropylenglykoly) - polární stacionární fáze, s rostoucí Mr klesá polarita Polyestery (např. polyethylenglykoladipáty, polypropylenglykoladipáty, polyethylenglykolsukcináty) - polární stacionární fáze Silikonové stacionární fáze (polysiloxany) - často používané, široký rozsah polarity

Detektory a) tepelně vodivostní detektor, TCD - univerzální, nedestruktivní, středně citlivý všechny látky lišící se tepelnou vodivostí od nosného plynu eluát b) plamenový ionizační detektor, FID - selektivní, destruktivní velmi citlivý, uhlovodíky odporové vlákno zapalování + elektrody - vzduch vodík c) detektor elektronového záchytu, ECD - selektivní, nedestruktivní, středně citlivý, halogenderiváty (pesticidy) a nitroderiváty eluát + anoda d) hmotnostní spektrometr, MS - vysoce specifický, destruktivní, velmi citlivý 63 28 Ni eluát zářič katoda

Kapalinová chromatografie A. sloupcová B. na tenké vrstvě A. nízkotlaká B. střednětlaká (FPLC) C. vysokotlaká (HPLC) D. UPLC Instrumentace zásobník mobilní fáze pumpa mísič gradientu dávkovač kolona detektor vyhodnocování zapisovač sběrač frakcí

1. QuadTec UV/Vis detector 2. SV5-4 select valve 3. BioLogic Maximizer mixer 4. AVR9-8 switching valves 5. BioLogic Maximizer buffer blending systém 6. ph monitor 7. F40 workstation 8. BioFrac fraction collector 9. AVR 7-3 sample inject valve 10. UNO Q1 column 11. BioLogic rack 12. BioLogic DuoFlow software 13. USB bitbus communicator 14. Dell controller

Mobilní fáze požadavky na mobilní fázi: vhodné složení čistota odvzdušnění zahřátím vakuové odsátí ultrazvuk inertní plyn (Ar, He)

Čerpadla gravitace, spojené nádoby pneumatická čerpadla peristaltická čerpadla pístová čerpadla UPLC tlak ~100 MPa složitější pístová čerpadla HPLC tlak ~40 MPa složitější pístová čerpadla FPLC tlak až 25 MPa peristaltická nebo pístová čerpadla nízkotlaká chromatografie tlak menší než 0,1 MPa peristaltická čerpadla gravitační tok

pneumatické čerpadlo výhody: nevýhoda: jednoduchá a levná konstrukce může docházet k rozpuštění plynu v kapalině nízký tlak 0,1 8 ml/min peristaltické čerpadlo výhody: nevýhoda: jednoduchá konstrukce možnost pracovat sterilně nedochází ke styku MF s kovem nízký tlak 0,1 8 ml/min tlakové rázy

pístové čerpadlo dvojpístové čerpadlo dva ventily sací, výtlačný výhody: nevýhoda: malý vnitřní objem dávkovače vyšší pracovní tlak tlakové rázy Tlumení tlakových pulsů zařazení dalšího čerpadla pracujícího v opačné fázi možnost použití více čerpacích hlav s koordinovaným sáním a výtlakem často se používají čerpadla s programovaným pohybem pístu

Gradientový mixér gradient skokový spojitý lineární konvexní konkávní vodivost vodivost vodivost vodivost 0 0 V [ml] 0 0 V [ml] 0 0 V [ml] 0 0 V [ml] možno kombinovat obecně: nejdříve lineární

gradientové mixery!!! u gradientu ph smíchat 2 pufry není lineární závislost!!!

Dávkovače přímo na kolonu = pipeta, stříkačka pomocí pumpy nástřikový ventil

analytické preparativní Kolony připravené komerční materiál inertní, nereaguje se složkami vzorku (skleněné, kovové, plastové) nerozpustný v H 2 O pórovitý minimální nespecifická sorpce pevnost, vhodný tvar částic chemicky a mechanicky stabilní levný Nosič celulosa + její deriváty polyakrylamid agarosa dextrany silikagely

objem kolony rozměry vazebná kapacita kolik mg proteinu se naváže na ml kolony velikost částic maximální tlak a průtok chemická stabilita ph stabilita teplotní stabilita skladovací podmínky

Chromatografické metody pro separaci proteinů - + + - - - + + + + + - + - + + + + Ion exchange Reverse phase / Size exclusion Affinity hydrophobic interaction

HPLC 1 kovový plášť 2 porézní kovová frita 3 stacionární fáze 4 převlečný ochranný kroužek 5 koncová hlavice 6 vstup pro kapiláru se šroubem www.hplc.cz, www.waters.com

