Chromatografické metody

Transkript

1 Chromatografie

2 Chromatografické metody zrod chromatografie: ruský botanik a biochemik M. S. Cvět ( ) v r rozdělil na sloupci práškového CaCO 3 extrakt listové zeleně na několik frakcí různé barvy nejdůležitější a nejčastější analytická a preparační metoda dělení látek (analytů) mezi dvěma fázemi pevnou stacionární fází (SF) a pohyblivou mobilní fází (MF) Při dělení dochází k opakovanému mnohonásobnému ustavování rovnováhy separovaných molekul látek mezi mobilní a stacionární fází (dochází k opakovanému transportu molekul látek do stacionární fáze a zpět do mobilní fáze). video

3 Dělení chromatografických metod podle skupenství mobilní fáze: kapalinovou (Liquid Chromatography, LC ) plynovou (Gas Chromatography, GC) (podle skupenství stacionární fáze chromatografie nedělíme)

4 LC Kapalinová chromatografie (Liquid Chromatography, LC)

5 LC Rozdělení LC podle uspořádání SF planární - papírová (Paper Chromatography, PC) pevnou stacionární fázi tvoří vlákna celulosy papíru nebo rozpouštědlo imobilizované vláknech celulózy - tenkovrstvá (Thin Layer Chromatography, TLC) pevná stacionární fáze je nanesena v tenké vrstvě na inertní podložce nebo je na této vrstvě imobilizovaná ve formě kapaliny kolonová - pevná stacionární fáze je plněná v kolonách

6 LC planární chromatografie Planární chromatografie papírová chromatografie (PC) - adsorpční - stacionární fáze jsou tuhá vlákna papíru (celulóza) - mobilní fáze je kapalná (voda, org. kyseliny, org. rozpouštědla) - rozdělovací - stacionární fáze je kapalina zachycená v papíře (voda, org. rozp.) - mobilní fáze je kapalná (voda, org. kyseliny, org. rozpouštědla) tenkovrstvá chromatografie (TLC) - adsorpční - stacionární fáze je tuhý adsorbent (silikagel, Al 2 O 3 ), který je součástí tenké vrstvy - mobilní fáze je kapalná (voda, org. kyseliny, org. rozpouštědla) - rozdělovací - stacionární fáze je kapalina zachycená v tenké vrstvě - mobilní fáze je také kapalná (voda, org. kyseliny, org. rozpouštědla)

7 LC planární chromatografie

8 LC planární chromatografie TLC Černý inkoust z popisovače Stabilo

9 LC kolonová chromatografie Kolonová chromatografie stacionární fázi tvoří sloupec Separace probíhá v koloně, která obsahuje: - stacionární (nepohyblivou) fázi (sorbent) - mobilní (pohyblivou) fázi (eluent) LC se dělí podle tlaku mobilní fáze: - gravitace (samospád) - nízkotlaká a střednětlaká (cca do 3 MPa) - vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC (High Performance Liquid Chromatography) - řádově desítky MPa

10 LC kolonová chromatografie

11 LC kolonová chromatografie Separace probíhá v CHROMATOGRFICKÉ KOLONĚ 0. minuta analyty jsou nerozdělené (vzorek) na začátku kolony mobilní fáze analyty se v koloně separují do jednotlivých zón 10. minuta mobilní fáze 20. minuta mobilní fáze analyty jsou rozseparovány a vyleuovány z kolony do detektoru

12 LC kolonová chromatografie Přístroj se nazývá CHROMATOGRAF

13 LC kolonová chromatografie Přístroj se nazývá CHROMATOGRAF

14 LC kolonová chromatografie Záznam z měření se nazývá CHROMATOGRAM

15 LC kolonová chromatografie Záznam z měření se nazývá CHROMATOGRAM popis chromatogramu

16 LC kolonová chromatografie stacionání fáze Stacionární fáze požívané v chromatografii Skupenství SF: pevná gelová kapalná Formy SF: aktivní nosič (Active Solid) stacionární fáze je samotný nosič zakotvená (Bonded Phase) kovalentně vázaná na pevný nosič (Solid Support) imobilizovaná (Immobilized Phase) imobilizovaná např. polymerací na povrchu nosiče Výrazu sorbent nebo pouze nosič se často používá i pro označení chromatografické náplně pro jakýkoli druh chromatografické metody, tj. buď samotný aktivní nosič nebo komplex nosič se zakotvenou fází.

17 LC kolonová chromatografie stacionání fáze Základní nosiče používané v kapalinové chromatografii Mechanická stabilita dovolující maximální průtok za současného minimálního ucpávaní kolony způsobené stlačením částeček nosiče. Chemická stabilita a odolnost proti některých působení látek, změnám ph, odolnost při sterilizaci. Vysoká vazebná kapacita snižuje nároky na objem nosiče a závisí na počtu, hustotě a přístupu k vazebným skupinám. U porézních materiálů je důležité, aby póry nosiče byly větší než je velikost molekul dělených látek. Povrch nosiče by měl být inertní, aby nedocházelo k nespecifickým interakcím mezi nosičem a dělenou látkou. Velikost a tvar částic nosiče ovlivňuje jak rychlost průtoku mobilní fáze tak celkový povrch nosiče a tím i množství vazebných míst. Při použití menších částic dochází sice při stejném průtoku ke zvýšení tlaku v koloně, ale zároveň se zvyšuje celkový povrch a tím i vazebná kapacita.

