Fixace molekulového dusíku mikroorganismy

Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie Fixace molekulového dusíku mikroorganismy (Bakalářská práce studijního programu Biologie oboru Obecná biologie směr Mikrobiologie) Jindřiška Hammerová Brno 2006

Poděkování: Touto cestou bych ráda poděkovala vedoucímu bakalářské práce doc. RNDr. Miroslavu Němcovi, CSc. za poskytnutí materiálů, četné konzultace a cenné rady při psaní této literární rešerše. 2

OBSAH: Úvod... 4 Cíl práce... 5 1. Koloběh dusíku v biosféře... 6 1.1 Výskyt dusíku... 6 1.2 Koloběh dusíku... 6 2. Metabolismus dusíku u prokaryot... 9 2.1 Katabolické dráhy... 9 2.1.1 Metabolismus dusíku u chemoorganotrofních bakterií... 9 2.1.1.1 Zdroje dusíku... 9 2.1.1.2 Zdroje energie...10 2.1.1.2.1 Denitrifikace...10 2.1.1.2.2 Kvašení aminokyselin...11 2.1.2 Metabolismus dusíku u chemolitotrofních bakterií...11 2.1.2.1 Proces nitrifikace...12 2.2 Anabolické dráhy...12 2.2.1 Fixace molekulového dusíku...12 2.2.2 Biosyntéza aminokyselin...13 3. Chemismus fixace molekulového dusíku... 14 3.1 Struktura nitrogenázy...14 3.1.1 FeMo-protein...15 3.1.2 Fe-protein...15 3.2 Mechanismus funkce nitrogenázy...15 3.3 Alternativní nitrogenázy...16 3.4 Regulace funkce nitrogenázy...17 4. Nitrogenázové geny a jejich exprese... 19 4.1 Nitrogenázové geny...19 4.1.1 Nif geny u Klebsiella pneumoniae...19 4.1.2 Nif geny u N 2 -fixujících sinic...20 4.1.3 Nif geny u rhizóbií...20 4.2 Regulace exprese nif genů...21 3

5. Mikroorganismy fixující molekulový dusík... 23 5.1 Volně žijící organismy fixující molekulární dusík...23 5.2 Symbioticky žijící organismy fixující molekulární dusík...24 5.2.1 Asociativní symbióza...25 5.2.2 Nodulující symbióza...25 5.2.3 Nenodulující symbióza...26 6. Nesymbiotická fixace molekulového dusíku... 27 6.1 Azotobacter...27 6.2 Clostridium...27 6.3 Fixace N 2 u sinic...28 6.3.1 Prostorová separace...28 6.3.2 Časové oddělení fixace N 2 a fotosyntézy...29 7. Symbiotická fixace molekulového dusíku... 30 7.1 Nodulující (hlízkovité) symbiózy...30 7.2 Nenodulující symbióza - lišejníky (Lichenes)...31 7.2.1 Mykobiont...31 7.2.2 Fotobiont...32 8. Fixace molekulového dusíku u leguminózních a neleguminózních rostlin... 33 8.1 Vzájemná výměna signálů mezi mikroorganismem a leguminózní rostlinou...33 8.1.1 Reakce rostliny na bakteriální Nod faktory...35 8.1.1.1 Deformace a stáčení kořenového vlásku...36 8.1.1.2 Tvorba infekčního vlákna...36 8.1.1.3 Vznik kořenové hlízky...37 8.1.1.4 Vytvoření bakteroidů...38 8.2 Fixace N 2 u neleguminózních rostlin...38 8.2.1 Infekce neleguminózní rostliny baktériemi...39 8.2.2 Symbiotický vztah: neleguminózní rostlina Rhizobium...40 9. Arbuskulární mykorhizální symbióza a fixace molekulového dusíku... 41 9.1 Germinace spóry; vzájemná výměna signálů hyfou a rostlinou...41 9.2 Vznik appresoria, průnik hyfy do kořene, vznik arbuskule...42 4

9.3 Výměna živin mezi houbou a rostlinou...42 9.4 Arbuskulární mykorhizální symbióza vs. fixace molekulového dusíku; ektomykorhiza... 43 10. Význam fixace molekulového dusíku... 44 10. 1 Význam fixace dusíku v zemědělských systémech...44 10.1.1 Azolla a produkce rýže...45 10.1.2 Cukrová třtina ~ Acetobacter diazotrophicus...46 10.1.3 Sója luštinatá (Glycine max)...46 10.2 Lišejníky a jejich význam v prostředí...47 10.3 Inokulace hospodářsky významných leguminóz bakteriálními kmeny rodu Rhizobium...47 Závěr... 49 Použitá literatura... 50 5