Silikagely nejrozšířenější polární sorbent široké komerční využití lze připravit ve velmi čisté formě velkým specifický povrch (100 až 150 m 2 /g) velkým objemem pórů (0,7 ml/g) střední průměr pórů je asi 8-15 nm nejčastější velikost náplně 3, 5 a 10 µm www.hplc.cz, www.waters.com

Oxid hlinitý specifický povrch 100 až 200 m 2 /g objemem pórů 0,2 až 0,3 ml/g průměr pórů 10 až 20 nm aktivuje se při teplotě mezi 500 a 800 C interakce s molekulami bohatými na elektrony Aminopropyl vyšší retence lze dobře substituovat retence látek kyselé povahy vysoká reaktivita www.hplc.cz, www.waters.com

Chemicky vázané nepolární stacionární fáze vhodné pro separaci nasycených a nenasycených sloučenin www.hplc.cz, www.waters.com

UPLC technologie "Hybrid (Silicon-Carbon) Particle Technology" www.hplc.cz, www.waters.com

UPLC kolony

UPLC x HPLC kratší doba analýzy = vyšší průchodnost vzorků (vyšší produktivita) snížení nákladů (menší spotřeba HPLC rozpouštědel) zvýšení separační účinnosti snížení meze detekce - zvýšení citlivosti více kvalitativních informací www.hplc.cz, www.waters.com

Detektory monitoruje složení eluátu, zaznamenává ho graficky - gromatogram detektor musí poskytovat odezvu dostatečně rychle detektor může být univerzální nebo selektivní univerzální detektor reaguje na vlastnosti systému jako celku (refraktometrický) selektivní detektor reaguje na určitou selektivní vlastnost analytu (fluorescenční) detektor může být destruktivní (AAS, AES) nebo nedestruktivní (UV/VIS) detektory lze vhodně kombinovat (vícenásobná detekce) detektor by měl mít co nejmenší vnitřní objem

Charekteristiky detektoru vysokofrekvenční šum (krátkodobý) náhlá změna signálu nízkofrekvenční šum (dlouhodobý) chvění kolem nulové linie (baseline) posun nulové (základní) linie (drift) kontinuální stoupání nebo klesání baseline detekční limit nejmenší pás (pík), který může být ještě považován za pás S/N 3 limit kvantifikace nejmenší pás, jehož plocha může být změřena s požadovanou přesností S/N 10 šum (N) S drift 0 0 reprodukovatelnost odezvy detektoru směrodatná odchylka odezvy na stále stejnou koncentraci analytu při opakovaném měření linearita odezvy detektoru oblast koncentrací, kdy je odezva přímo úměrná koncentraci analytu odezva ještě použitelná oblast předávkování lineární oblast ΔR = citlivost detektoru ΔC 0 0 koncentrace analytu

UV/Vis detekce pevná vlnová délka - standardní monochromatický spektrofotometr, vlnová délka se mění otočením hranolu nebo mřížky, v daném okamžiku pouze jedna vlnová délka, deuteriová lampa měnitelná vlnová délka kontinuální sledování celého spektra UV i Vis: a) několik standardních spektrofotometrů za sebou b) DAD - Diode Array detektor simultánní měření celé oblasti, data okamžitě, možnost tvorby 3D chromatogramu

Fluorescenční detektor velice citlivý selektivní detektor použitelný pouze pro látky přímo floreskující nebo fluoreskující po derivatizaci mobilní fáze nesmí obsahovat zhášeč fluorescence zdroj excitace prochází průtokovou celou do fotodetektoru, měříme vlnovou délku emitovaného světla ve směru kolmém k paprsku primárního záření citlivost 10-9 až 10-11 g/ml Využití fluorescenční detekce DNA/RNA fluoreskující látky drogy, hormony, vitamíny,

Refraktometr měření indexu lomu diferencíální porovnání analytu a rozpouštědla nelze použít při gradientové eluci spolehlivý, málo ovlivnitelný průtokem mobilní fáze použitelný na téměř všechna rozpouštědla málo citlivý k nečistotám a vzduchovým bublinám citlivý na teplotu mění se index lomu + termostat +/- 0,001 C citlivost detektoru je až o tři řády nižší než UV/Vis drahý výchylkový refraktometr

Konduktometr měření vodivosti jednoduchý, neselektivní a universální ionexová chromatografie při analýzách v průběhu zpracování vody Ampérometrický detektor nejobvyklejší druh elektrochemického detektoru měření limitních proudů velmi citlivý

Odpařovací light-scattering detector (ELSD) nespecifický kompatibilní s gradientem teplotně nezávislý