18 LC kolonová chromatografie stacionání fáze Silikagel na bázi křemíku silanolové skupiny (Si-OH) na povrchu - velmi hydrofilní a snadno nahraditelné jinými funkčními skupinami, zakotvenou fází různé druhy chromatografických metod iontoměničová chromatografie nebo chromatografie na reverzní fázi částice velmi pevné - ideálními nosiči pro HPLC chemicky stabilní - odolávají i působení organických rozpouštědel postupné rozpouštění až při hodnotách vyšších než ph 8 může tvořit buď vlastní porézní částice nebo může být nanesen na skleněné mikrokuličky

19 LC kolonová chromatografie stacionání fáze Oxid hlinitý (Al 2 O 3 ) podobné přednosti jako silikagel fyzikální i chemické vlastnosti jsou velmi dobré odolává vysokým tlakům a je odolný vůči rozpouštědlům oproti silikagelu je jeho větší odolnost v širším rozsahu ph neposkytuje povrchové skupiny k chemicky stálým modifikacím se zakotvenou fází Sklo chemickým působením - porézní sklo CPG (Controlled Pore Glass) velmi dobře definované póry, stejně chemicky stálé jako silikagel využití - především v HPLC kolonách

20 LC kolonová chromatografie stacionání fáze Polymery a pryskyřice syntetické organické polymery (styrén, styren-divinylbenzén, methakrylát a formaldehydové pryskyřice nebo jejich směsi) odolávají relativně vysokým tlaků - nevyrovnají se anorganickým nosičům velmi stabilní vůči silným kyselinám i zásadám separace větších molekul jako jsou proteiny nebo polymery polymery polystyrénu a formaldehydové pryskyřice se také připravují ve formě asi 1 mm kuliček a jako nosiče iontoměničových skupin k čištění vody.

21 LC kolonová chromatografie stacionání fáze Celulosa polymer glukosy s β1-4 glykosidickou vazbou tři volné hydroxylové skupiny na jednotku - velmi hydrofilní hydroxylové skupiny - vazba funkčních skupin není moc odolná vůči anorganickým kyselinám, zásadám a oxidačním čin.

22 LC kolonová chromatografie stacionání fáze Dextran polysacharid - glukosa s β1-6 vazbou jako celulosa - tři hydroxylové skupiny - silně hydrofilní snadno derivatizovatelné funkční skupiny méně odolnější - než celulosa síťovaný dextran - stabilní v rozsahu hodnot ph 2-12 póry - lépe definované než v celulosy výrazné změny v objemu v závislosti na ph a iontové síle

23 LC kolonová chromatografie stacionání fáze Agarosa agarosa - polysacharid z agaru (součásti mořských řas Gelidium amansii) velmi porézní hydrofilní gel - nemá velkou odolnost proti působení extrémních hodnot ph síťování dibromopropanolem - odolává ph 3-14 a vysoké teplotě 120 o C síťovacího činidla - velikost pórů v nosiči nesmí být nikdy vysušeny dobré mechanické vlastnosti - nová generace tzv. Fast Flow

24 LC kolonová chromatografie stacionání fáze Polyakrylamid polyakrylamidové gely - polymerizace akrylamidu se síťovacím činidlem N,N -methylen bisakrylamidem hydrofilní a velmi dobré mechanické vlastnosti velmi odolné vůči působení kyselin a zásad dobře autoklávovatelné gelová a iontoměničová chromatografie

25 LC kolonová chromatografie stacionání fáze Vliv tvaru částic nepravidelné částice - menší specifický povrch - nízká cena - preparativní velkoobjemové izolace pravidelné sférické částice - hlavní místo v analytických i v preparativních aplikacích - velkém rozsahu velikostí (1,7-100 µm) - snadné a reprodukovatelné plnění do kolon - vysoká účinnost - výborná stabilita částic - nízký zpětný tlak v kolonách

26 LC kolonová chromatografie stacionání fáze Vliv velikosti částic velikosti pod 1,9 μm pro UHPLC kolony, cca 2,6 5 μm pro HPLC kolony, desítky μm až jednotky mm do preparativních kolon velikost částic ovlivňuje: - zpětný tlak v chromatografickém systému (nepřímo úměrný druhé mocnině průměru částice ) - účinnost dělení: menší částice poskytují vyšší účinnost při stejných rozměrech kolony Kolona s částicemi o rozměrech 3 μm má až 2x vyšší účinnost dělení než stejná kolona s částicemi o rozměrech 5 μm (zpětný tlak je však až 4x vyšší)!

