Imunochemické metody na principu vazby antigenu a protilátky
ANTIGEN (Ag) specifická látka (struktura) vyvolávající imunitní reakci a schopná vazby na protilátku PROTILÁTKA (Ab antibody) molekula bílkoviny vážící specificky daný antigen EPITOP specifická část molekuly antigenu reagující a vážící se na protilátku HAPTEN většinou nízkomolekulární látka schopna vyvolat imunitní reakci tj. vazby na protilátku ale pouze po vazbě na větší molekulu (většinou protein) AGLUTINACE srážení antigenu specifickou protilátkou
Antigeny částice jiné buňky, baktérie, viry molekuly individuální bílkoviny, směsi bílkovin (např. krevního séra), části bílkovin peptidy kusy tkání, orgánů, membrán Ne všechny protilátky mohou reagovat se svým antigenem
Protilátky bílkoviny základní tvar molekuly - Y dva těžké a dva lehké řetězce disulfidické můstky variabilní část imunoglobulíny pět tříd: IgA, IgG, IgD, IgE, a IgM
Vazba antigenu a protilátky Nevazebné interakce - vodíkové můstky - iontové interakce - van der Waalsovy síly - dipol-dipol Interakce mezi antigenem a protilátkou závisí na ph, iontové síle a přítomnosti dalších látek např. detergentů, chaotropních činidel
Více protilátek reagujících s jednou částicí Precipitace
Vizualizace Precipitace protilátky s antigenem Značená primární protilátka (reaguje s antigenem) Značená sekundární protilátka (váže se na primární protilátku) Značený antigen Značení protilátek (antigemnů) enzymatická barevná reakce fluorescence chemilumiciscence radioizotopové značení
Aglutinace - precipitace
Přímé značení značená primární protilátka Nepřímé značení primární protilátka neznačena, značku nese sekundární protilátka - druhově specifická vůči primární protilátce Značená primární protilátka Značená sekundární protilátka
Příprava protilátek Imunizace, očkování odezva imunitního systému na přítomnost antigenu Hostitel - myši, králíci, kozy, prasata, koně Adjuvantní látky
Jedna nebo více dávek antigenu maximum IgM asi po týdnu, IgG asi po třech týdnech
Krevní sérum s protilátkou odběr krve z ucha malé množství, malé zvíře ze žíly větší zvířata (více antiséra) vykrvení zabití a získání veškeré krve sražení krve centrifugace získání krevního séra izolace protilátek a jejich přečištění (srážení, chromatografie
Imunodetekce detekce přítomnosti antigenu nebo protilátky Sérologické metody Imunoprecipitace ELISA Imunoblotování
Imunodetekce Volně v roztoku - sérologické metody Detekce protilátek - pomocí precipitace s příslušným antigenem (Salmonela, Listerie,...) Detekce mikroorganismů pomocí předem připravených protilátek (Salmonela, Streptokoky, Stafylokoky,...) Detekce antigenů vylučovaných mikroorganismy pomocí předem připravených protilátek (Streptokoky zápal plic, Haemophillus influenzae meningitida,...) Krevní skupiny průkaz krevních skupin reakcí protilátek s antigeny na červených krvinkách
Krevní skupiny Na povrchu erytrocytů - červených krvinek se vyskytují aglutinogeny speciální antigeny určující krevní skupiny Na jejich základě určujeme čtyři základní krevní skupiny: A, B, AB a 0 V krvi se také vyskytují protilátky proti cizím krevním skupinám (aglutinogenům)
Antigeny na povrchu erytrocytů - aglutinogeny A a B (aglutinogen aglutinace krve) Skupina A tvoří aglutinogen A Skupina B tvoří aglutinogen B Skupina AB tvoří oba aglutinogeny Skupina 0 netvoří ani jeden z aglutinogenů A a B (tvoří typ H, prekurzor A a B)
Protilátky tvořené v krvi aglutiny anti-a a anti-b Skupina A tvoří aglutinin anti-b Skupina B tvoří aglutinin anti-a Skupina AB netvoří žádný aglutinin Skupina 0 tvoří oba aglutininy anti-a i anti-b
Aglutinace zjišťování krevní skupiny
Imunodetekce Imunoprecipitace v gelech V agarózovém gelu Možnost použít více protilátek v jednom experimentu Možnost detekce více antigenů v jednom experimentu Kombinace s elektroforézou Kvantifikace
Reakce králičích protilátek proti lidskému séru s různými séry z: člověka (Ho), krávy (Bo), koně (Eq), kočky (Fe), kozy (Cap), ovce (Ov), mýši (Mu), psa (Ca), králíka (Ra), prasete (Su)
Kvantifikace antigenu Kalibrační křivka Protilátka je přítomna v agarózovém gelu, do jamek je přidáno známé množství antigenu.
Imunoelektroforéza Elektroforéza proteinů (antigenů) v agarózovém gelu s následnou aplikací protilátek do žlábku, imunodifuzí a precipitací.
Imunoelektroforéza Elektroforéza proteinů (antigenů) v agarózovém gelu s následnou aplikací protilátek do žlábku, imunodifuzí a precipitací.
Rocket imunoelectroforéza Kvantitativní metoda Agarózový gel s příslušnou protilátkou, ph přibližně 8.6 protilátky se nepohybují Elektroforéza proteinů (antigenů) o známé koncentraci a neznámých vzorků
Imunodetekce Metody ELISA
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Barevná reakce protilátky a antigenu
Využívá vlastnosti biologických makromolekul pevně se vázat na některé polymery (polystyrén...)
ELISA metody lze dělit podle řady kritérií Stanovení antigenu (Přímá ELISA) Stanovení specifických protilátek (Nepřímá ELISA) Normální vazba přímo na povrch jamky Sendvičová vazba přes zprostředkovatele
Pevná fáze s navázaným antigenem
Pevná fáze s navázanou protilátkou
Vizualizace značená primární protilátka (reaguje s antigenem) značená sekundární protilátka (váže se na primární protilátku) značený antigen enzymatická barevná reakce fluorescence chemilumiciscence radioizotopové značení Značení
Western blotting Imunologická detekce bílkovin separovaných pomocí ELFO
Přenos proteinů na membránu elektroforetický přenos pasivní přenos difuzí Výběr membrány: PVDF, nitrocelulosa, radioaktivní a neradioaktivní detekce, glykoproteiny, druhá detekce, screening exprese
Přenesení proteinů Vizualizace proteinů Blokace volných vazebných míst na membráně Navázání primární specifické protilátky Navázání značené protilátky specifické proti primární protilátce
Vizualizace sekundární protilátkou Barevná reakce Chemiluminiscence Fluorescence Radioaktivní detekce
Imunoafinitní preparace Využití specifické vazby antigenu a protilátky při jejich izolaci a přečištění Izolace přímo z roztoku precipitací Izolace z roztoku pomocí antigenu nebo protilátky navázané na specifické částice nebo molekuly (protein A, magnetická separace) Imunoafinitní chromatografie
Směsný vzorek před čištěním Aplikace specifických protilátek Oddělení protilátek s navázaným antigenem
Využití vazby protilátky (nebo antigenu) na částice se specifickým vazebným místem
Příklad využití částic při magnetické separaci Magnetická částice s navázanou protilátkou Reakce protilátek s antigenem Separace částic pomocí magnetu