Hmotnostní spektrometr spojení MS s HPLC HPLC separace se provádí za vysokých tlaků, MS měření v hlubokém vakuu nutný převodník

Derivatizace zvýšení citlivosti nebo umožnění detekce vůbec zvýšení rozlišení nebo umožnění separace vůbec zamezení nežádoucí sorpce látek na koloně Požadavky na deriváty chemické individuum stabilní reakce kvantitativní rychlá selektivní bez vedlejších produktů za mírných reakčních podmínek (ph, teplota) činidlo musí být dobře separovatelné od svých produktů na koloně jiné fyzikálně-chemické vlastnosti

Derivatizační činidla 5-N,N -dimethylaminonaftalen-1-sulfonylchlorid (Dns-Cl) ninhydrin enacylbromid naftacylbromid acylchloridy reakce s fenyisothiokyanátem 2,4-dinitrofenylhydrazin(DNPH) p-nitrobenzylhydroxylamin (NBHA) O OH 2 + OH COOH RCH NH 2 O Ruhemannuv purpur O O N + + R CHO CO 2 ONH 4 O

Vznik elučního pásu (píku) kolona příčina: thermodynamická porušování a ustanovování rovnováhy kinetická všechny ostatní děje (průtok MF, difuse ) Teoretické patro KOLONA teoretické patro počet teoretických pater výška teoretického patra V N = 5,55. w H=L/N r 0,5 2 Vr = 16. w 2

Difusní teorie 1. difuse molekul mezi mobilní a stacionární fází -přenos hmot H velikost částic náplně kolony velké malé molekulová hmotnost vysoká nízká průtok 2. difuse molekul podél kolony malé molekuly difundují rychleji než velké H malé molekuly velké molekuly průtok

3. vířivá difuse závisí na velikosti a homogenitě náplně kolony H nehomogenní homogenní průtok

čím je větší molekulová hmotnost, tím nižší je optimální průtok čím menší jsou částice náplně, tím ostřejší jsou píky van Deemterova rovnice H=A+B/μ+ C.μ A vířivá difuse A=λ.d p B podélná difuse B=γ.D M C odpor vůči přenosu hmoty ~d p2, 1/D M μ lineární rychlost

Dělení více látek R 1,2 = Vr Vr 2 1 0,5. 2 b1 ( w b + w )

Co ovlivňuje rozlišení? faktor selektivity R 1,2 = F selektivity. F kapacity. F účinnosti lze ovlivnit: - změnou stacionární fáze, - změnou mobilní fáze, - současnou změnou obou fází, - změnou rychlosti toku mobilní fáze faktor kapacity - hodnota retence separované složky k = K D. V s /V m faktor účinnosti - ~ lze ovlivnit: - množstvím stacionární fáze v koloně, - změnou stacionární nebo mobilní fáze - změnou teploty kolony N lze ovlivnit: - délkou kolony, - rychlostí průtoku mobilní fáze, - velikostí částic sorbentu, - teplotou, viskozitou mobilní i stacionární fáze apod.

R s <1- nedokonalá separace, R s = 1- u sebe, R s >1- dobrá separace S Distribuční koeficient c K D = cm c s rovnovážná koncentrace látky ve stacionární fázi c M rovnovážná koncentrace látky ve mobilní fázi

1. MANUÁLNÍ Vyhodnocování chromatogramu stříhání a vážení co nejmenší chyba co největší chromatogram (chyba 2 %) planimetrie plocha pásu je úměrná obrysu (chyba 4 %) čtvercová síť plocha plných čtverců + odhad zbytku (chyba 3 %) 2. INTEGRÁTORY (integrační software) ------------------------------------------------------------- Peak RT(min) Height Area W1/2 ------------------------------------------------------------ 1 5.723 1.957 8.827 0.023 2 12.561 5.457 96.121 0.048 3 15.887 2.827 73.266 0.073 4 22.975 0.773 6.001 0.102 -----------------------------------------------------------

vzorek je rozpuštěn v prostředí o vyšší iontové síle než mobilní fáze špatná rozpustnost v mobilní fázi kanálky ve stacionární fázi sedlá náplň kolony nespecifické interakce silná retence vzorku přetížení kolony snížit nástřik poškozená kolona nečistoty v koloně nerozdělené píky kanálky v koloně nečistoty na koloně nástřik ve dvou podílech

Pufry ~ ph pufru se po přidání silné kyseliny nebo zásady mění jen málo ~ směsi slabých kyselin a jejich solí nebo směsi slabých bazí a jejich solí pufrační kapacita - množství jednosytné silné kyseliny, kterou je třeba přidat k roztoku, aby ph kleslo o jednotku pro slabou kyselinu platí: ph 1 pk 1 2 log 2 A c pro slabou zásadu platí: ph pk 1 pk 1 2 log c W 2 B +

Jak vypočítat ph pufru??? Přídavek silné kyseliny do pufru (A - + HA) + A + H3 O HA + H2O Přídavek silné zásady do pufru (A - + HA) HA + OH A - + H2O Hendersonova-Hasselbalchova rovnice ph = pk A + [ A ] log [ HA ]

Výpocet ph slabé kyseliny Jaké je ph 0,1 M CH 3 COOH (K A =1,8.10-5 )?