27 LC kolonová chromatografie stacionání fáze Vliv velikosti částic 5 µm 1,7 µm

28 LC kolonová chromatografie stacionání fáze 5 µm Vliv velikosti částic 1,7 µm

29 LC kolonová chromatografie stacionání fáze 5 µm Vliv velikosti částic 1,7 µm

30 LC kolonová chromatografie stacionání fáze Specifický povrch částic celkový povrch částic nosiče včetně povrchu pórů vztažený na jednotku hmotnosti - m 2 /g běžné hodnoty se pohybují od 100 do 200 m 2 /g nepřímo úměrný velikosti částic přímo úměrný objemu a nepřímo úměrný velikosti pórů

31 LC kolonová chromatografie Rozdělení kolonové LC chromatografie na základě typu interakce dělené látky a stacionární fází adsorpční chromatografie (systém kapalina pevná látka) - na polárních sorbentech (na tzv. normální fázi) - na nepolárních sorbentech (na tzv. obrácené fázi); variantou pro separace biopolymerů je hydrofobní chromatografie rozdělovací chromatografie (systém kapalina kapalina) - v kolonovém uspořádání iontově výměnná chromatografie (ionexová, iontoměničová) gelová permeační chromatografie (vylučovací,size exclusion chromatografie) afinitní chromatografie

32 LC kolonová chromatografie adsorpční chrom. Hydrofobní interakce Adsorpční chromatografie (Adsorption chromatography) van der Waalsovy síly působící mezi permanentními nebo indukovanými dipóly molekul Polarita látky počet a polarita funkčních skupin nasycené uhlovodíky < nenasycené uhlovodíky < ethery < estery < aldehydy < ketony < alkoholy < kyseliny Polarita stacionární a mobilní fáze polarita stacionární fáze různé typy zakotvených fází polarita mobilní fáze směs různých rozpouštědel

33 LC kolonová chromatografie adsorpční chrom. Stacionární fáze v adsorpční chromatografii Chromatografie na normální fázi (Normal Phase Chromatography) Chromatografie na obrácené fázi (Reversed-Phase Chromatography)

34 LC kolonová chromatografie adsorpční chrom. Chromatografie na normální fázi stacionární fáze je polárnější než mobilní fáze dochází k dipól-dipólovým interakcím polárních skupin separovaných látek s polárními skupinami na povrchu stacionární fáze Stacionární fáze silikagel nebo oxid hlinitý zakotvené (chemicky vázané) fáze - polární skupiny na bázi aminů, nitrilů a diolů na silikagelových nosičích Mobilní fáze organická rozpouštědla a jejich směsi Použití: separace neiontových látek s různými funkčními skup.

35 LC kolonová chromatografie adsorpční chrom. Chromatografie na obrácené fázi stacionární fáze méně nepolární než mobilní dochází k hydrofobním interakcím Stacionární fáze různě dlouhé alifatické uhlovodíkové řetězce (zejména C18) vázané na silikagelu hydrofobní polymery (styren-divinylbenzen) Mobilní fáze směs vody a metanolu, acetonitrilu, acetonu nebo jiných organických rozpouštědel Použití: analýza pesticidů, léčiv, metabolitů, kontaminantů

36 LC kolonová chromatografie adsorpční chrom. Stupeň polarity stacionární fáze je určen typem zakotvené fáze Název Označení Vzorec Amino NH 2 Nitril (Cyano) CN Diol Diol Methyl C1 Butyl C4 Hexyl C6 Oktyl C8 Oktyldecyl C18, ODS Fenyl Fenyl

37 LC kolonová chromatografie adsorpční chrom. Další faktory ovlivňující separaci látek Carbon loading procentuálním zastoupení uhlíku ve stacionární fázi - se stoupajícím zastoupením uhlíku se zvyšuje i rozlišovací schopnost stacionární fáze Endcapping = druhotná ochrana silanolových skupin silikagelu - používá se pro potlačení vlivu volných silanolových skupin, které nežádoucím způsobem selektivně interagují s polárními (hlavně s bazickými látkami) - pro zabránění chvostování píků a nereprodukovatelnosti separací

38 LC kolonová chromatografie adsorpční chrom. Hydrofobní chromatografie (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC) specifický termín pro adsorpční chromatografii biopolymerů (zvl. proteinů) na nepolární (obrácené) fázi. některé proteiny se mohou adsorbovat na hydrofobní povrchy dochází k velice slabým neiontovým interakcím proteinů se stacionární fází. síla vazby k bílkovině se zvyšuje v pořadí: methyl, isopropyl, butyl, oktyl,fenyl a oktyldecyl Stacionární fáze: hydrofilní matrice (agarosa) modifikovaná oktylovými nebo fenylovými skupinami Mobilní fáze: např. vodný pufr (eluce se provádí gradientově s klesající koncentrací solí) Použití: k čištění hydrofobních proteinů