Úvod Biologická fixace molekulového dusíku byla popsána u leguminóz v 80. letech 19. století německým vědcem G. Hellriegelem a jeho spolupracovníkem H. Wilfarthem. Avšak zemědělci již dávno před objevením dusíku jako chemického prvku věděli o schopnosti bobovitých rostlin obohacovat půdu živinami a tento jev v praxi značně využívali. Brzy po objevení mikroorganismů žijících v symbiotickém vztahu s leguminózami byli objeveni i volně žijící fixátoři N 2 anaerobní baktérie Clostridium pasteurianum (S. Vinogradskij), aerobní baktérie Azotobacter sp. (M. V. Beijerinck). Fixace N 2 u některých sinic byla potvrzena později B. Frankem. Bylo také prokázáno, že kořenové hlízky olší mají stejnou funkci jako hlízky bobovitých rostlin. Proces biologické fixace dusíku (ať již jde o fixaci symbiotickou či volnou) je pro svoji důležitost v koloběhu dusíku srovnáván s významem fotosyntézy při koloběhu uhlíku. Využití biologické fixace dusíku umožňuje jeho efektivní hospodaření bez používání minerálních dusíkatých hnojiv, na jejichž výrobu je potřeba velké množství energie z fosilních paliv. Fixace N 2 jednak obohacuje dusíkem nadzemní orgány hostitelských rostlin, jednak se vznikající amonné ionty rozptylují prostou difuzí v půdě. Přítomnost dusíku se také projevuje vysokou koncentrací proteinů a jiných dusíkatých látek v bobovitých rostlinách, což má velký význam pro býložravce a následně pro řadu organismů nacházejících se v potravních řetězcích výše (včetně člověka). 6

Cíl práce Cílem bakalářské práce bylo zpracování literárních údajů zaměřených na problematiku fixace molekulového dusíku mikroorganismy. Pozornost byla soustředěna zejména na mechanismus tohoto procesu. Snahou rovněž bylo zahrnout biologickou fixaci do celkového koloběhu dusíku v biosféře a vyzdvihnout význam začlenění molekulového dusílu do organické hmoty. 7

1. Koloběh dusíku v biosféře Růst všech organismů závisí na dostupnosti minerálních prvků (živin). Podle množství potřebného pro organismus je rozlišujeme na makrobiogenní, mikrobiogenní a stopové. Mezi nejdůležitější makrobiogenní prvky mimo uhlík, vodík, kyslík a fosfor patří právě dusík, který je většinou organismů vyžadován ve velkém množství. Dusík je v organismu součástí různých organických látek, např. bílkovin a nukleových kyselin, jež jsou esenciální součástí organismů. 1.1 Výskyt dusíku Dusík se v přírodě vyskytuje volný i vázaný. I přes malou reaktivitu je přítomen v celé řadě přírodních sloučenin. Sloučeniny dusíku mohou být anorganického nebo organického původu. Dusík je v zemském ovzduší přítomen v molekulární formě N 2 a chová se jako chemicky netečný plyn. V troposféře zaujímá 78,08 % objemu. V horninách a v hydrosféře je dusíku na rozdíl od ovzduší poměrně málo, v litosféře jen 0,002 %. Dusík je důležitou komponentou pro tvorbu imino- a amikoskupin, které se vyskytují v aminokyselinách, nukleotidech a dalších organických sloučeninách. Z prostředí ho organismy přijímají nejčastěji ve formě dusičnanových NO - 3, dusitanových NO - 2 nebo amonných NH + 4 iontů. 1.2 Koloběh dusíku Koloběh dusíku je velmi složitým procesem. Hlavním zdrojem dusíku je zemská atmosféra, odkud se dostává dusík také do vody i půdy. Volný vzdušný dusík mohou vázat z organismů jen některé mikroorganismy, nazývané vazači (fixátoři) dusíku, mezi které patří některé skupiny půdních bakterií, sinic a aktinomycét, bakterie symbioticky žijící v hlízách na kořenech bobovitých rostlin a aktinomycety u olše aj. Rostliny přijímají dusík převážně jako nitrátový (NO - 3 ) nebo amonný ion (NH + 4 ) a využívají jej ke svému metabolizmu. S potravou se dostává do těl živočichů, kteří jej částečně využívají při tvorbě vlastních bílkovin a částečně vylučují močí. Při rozkladu organické hmoty uvolňují destruenti dusík v anorganické formě (NO - 3 a NH + 4 ), který mohou rostliny opět přijímat. Plynný dusík, který se může vytvářet v průběhu rozkladu se vrací zpět do ovzduší spolu s oxidy dusíku. Část dusíku se do atmosféry dostává díky sopečné činnosti. Tento koloběh je názorně rozkreslen na obr. 1. 8