Příklady: Jaké je ph roztoku, který je připraven z 250 ml 1 M kys. octové a z 250 ml 1,6 M octanu sodného? Hodnota K A kyseliny octové je 1,8.10-5.

Jaký poměr mravenčanu sodného a kyseliny mravenčí je nutný pro přípravu pufru o ph 3,85? Hodnota K A pro kyselinu mravenčí je 1,8.10-4.

Příklady pufrů Nejpoužívanější pufry: acetátový, fosfátový, citrátový, Tris (tris(hydroxymethyl)methylamin) Název ph rozsah pk A (25 o C) Acetátový 3,8-5,8 4,76 MES 5,5-6,7 6,10 fosfátový 5,7-8,0 7,20 Bis-Tris 5,8-7,2 6,50 PIPES 6,1-7,5 6,76 MOPS 6,5-7,9 7,20 TES 6,8-8,2 7,40 HEPES 6,8-8,2 7,48 Trizma 7,0-9,0 8,06 TEA 7,3-8,3 7,80 EPPS 7,3-8,7 8,00 Tricine 7,4-8,8 8,05 Gly-Gly 7,5-8,9 8,20 Tris/HCl 7,5-9,0 8,06 Bicine 7,6-9,0 8,26 CHES 8,6-10,0 9,49

0,2 M fosfátový pufr Na 2 HPO 4 g/l NaH 2 PO 4.7H 2 O g/l ph 23 C Na 2 HPO 4 g/l NaH 2 PO 4.7H 2 O g/l ph 23 C 22,4 3,49 5,7 10,80 29,51 6,9 22,08 4,29 5,8 9,36 32,73 7,0 21,60 5,37 5,9 7,92 35,95 7,1 21,05 6,60 6,0 6,72 38,63 7,2 20,40 8,05 6,1 5,52 41,31 7,3 19,56 9,93 6,2 4,56 43,46 7,4 18,60 12,07 6,3 3,84 45,07 7,5 17,64 14,22 6,4 3,12 46,68 7,6 16,44 16,90 6,5 2,52 48,55 7,7 15,00 20,12 6,6 2,04 49,09 7,8 13,56 23,34 6,7 1,68 49,89 7,9 12,24 26,29 6,8 1,27 50,81 8,0

Britton-Robinsonův pufr ph 2 až ph 12 Složení: 0,04 M H 3 BO 3 0,04 M H 3 PO 4 0,04 M CH 3 COOH 1:1:1 na požadované ph upraveno pomocí NaOH A 420 nm 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 Britton-Robinson McIlvain fosfátový pufr Tris/HCl 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ph

Co je obsahem statní zkoušky Biochemické techniky? 1. Enzymy jako analytická činidla ve volné a imobilizované formě. 2. Enzymové metody stanovení analytů. 3. Metody stanovení substrátů, aktivátorů a inhibitorů enzymových reakcí. 4. Enzymové a buněčné biosenzory. Protilátkové elektrody. 5. Využití enzymových metod v klinických laboratořích, při hodnocení potravin a potravinářských surovin a jako obecných analytických metod. 6. Bioanalytické metody využívající radionuklidy. 7. Princip imunochemických metod, protilátky, antigeny, imunoprecipitační metody a jejich využití v praxi. 8. Citlivé imunochemické techniky (ELISA, RIA). 9. PCR techniky, Biočipy 10. Další techniky využívající afinitních vztahů: afinitní precipitace, afinitní ultrafiltrace, afinitní eluce, afinitní elektroforesa, dělení mezi dvě fáze za přítomnosti afinitního ligandu. 11. Elektroforetické metody: PAGE, SDS, imunoelektroforesa. Princip kapilární elektroforesy. 12. MALDI 13. Bioluminiscenční metody. 14. Biologické a mikrobiologické metody v analytice. 15. Chromatografické metody 16. Membránové procesy 17. Hydrofobní chromatografie a chromatografie na reversní fázi 18. Bioafinitní chromatografie. Princip, teorie, experimentální technika. Nespecifická afinitní chromatografie a možnosti jejího využití.