39 LC kolonová chromatografie Iontově výměnná chrom. Iontově-výměnná chromatografie (Ion-Exchange Chromatography, IEC) separace na základě silných elektrostatických interakcích mezi ionizovanými funkčními skupinami měniče (stacionární fáze) a opačně nabitými ionty v okolním roztoku (mobilní fáze) reverzibilní vazba iontů funkčních skupin dělené látky s ionizovanými funkčními skupinami na chromatografickém nosiči ionexu dělení látky na základě: - jejich elektrických vlastností - množství a druhu nabitých funkčních skupin rozhoduje velikost elektrostatických sil

40 LC kolonová chromatografie Iontově výměnná chrom.

41 LC kolonová chromatografie Iontově výměnná chrom. Vliv náboje, koncentrace analytu a typu analytu ionty s vyšším nábojem vytěsňují ionty s nábojem nižším ionty s větším průměrem vytěsňují ionty s menším průměrem Toho se využívá při vytěsňování částic uchycených na nosiči Kationty: Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+ Anionty: I- > NO3- > PO4- > CN- > HSO3- >Cl- > HCO3- > HCOO- > CH3COO- > OH- > F- uplatňuje se však i obecný princip chemické rovnováhy - dostatečná koncentrace iontů se slabší vazbou vytěsní i ionty vázané pevněji

42 LC kolonová chromatografie Iontově výměnná chrom. Podmínky při iontově výměnné chromatografii Stacionární fáze se nazývá ionex neboli iontoměnič a dále se rozdělují podle náboje funkční skupiny na: - anexy (kladně nabité, přitahují anionty) - katexy (záporně nabité, přitahují kationty) Silné úplná disociace funkčních skupin přes celou oblast ph (ph 3-11), používají se častěji Slabé užší rozmezí ph, funkční skupiny jsou disociovány jen částečně při hodnotách ph nižších než je pi (látka je nabita kladně) použít katex při hodnotách ph vyšších než je pi (látka je záporně nabitá) použít anex Výběr stacionární fáze - závislý na hodnotě pi bílkoviny - na ph při izolaci omezení ph stabilitou bílkovin rozdělení bílkovin jejichž pi se výrazně liší - nastavit ph pufru mezi hodnoty pi vždy jedna z bílkovin se zachytí na nosiči a druhá proteče

43 LC kolonová chromatografie Iontově výměnná chrom. Vzorec Název Zkratka Silný anex -CH 2 N + (CH 3 ) 3 trimethylaminomethyl TAM -C 2 H 4 N + (C 2 H 5 ) 3 triethylaminoethyl TEAE -C 2 H 4 N + (C 2 H 5 ) 2 CH 2 CH(OH)CH 3 diethyl-2-hydroxypropylaminoethyl QAE, Q Slabý anex -C 2 H 4 N + H 3 Aminoethyl AE -C 2 H 4 NH(C 2 H 5 ) 2 diethylaminoethyl DEAE Silný katex -SO - 3 sulpho S -CH 2 SO - 3 sulphomethyl SM -C 3 H 6 SO - 3 sulphopropyl SP Slabý katex -COO - carboxy C -CH 2 COO - carboxymethyl CM Silné ionexy - rozdělení slabých elektrolytů (látek, které potřebují ke své ionizaci extrémní hodnoty ph) Slabé ionexy - dělení v rozmezí ph 6-9 nehrozí nebezpečí denaturace bílkovin nevážou na sebe slabě nabité molekuly nečistoty nevyžadují tak silné eluční podmínky

44 LC kolonová chromatografie Iontově výměnná chrom. Mobilní fáze používané při IEC vodné roztoky pufrů ph alespoň o jednotku vyšší nebo nižší než je pi separované látky nutná určitá iontová síla k zamezení: - nespecifickým interakcím mezi dělenou látkou a nosičem (např. k hydrofobním interakcím) - příliš silné vazbě mezi separovanou látkou a ionexem - vazbám nečistot na nosič iontová síla se musí předem stanovit, většinou se používá mm NaCl Typ nosiče pufr pk pufrační rozmezí katex Acetátový 4,76 4,8-5,2 Citrátový 4,76 4,2-5,2 MES 6,15 5,5-6,7 fosfátový 7,2 6,7-7,6 HEPES 7,55 7,6-8,2 anex Histidin 6,15 5,5-6,0 Imidazol 7 6,6-7,1 Tris 8,16 7,5-8,0

45 LC kolonová chromatografie Iontově výměnná chrom. Vytěsnění (eluce) separovaných látek z ionexu změna iontové síly mobilní fáze zvyšující koncentrace doplňkových iontů, které postupně vytěsňují separované látky změna ph dochází ke změně stupně ionizace jak separované látky tak i ionexu, což způsobí oslabení a přerušení vzájemné interakce (např. bílkoviny při ph lišícím se přibližně o 0,5 jednotky od jejich pi)

