Hodnocení účinku cytostatik a inhibitorů histondeacetylázy na nádorové buňky in vitro T.Groh 1,2, J.Hraběta 1, T.Eckschlager 1 1 Klinika dětské hematologie a onkologie, 2.LF UK a FN Motol a 2 Katedra biochemie PřF UK, Praha
Nádory jsou velkým problémem současných rozvinutých zemí a jejich incidence stálé přibývá a mortalita příliš neklesá- úspěch tedy je. Proto se hledají stále nové léčebné postupy. Hitem sezóny je cílená (biologická léčba). 900 800 Incidence a mortalita na ZN v ČR 700 600 500 400 300 200 0 1977 1980 1983 1986 1989 1992 1995 1998 2001 2004 2007 2010
Možnosti léčby nádorů Operační pouze u lokalizovaných optimum Chemoterapie pouze chemosensitivní, mnoho nežádoucích účinků Funguje omezeně Hormonální pouze hormonálně dependentní Radioterapie pouze u lokalizovaných a radiosenzitivních Cílená (biologická) inky. Pouzradiosenzitivní. Zatím příliš nefunguje. Moc drahá.
Cílená léčba Cytostatika zabíjejí rychle rostoucí buňky, cílená léčba je zaměřená proti specifické struktuře nádorové buňky (nemusí být vždy specifická jen pro nádorové b.). Detekce cíle této terapie je pilířem personalizované medicíny
HDACi mají protinádorové a antiangiogenní účinky HDACi potencují účinky cytostatikkterých? Jaký je nejvhodnější protokol- před, spolu, po? Pokusit se určit mechanismus. HDACi
HDACi
Valproát (VPA) konvenčně používaný lék antiepileptikum stabilizér nálady nízké dávky, dobře snášen
Valproát (VPA) v posledních letech studován pro inhibici histondeacetyláz indukuje diferenciaci a apoptózu nádorových buněk VPA http://www.rikenresearch.riken.jp/eng/frontline/5568 (22.3.2013)
Cisplatina (CDDP) konvenčně používané cytostatikum kovalentně se váže na DNA inhibice replikace a trankripce vede k neopravitelným změnám a následně k apotóze buněk
Etoposid (ETO) konvenční cytostatikum rostlinný alkaloid derivát podophylotoxinu Podophyllum peltatum inhibitor topoisomerasy II > dvouřetězcové zlomy ->apoptóza
Vinkristin (VCR) konvenční cytostatikum rostlinný alkaloid váže se na dimery tubulinů -> brání tvorbě mikrotubulů dělicího vřeténka kontrolní cytostatikum neovlivňuje DNA
Metody Buněčné linie odvozené od vysoce rizikového NBL Testované látky: 1/ inhibitory histondeacetylázy valproáta (VPA) a trichostatina (TSA); 2/ konvenční cytostatika cisplatina, etoposid, vinkristin Detekce apoptózy cytometricky: 1/ vazba anexinuv a vstup PI; 2/ vazba značeného inhibitoru casp-3 Dvouřetěžcové zlomy- detekce ϒH2AX- specifická protilátka Buněčný cyklus- PI+ RNAza po permeabilizaci Viabilita- MTT test (kolorimetrický průkaz redukce MTT na formazan)
Výsledky I nalezení vhodných koncentrací valproátu, etoposidu a cisplatiny zjištění IC 50 za klasických kultivačních podmínek (normoxie, 21% O 2 ) za hypoxický kultivačních podmínek (1% O 2 ) IC 50 valproát (mm) IC 50 cisplatina (µm) IC 50 etoposid (µm) Normoxie Hypoxie Normoxie Hypoxie Normoxie Hypoxie Exp. I 1,7 1,1 10,6 16,8 1,8 3,0 Exp. II 1,6 1,4 8,5 14,9 3,1 3,7 Exp. III 1,3 1,1 4,6 9,1 2,1 3,0 průměr 1,53 1,20 7,86 13,60 2,33 3,23 směr. odch. 0,17 0,14 2,50 3,28 0,56 0,33
