Cvičení č. 2: Pasážování buněk 1) Teoretický základ Kultivace buněk in vitro (ve zkumavce) - Snaha o napodobení podmínek v organismu - Používání jednorázového spotřebního materiálu a speciálních chemikálií pro kultivaci buněčných kultur - Vyškolený personál (čistota a přesnost práce) Primární kultura: laboratorní zvíře, člověk (první kultura izolovaných buněk) - Množení buněk - Naředění a přenesení do nových kultivačních nádob = pasážování sekundární kultura/subkultura Primární kultura o normální tkáň omezená životnost (stárnutí kultury) o nádorová tkáň snazší kultivace (rychlá a neomezená proliferace) Kultivační podmínky - povrch kultivační nádoby - složení kultivačního média - teplota: 37 C - složení atmosféry: 5% CO 2 (odpovídá poměrům v extracelulární tekutině, podílí se na udržení ph médií s bikarbonátovým pufrem) + relativní vlhkost atmosféry 90% (zamezení odpařování vody z kultivačního média) - adherentní buněčné kultury: rostou na vhodném kultivačním povrchu (polystyrenová nádoba s hydrofilním povrchem, popř. potažená adhezními faktory polypeptidy, kolagen, fibronektin, laminin) - buněčné kultury pěstované v suspenzi (např. krevní buňky) promíchávání kultury Inkubátory pro kultivaci buněčných kultur - regulace teploty, koncentrace CO 2 - snadné čištění, dezinfekce, sterilizace povrchů Kultivační média - tvoří tenkou vrstvu kapaliny nad adherovanými buňkami dostatečně rychlá difúze O 2 a CO 2 - výměna média 2x-3x týdně - obsahuje anorganické soli, pufry, glukózu, esenciální aminokyseliny, vitaminy, bílkoviny, růstové faktory, mastné kyseliny, lipidy, stopové prvky - přídavek séra pro doplnění významných organických látek (růstové faktory, bílkoviny, vitaminy, stopové prvky) nejčastěji bovinní sérum (fetální telecí) - fetální sérum - obsahuje více růstových faktorů
- sterilizace sér filtrací, tepelnou inaktivací zabrání přenosu virové infekce - ph 7,4 - acidobazický indikátor fenolová červeň (jasně červený při ph 7,4; kyselé ph žlutý; zásadité ph fialový) - rostoucí buňky vylučují do média kyselé metabolity (zežloutnutí nutnost výměny média) - přídavek antibiotik/antimykotik - zábrana kontaminace Růst buněčné kultury A) statická fáze (lag fáze): příprava na buněčné dělení B) exponenciální (log) fáze: intenzivní množení buněk do vyčerpání živin C) stacionární fáze (plató): počet buněk se nemění, počátek akumulace toxických produktů D) fáze odumírání T (osa x)=čas L (osa y)=počet buněk v kultuře - při kultivaci snaha o udržení log fáze (exponenciální nárůst počtu buněk) - kontaktní inhibice zastavení dělení - před dosažením plató fáze se kultura naředí a nasadí do nových kultivačních nádob v takové hustotě, aby rostla opět exponenciálně - konfluence=stav, kdy je vytvořena souvislá vrstva buněk (monolayer), které se vzájemně dotýkají Pasážování buněk - uvolnění adherentních buněk od kultivačního povrchu i od sebe navzájem, přenesení do nové kultivační nádoby s čerstvým médiem - disociace buněk: odstranění dvojmocných iontů (EDTA chelatačně váže Ca 2+, Mg 2+ ) a působení proteáz (trypsin)
2) Praktické cvičení: a) Pasážování buněk Pasážování se provádí, pokud jsou buňky konfluentní ze 70-80% (pokrývají 70-80% povrchu kultivační nádoby). Zkontrolujte mikroskopicky nárůst buněk a uveďte stupeň konfluence do protokolu. K pasáži jedné 25 cm 2 kultivační lahvičky je potřeba: 1 ml trypsinu, 2 ml pufru PBS, kompletní médium (DMEM+10% FBS+1% atb). Před vlastním pasážováním si do boxu připravit vše potřebné. Vždy postříkat etanolem (zejména víčka), otřít a vložit do boxu. Připravené médium má stabilitu cca týden, je možné připravit si do zásoby. Příprava: pipety (dle počtu a velikosti pasážovaných kultivačních lahviček) pasterky odpadní kádinku PBS pufr médium zahřáté na 37 C Trypsin zahřátý na 37 C Médium: 87 ml DMEM High Glucose 10 ml inaktivovaného FBS (vyndat z mrazáku a rozmrazit) 1 ml antibiotik (vyndat z mrazáku a rozmrazit) 1 ml L-Glutaminu (vyndat z mrazáku a rozmrazit) 20 µl sterilního 7,5% NaHCO 3 Připravené médium přefiltrovat přes 0,2 µm filtr do sterilní skleněné lahvičky. Pasážování: 1. Z kultivační lahvičky (25 cm 2 ) odsát médium, přidat k buňkám cca 2 ml sterilního PBS pufru. Buňky opláchnout a pufr odsát. 2. Přidat 0,5 ml nahřátého trypsinu. Buňky opláchnout a trypsin odsát. 3. Přidat 0,5 ml nahřátého trypsinu a kultivační lahvičku vložit na 2 minuty do termostatu (mikroskopická kontrola- zakulacení buněk, plavání v médiu). 4. Po trypsinizaci buňky jemně mechanicky sklepat ze dna a přidat 1 ml připraveného nahřátého média (DMEM / MEM). Buňky šetrně resuspendovat v tomto médiu (rozbít shluky buněk). 5. Určit počet buněk v 1 ml pomocí Bürkerovy komůrky (viz další úkol) 6. Přenést 1x10 5 buněk do nové 25 cm 2 kultivační lahvičky a přidat čerstvé médium (celkový objem 5 ml). 7. Popsat lahvičku typ buněk, pasáž, datum, jméno
8. Buňky v nové kultivační lahvičce zkontrolovat pod mikroskopem a vložit do termostatu. Ukončení práce: Jednorázový spotřební materiál vyhodit do biologického odpadu, zbytek umýt. Povrchy v boxu vytřít etanolem a nechat vysvítit UV po dobu 20 min. Úkoly: Buňky pozorujte pod optickým mikroskopem a zakreslete jejich strukturu, popište jejich části, uveďte zvětšení mikroskopu. b) Stanovení počtu živých buněk pomocí Bürkerovy komůrky 1. K 0,5 ml dobře promíchané buněčné suspenzi se přidá 0,5 ml roztoku trypanové modři. 2. Po 5 až 15 minutách se suspenze dobře promíchá a pomocí 1 ml automatické pipety se jí naplní obě poloviny Bürkerovy komůrky. Je třeba aplikovat takové množství vzorku, aby se komůrka právě naplnila, roztok nesmí přetékat do okolních žlábků. 3. Pod světelným mikroskopem se při nejmenším zvětšení počítají zvlášť živé (bezbarvé) a mrtvé (modré) buňky. Počítá se nejprve 5 čtverců (4 rohové a středový) 1 1 mm v jedné polovině komůrky. Je-li celkový počet buněk menší než 100, počítají se buňky i v dalších 5 čtvercích ve druhé polovině komůrky. Za hranici čtverce se považuje prostřední linka z trojité čáry. Z buněk, které leží na okraji čtverce, se počítají ty, které se i jen dotýkají levého nebo horního okraje, a naopak se nepočítají buňky, které se i jen dotýkají pravého nebo dolního okraje. 4. Počet buněk se vypočítá podle vzorce, kde: P je počet buněk na 1 ml suspenze N je celkový počet buněk D = 2 (ředění suspenze) H = 0,1 (objem čtverce, ve kterém buňky počítáme) S je počet čtverců 5. Vypočítá se podíl živých buněk v procentech
Úkoly: Uveďte, jak jste postupovali při počítání buněk v Bürkerově komůrce i s dílčími výpočty, zapište výsledek c) Nativní preparát buněk bukální sliznice Materiál a pomůcky: Podložní a krycí sklíčka, vatové tyčinky, stěr z bukální sliznice, destilovaná voda, kádinky, čtverek buničité vaty. Vlastní pokus: Před odebráním bukální sliznice si důkladně vodou vypláchněte ústa, aby se odstranily baktérie a zbytky jídla. Potom jedním koncem vatové tyčinky několikrát seškrábnete povrch bukální sliznice a získaný materiál rychle rozetřete v tenké vrstvě na čisté podložní sklo, přikryjete krycím sklíčkem a přes buničitou vatu bříškem palce přitlačíte. Tento nativní preparát pozorujete v normálním světlém poli. 1,8 mm 900 μm 450μm 100x 200x 400x Úkoly: Zakreslete buňky s pozorovanými detaily, uveďte zvětšení mikroskopu a odhad velikosti buňky.