46 LC kolonová chromatografie Iontově výměnná chrom. Způsoby vytěsnění (eluce) separovaných látek z ionexu Isokratická eluce pouze jeden typ elučního činidla složení mobilní fáze je konstantní Skoková eluce složení mobilní fáze se v průběhu eluce mění skokově Gradientová eluce složení mobilní fáze se v průběhu eluce mění kontinuálně

47 LC kolonová chromatografie Iontově výměnná chrom. Gradient maker Gradient maker jsou dvě spojené nádoby Tvarem nádob se ovlivní tvar gradientu Různá strmost gradientové eluce ovlivňuje rozlišení, ale i šířku píku (a tím i poměr S/N)

48 LC kolonová chromatografie Iontově výměnná chrom. Význam IEC v biochemii nejrozšířenější chromatografická metoda v biochemii používá se hlavně pro izolaci bílkovin bílkoviny jsou složeny z kyselých a bazických aminokyselin celkový náboj bílkoviny závisí na počtu jednotlivých kladně a záporně nabitých aminokyselin a na ph prostředí pi bílkovin = ph, při kterém je bílkovina elektroneutrální a není zadržována v koloně. V této oblasti ph má změna ph mobilní fáze největší vliv na retenci látek Protein pi ph 4.8 ph 7.2 ph 8 Carbonic Anhydrase Carboxypeptidase B Chymotrypsin Lysozyme

49 LC kolonová chromatografie gelová permeační chrom. Gelová permeační chromatografie (Size Excluzion Chromatography, SEC) separace na základě velikosti a tvaru molekul nedochází (nemělo by docházet) k vzájemným interakcím separované látky jak s mobilní fází, tak i se stacionární fází! jedná se o tzv. molekulové síto molekuly při průchodu kolonou dostávají až do pórů stacionární fáze, a tím jsou v koloně zadržovány čím menší je molekula, tím se dostane hlouběji do pórů a tím déle zůstává v koloně vhodné vždy pro určitý rozsah Mr - menší molekuly zůstanou v koloně - větší molekuly projdou bez zádrže

50 LC kolonová chromatografie gelová permeační chrom.

51 LC kolonová chromatografie gelová permeační chrom. Výběr stacionární fáze trojrozměrná síť pórů definované velikosti polyakryamid, agarosa, dextran nebo jejich vzájemně zesíťované kombinace, porézní sklo v ideálním případě nedochází k nespecifické interakci gelu se separovanými látkami často však dochází k adsorpci látek na gel (negativní jev) potlačení iontových interakcí vyšší iontovou silou v mobilní fázi - koncentrace NaCl mm polačení hydrofobních interakcí - přítomnost iontů snížit nebo vyloučit komerčně dostupné nosiče dělící rozsah od molekulové hmotnosti 100 g/mol až do g/mol

52 LC kolonová chromatografie gelová permeační chrom. Vliv tvaru separovaných látek globulární proteiny membránové proteiny podlouhlá vlákna polysacharidy nebo glykoproteiny podlouhlé částice se zadržují méně minimalizace použitím denaturačních činidel (močovina) - náhodné klubko vláknité polysacharidy - prostředí s vysokou iontovou silou - částice kulového tvaru.

53 LC kolonová chromatografie gelová permeační chrom. Izolace, čištění a analýza vzorků Použití Stanovení relativní molekulové hmotnosti - Eluční objem resp. retenční čas - závislý relativní molekulové hmotnosti (Mr) - v určitém rozsahu je eluční objem lineárně úměrný přirozenému logaritmu relativní molekulové hmotnosti (log Mr) - kalibrační křivka z proteinů o známých hmotnostech - určení hmotností dělených proteinů Zahušťování Voda a malé molekuly jsou nasáty do polymeru, a tím dojde zahuštění makromolekulárních látek v roztoku Odsolování Odstranění jiných nízkomolekulárních látek z roztoku jako např. fenolu nebo sacharózy.

54 LC kolonová chromatografie afinitní chrom. dělení látek - jedinečné, vysoce selektivní (někdy specifické) a reverzibilní biologické interakce s ligandy za tvorby specifického komplexu na principu zámek klíč Afinitní chromatografie (Affinity Chromatography) původně - čištění enzymů reakcí enzymového substrátu jako ligandu s enzymem ligandy - nízkomolekulární látky (substráty pro enzymy, peptidy) - celé bílkoviny (interakce protilátka antigen) mnohdy - záměna ligandu a izolované látky (izolovaná látka např. lektin - ligand k izolaci cukrů)

55 LC kolonová chromatografie afinitní chrom. Schéma separace a eluce

56 LC kolonová chromatografie afinitní chrom.

57 LC kolonová chromatografie afinitní chrom. ligand typ interakce izolovaná látka enzymový substrát enzym substrát enzym lektin cukr-lektin glykoprotein protilátka protilátka-antigen bílkovina protein A (protein G) protein A(G)-protilátka imunoglobulin iont kovu kov-aminokyselina bílkovina hormon hormon-receptor bílkovina pigment (triazin) pigment-protein protein thiol kovalentní chromatografie protein inhibitor proteáz mastné kyseliny nukleotidy biotin heparin proteázy proteiny nukleové kyseliny avidin protein