viabilita % Výsledky II viabilita % testování 48h kokultivace 1mM VPA a 20µM CDDP či 8µM ETO potenciace účinku cytostatik 0,2+1=3 90 90 80 80 70 70 60 60 50 50 40 K VPA CDDP VPA+CDDP 40 K VPA ETO VPA+ETO
viabilita (%) viabilita (%) viabilita (%) Výsledky III testování 48h kokultivace 40nM TSA a 20µM CDDP či 8µM ETO TSA je pan-hdac inhibitor nedochází k potenciaci 75 50 25 0 Indukce apoptózy trichostatinem A (TSA) 0 25 50 200 koncentrace (nm) 90 90 80 80 70 70 60 60 50 50 40 K TSA CDDP TSA+CDDP 40 K TSA ETO TSA+ETO
viabilita (%) Výsledky IV aktivita caspasy-3 1mM VPA potencuje po 48h kokultivaci i téměř netoxickou koncentraci 4µM CDDP 90 80 70 25 60 20 50 15 40 K VPA CDDP VPA+CDDP 10 5 0 K VPA CDDP VPA+CDDP
IC 50 (µm) Výsledky V různé sekvence kultivací 1mM valproátu a různých koncentrací etoposidu (MTT test IC 50 ) 4 Potenciace Inhibice 3 2 1 0 ETO/VPA+ETO VPA/VPA+ETO ETO/VPA 0/VPA+ETO 0/ETO VPA/ETO
viabilita (%) Výsledky VI sledování viability buněk vystavených 24/48h kultivaci sekvencí 1mM VPA a 8µM ETO 80 60 40 20 0 K ETO/ETO 0/VPA ETO/0 ETO/VPA VPA/0 0/ETO VPA/ETO
viabilita (%) Výsledky VII sledování viability buněk vystavených 24/48h kultivaci sekvencí 1mM VPA a 20µM CDDP 80 60 40 20 0 K CDDP/CCDP 0/VPA CDDP/0 CDDP/VPA VPA/0 0/CDDP VPA/CDDP
Výsledky VIII Kombinace CDDP, 1mM VPA, N, H, 24/48, viabilita 80 60 normoxia hypoxia 40 20 0 K C/C 0/V C/0 C/V V/0 0/C V/C
Výsledky IX Dvouřetězcové zlomy DNA- hodnoceno průkazem ϒH2AX, UV jako kontrola, VP-16 inhibitor topoizomerázy II 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0,2 + 1 = 0,9 kont. UV VPA UV+VPA VP-16 VP-16+VPA VPA potencuje jak účinek VP-16 tak částečně i UV
Výsledky X otestování valromidu (VPM) analog VPA, účinkuje jako antiepileptikum neinhibije HDAC nalezení vhodné koncentrace VPM ~ 1mM VPA 4mM VPM (popsáno i v literatuře) 120 80 60 40 20 0 K 1mM 3 mm 5 mm 8 mm 12 mm
viabilita (%) Výsledky XI testování 48h kokultivace 4mM VPM a 20µM CDDP nedochází k ovlivění účinku k potenciaci nutná inhibice HDAC 90 lehce protektivní efekt! 80 70 60 50 40 K VPM CDDP VPM+CDDP
Diskuze Neuroblastomová buňky jsou sensitivní vůči všem testovaným látkám (ETO, CDDP, VCR,VPA, VPM) Jako nejefektivnější kombinace kultivací valproátu a etoposidu či cisplatiny se ukazuje kokultivace buněk VPA ovlivňuje děje v buňce po vazbě cytostatik (DNA reparační mechanismy, proapoptotické signály?) Je mechanismus potenciace závislý na aktivitě HDAC (nefunguje s valpromidem, ale TSA nepotencuje)? Mechanismus potenciace je spojený s DNA cíleným poškozením (nepotencuje VCR).
Závěr všechny použité látky jsou konvenčně používané v klinické praxi klinicky relevantní koncentrace látek v experimentech, VPA lze dávat dlouhodobě získané výsledky mohou pomoci vytvořit efektivnější protokoly léčby (nejen) neuroblastomů. VPA potencuje účinky některých cytostatik