58 LC kolonová chromatografie afinitní chrom. Podmínky nutná znalost struktury a vlastností dělené látky nutnost nastavení přesně definovaných podmínek pro vazbu na ligand a pro jeho následné vytěsnění prostorová dostupnost vazebného místa vazebné místo nemusí být přímo na povrchu částice, ale musí být dostupné pro separovanou látku příprava stacionární fáze - vazba ligandu na nosič pomocí raménka (několika uhlíkový řetězec) - vhodná vzdálenost mezi nosičem a separovanou látkou k snížení pravděpodobnosti nespecifické interakce - délka raménka je individuální a je nutno ji stanovit pomocí experimentu - raménko obsahuje zpravidla 6 8 atomů uhlíku za optimálních podmínek dochází pouze k vazbě ligandu a námi požadované látky a ostatní látky včetně nečistot jsou vymyty eluce (vytěsnění) se provádí narušením vazby ligand - izolovaná látka pomocí: - změny ph mobilní fáze - dodání podobného ligandu do mobilní fáze, který vytěsní stávající ligand - dodáním podobné látky do mobilní fáze, která vytěsní izolovanou látku

59 LC kolonová chromatografie afinitní chrom. musí obsahovat dostatečné množství vhodných funkčních skupin k vazbě ligandu nebo raménka s ligandem nosič i vazba nosič ligand musí být stálé nesmí nespecificky interagovat (nebo pouze minimálně) s molekulami ostatních látek a nečistot dobré fyzikální vlastnosti - odolnost vůči tlaku, dostatečné průtokové rychlosti materiály nosičů - síťované polysacharidy např. dextran, agarosa, celulosa - polyakrylamidové gely, polystyreny, porézní sklo, silikagel aj. Vazba ligandu na nosič příprava nosiče Nosiče v afinitní chromatografii komerčně dostupný nosič - aktivovaný a připravený k navázání ligandu - s navázaným ligandem

60 LC kolonová chromatografie afinitní chrom. Bromkyanová metoda - nejrozšířenější - kladně nabitá (pka ~ 9,5) a může částečně působit jako ionexová skupina. - extrémní ph - pomalá hydrolýza - bromkyan - toxický - běžně dostupné komerční nosiče předem aktivované bromkyanem Bisepoxidová metoda. - dochází ke vložení raménka mezi nosič a ligand - délka se řídí výběrem vhodného bis-epoxidu Triazinová metoda Některé metody vazby ligandu na nosič Sulfonyl chloridová metoda

61 LC kolonová chromatografie afinitní chrom. Některé metody vazby ligandu na nosič Karbonyldiimidazolová metoda - polysacharidový nosič - karbonyldiimidazol (CDI) není toxický - nevznikají vedlejší skupiny, které by měly iontoměničový charakter Glutaraldehydová metoda - aminové skupiny polyakrylamidového gelu nebo agarosy - aktivace glutaraldehydem - jednoduchá, účinná a levná metoda - konkrétní postupy - součástí návodu dodaného výrobcem daného nosiče OHC-(CH 2 ) 3 -CHO + NH 2 -R OHC-(CH 2 ) 3 -CH=N-R

62 LC kolonová chromatografie detektory Detektory úkolem je detekovat složky v mobilní fázi při opouštění kolony vyžaduje se rychlá odezva, velká citlivost, velká selektivita, univerzálnost, stabilita nulové linie TYPY DETEKTORŮ spektrofotometrický detektor (spectrophotometric detector, UV/VIS) - na principu absorpce záření v oblasti vlnových délek nm a měření absorbance - kvantitativní analýza na základě Lambert-Beerova zákona - vhodné pro široké spektrum organických sloučenin - nejběžnější detektor v kapalinové chromatografii fluorescenční detektor (fluorescence detector, FLD) - na principu fluorescence a měření sekundárního (emisního) záření, které látka uvolní po absorpci primárního (excitačního) elektromagnetického záření - kvantitativní analýza na základě měření intenzity fluorescenčního záření - vhodné pouze pro fluoreskující sloučeniny (např. polyaromatické uhlovodíky)

63 LC kolonová chromatografie detektory Detektory úkolem je detekovat složky v mobilní fázi při opouštění kolony vyžaduje se rychlá odezva, velká citlivost, velká selektivita, univerzálnost, stabilita nulové linie TYPY DETEKTORŮ elektrochemický detektor (electrochemical detector, ED) - na principu elektrochemické reakce sloučenin na fázovém rozhraní elektroda mobilní fáze a měření některé elektrochemické veličiny (elektrodový potenciál, proud) - kvantitativní analýza na základě intenzity měřené elektrochemické veličiny - vhodné pouze pro sloučeniny podléhající elektrochemické reakci za daným podmínek - významný při analýze léčiv, přírodních produktů, polutantů aj. hmotnostní detektor (mass detector, MS) - na principu separace nabitých částic v elektrickém a magnetickém poli - sloučeniny jsou ionizovány a vzniklé ionty jsou rozděleny podle své specifické hmotnosti (poměr hmotnosti a náboje, tzn. podle m/z) - intenzita signálu je úměrná množství iontů o příslušné specifické hmotnosti - téměř ideální, citlivý a selektivní detektor pro stopovou detekci a identifikaci neznámých látek - některé nejnovější typy jsou vhodné i pro strukturní analýzu!

64 GC Plynová chromatografie (Gas Chromatography, GC)

65 GC Princip plynové chromatografie separační metoda k separaci plynů a par kapalin využívající k separaci dvě heterogenní fáze. mobilní fází (pohyblivou) je inertní plyn tzv. nosný plyn stacionární fází (nepohyblivou) je kapalina fyzikálně zakotvená či chemicky vázaná na inertním nosiči nebo povrchově aktivní adsorbent různé látky mají různou afinitu ke stacionární fázi a tím jsou různě dlouho zadržovány v koloně. vzhledem k nutnosti aplikace vysokých teplot (běžně C) je plynová chromatografie vhodná pouze pro nízkomolekulární, málo polární a termostabilní sloučeniny, které lze za určitých podmínek převést do plynného skupenství MF je inertní plyn! Nemá afinitu ani k SF, ani k separovaným látkám!

66 GC Separace probíhá v CHROMATOGRFICKÉ KOLONĚ 0. minuta analyty jsou nerozdělené (vzorek) na začátku kolony nosný plyn analyty se v koloně separují do jednotlivých zón 10. minuta nosný plyn 20. minuta nosný plyn analyty jsou rozseparovány a vyleuovány z kolony do detektoru

67 GC Přístroj se nazývá CHROMATOGRAF

68 GC Přístroj se nazývá CHROMATOGRAF

69 GC Záznam z měření se nazývá CHROMATOGRAM

70 GC Záznam z měření se nazývá CHROMATOGRAM popis chromatogramu

71 GC nosné plyny Nosné plyny a dávkování Nosný plyn: N 2, H 2, He, Ar Dávkování - se provádí speciální stříkačkou (tzv. hamiltonkou) do nástřikové hlavy opařené septem, která je vyhřívána nazvolenou teplotu a proplachována nosným plynem (MF) - teplota nástřikové hlavy musí být minimálně o C vyšší než je teplota kolonového prostoru - musí být rychlé a reprodukovatelné - musí být zachováno složení vzorku separované látky nesmí být při zplynění rozloženy nebo nedokonale zplyněny či absorbovány - vhodné pouze pro plyny, nízkomolekulární organické látky, těkavé látky nebo látky, které lze na těkavé převést chemickou reakcí (derivatizací) - množství dávkovaného vzorku plynné vzorky: 0,1 až 10 ml kapalné vzorky: 0,1 až 10 µl tuhé vzorky pomocí spec. dávkovačů

72 GC kolony Kolony Náplňové - skleněné nebo z nerezové oceli - vnitřní průměr 1 až 6 mm, délka 0,5 až 5 m - SF je nasypaná v koloně a to ve formě adsorbentu (GSC) nebo jako kapalina zakotvená na inertním nosiči (GLC) - průměr částic SF je µm Kapilární - dříve skleněné nebo z nerezové oceli, dnes výhradně křemenné potažené polyimidem - vnitřní průměr 0,05 až 1 mm, délka 10 až 100 m - SF není v koloně nasypána ale je imobilizována jen na stěnách! - SF může být kapalina zakotvená na vnitřních stěnách kapiláry (typ WCOT) kapalina zakotvená na nosiči, který je zachycený na vnitřní stěně kapiláry (typ SCOT) adsorbent, který je zachycen na vnitřní stěně kapiláry (typ PLOT)

73 GC stacionární fáze Stacionární fáze - nosiče inertní, bez adsorpčních schopností, dostatečně tvrdý, dostatečný specifický povrch a dostatečný objem dutin materiál - tvrdý pórovitý materiál (náplňové kolony) - stěny kapilární trubice (kapilární kolony)

74 GC stacionární fáze Stacionární fáze pro adsorpční GC jedná se o SF pro GC v systému plyn adsorbent (GSC) adsorbent je v náplňové koloně nebo na vnitřních stěnách kapilární PLOT kolony příklady SF: - aktivní uhlí, grafitizované uhlí dělení plynů a lehkých uhlovodíků - silikagel dělení anorganických plynů a nízkovroucích kapalin - molekulová síta (krystalické hlinitokřemičitany) 5A dělení plynů a lehčích uhlovodíků 4A jako sušidla - porézní polymery (vinylbenzenové kopolymery, akrylátové estery, polyvinylpyrolidon), komerčně tzv. Porapaky dělení nízkomolekulárních uhlovodíků, anorganických plynů, alkoholů, esterů a ketonů

75 GC stacionární fáze Stacionární fáze pro rozdělovací GC jedná se o SF pro GC v systému plyn kapalina (GLC) stacionární fází je kapalina zakotvená na vnitřních stěnách kapilární WCOT kolony nebo na nosiči, který je umístěn na vnitřních stěnách SCOT kolony aby se zabránilo úniku SF z kolony (tzv. krvácení), zakotvují se tyto kapaliny na nosič chemickými vazbami je popsáno více než 1000 těchto SF, prakticky stačí 5 9 SF obecné požadavky na kapaliny pro SF v GLC - dobře rozpouští separované látky - rozpustnost složek vzorku v těchto kapalinách je různá - mají nízkou těkavost (1 až 10 Pa při pracovní teplotě) - teplotně stálé - nesmí reagovat se složkami vzorku - mají nízkou viskozitu při pracovní teplotě - musí smáčet nosič

76 GC stacionární fáze Stacionární fáze pro rozdělovací GC Příklady SF: - Carbowaxy (polyethylenglykoly) - Ucony (polypropylenglykoly) polární stacionární fáze s rostoucí Mr klesá polarita - Polyestery (např. polyethylenglykoladipáty, polypropylenglykoladipáty, polyethylenglykolsukcináty) polární stacionární fáze - Silikonové stacionární fáze (polysiloxany) (např. methylpolysiloxan SE-30, fenylmethylpolysiloxan OV-17, fenylpolysiloxan SE-54, kyanopropylpolysiloxan SP-2340) často používané, široký rozsah polarity

77 GC termostat Termostat aby bylo možné reprodukovatelně měřit eluční charakteristiky, je nezbytné kolonu termostatovat zajišťuje regulovaný přívod tepla do prostoru s chromatografickou kolonou, který je dobře izolován od okolí základním úkolem termostatu je rychlé a reprodukovatelné ohřívání, udržování požadované teploty a chlazení kolony kontinuální zvyšování teploty v průběhu analýzy se nazývá teplotní gradient a slouží k postupnému vytěsňování (eluci) separovaných látek z kolony Ovlivňování retence analytů je v GC prováděno zejména změnou teploty S rostoucí teplotou klesá retenční čas analytů (vyšší teplota snadněji vypudí analyty z kolony)

78 GC detektory Detektory úkolem je detekovat složky v nosném plynu při opouštění kolony vyžaduje se rychlá odezva, velká citlivost, velká selektivita, univerzálnost, stabilita nulové linie TYPY DETEKTORŮ vodivostní detektor (Thermal Conductivity detector, TCD) - změna tepelné vodivosti vlákna (W aj.) při eluci analytu z kolony - univerzální detekce, ale neselektivní a s vysokými mezemi detekce - nosný plyn malé molekuly, např. vodík - jedinečné řešení pro analýzu nízkomolekulárních plynů, nespalitelných látek, látek s nízkým obsahem uhlíku a málo těkavých látek plamenově ionizační detektor (Flame Ionization Detector, FID) - eluované látky z kolony jsou přiváděny do vodíkového plamene mezi dvě elektrody s vloženým potenciálovým rozdílem - zde dochází ke spálení molekul eluovaných látek za vzniku iontů - vzniklé ionty umožní průchod proudu mezi elektrodami, vzniká (mění se) proud, který je odezvou detektoru - univerzální odezva pro organické spalitelné látky ve vodíkovém plameni

79 GC detektory Detektory detektor elektronového záchytu (Electron Capture Detector, ECD) - v detektoru je zdroj elektronů (beta zářič), který produkuje pomalé e - - při eluci elektronegativní látky z kolony nastane pokles proudu elektronů, dojde ke snížení signálu a tím ke vzniku odezvy detektoru - vynikající citlivost až do řádu pg v nástřiku pro látky s halogeny, s nitroskupinami, konjugovanými vazbami specifický detektor - balasty jako tuky se nedetekují, ale kontaminují detektor, zhoršují jeho funkci, je nutná periodická údržba. hmotnostní detektor (Mass Spectrometry Detector, MS) - látky jsou po eluci z kolony přiváděny do iontového zdroje, kde dochází k jejich ionizaci za vzniku iontů - ionty jsou poté vedeny do hmotnostního analyzátoru, kde jsou rozděleny v plynné fázi za vakua podle své specifické hmotnosti = poměr hmotnosti a náboje, tzn. podle m/z - intenzita signálu je úměrná množství iontů o příslušné spec. hmotnosti - téměř ideální, citlivý a selektivní detektor pro stopovou detekci a identifikaci neznámých látek. - některé nejnovější typy jsou vhodné i pro strukturní analýzu!

80 Děkuji za pozornost