Obr. 1. Koloběh dusíku. Sloučeniny dusíku v biosféře neovlivněné antropogenní činností jsou převážně biogenního původu, vznikají při rozkladu organických dusíkatých látek rostlinného i živočišného charakteru. Anorganickým zdrojem dusíku jsou atmosféra, sopečná činnost (oxidy dusíku, amoniak), splaškové vody ze zemědělsky obdělávané půdy hnojené minerálními dusíkatými hnojivy, atmosférické vody (zvláště v období bouřkové činnosti, oxidy dusíku vznikají také jako vedlejší produkty při spalování paliv a jsou obsaženy ve výfukových plynech motorových vozidel) a některé průmyslové odpadní vody, např. z tepelného zpracovávání uhlí. Dusíkaté sloučeniny tedy zastávají v chemii vod velmi významné místo. Účastní se všech biochemických pochodů, které v nich probíhají a při jejich biologickém čištění. Ve vodách jsou jednak přítomné biologické formy dusíku, jednak se do nich sloučeniny dusíku dostávají se srážkovými vodami. Hlavní formy dusíku vyskytující se ve vodě jsou shrnuty v tabulce 1. 9

Tab. 1. Formy dusíku nacházející se ve vodách. Forma dusíku molekulární N 2 anorganicky vázaný amoniakální NH 3, NH 4 + organicky vázaný - dusitanový NO 2 - dusičnanový NO 3 dusík umělého kyanidy, původu kyanatany siláže, močůvka Množství jednotlivých forem dusíku není závislé jen na jejich zdroji, ale i na metabolické aktivitě organismů procesech, které ve vodném prostředí neustále probíhají. Mezi nejvýznamnější procesy patří fixace molekulárního dusíku, amonifikace (proces biologického rozkladu organický dusík se uvolňuje v amoniakální formě), nitrifikace (proces, který probíhá v přírodě ve velkém měřítku a dochází při něm k oxidaci amonných iontů na dusitany a dusičnany) a denitrifikace (proces, kterým se z dusičnanů a dusitanů stává opět plynný dusík nebo N 2 O). Také v půdě podléhá dusík různým přeměnám, jsou to především procesy biologické fixace, nitrifikace a denitrifikace. Jednotlivé procesy přeměn dusíku v půdách se značně podílejí a spolurozhodují o jeho distribuci v půdě, a tím i jeho využití rostlinami a v návaznosti na ně i dalšími organismy. 10

2. Metabolismus dusíku u prokaryot Metabolismus je velmi komplikovaný soubor enzymatických dějů probíhající v buňkách. Je to dynamický děj, jehož funkcí je poskytovat jednak stavební kameny pro růst a udržování buňky, jednak energii. Podle toho, jakých zdrojů uhlíku využívá organismus pro tvorbu organických látek a jakým způsobem je zpracovává, lze organismy rozdělit na organismy autotrofní jako jedinný zdroj uhlíku využívají CO 2 a organizmy heterotrofní hlavním zdrojem uhlíku je organická látka. Ve vztahu ke zdroji energie se organismy dělí na organismy fototrofní zdrojem energie je sluneční světlo a organismy chemotrofní získávají energii přeměnou chemických látek. Podle významu v buňce lze rozlišovat dráhy katabolické, které vedou k rozkladu látek složitějších na jednodušší a k zisku energie a dráhy anabolické, vedoucí k syntéze složitějších látek s využitím energie získané v katabolických drahách. Energetické propojení mezi oběma typy drah zprostředkuje adenozinfostát - anabolické děje získávají energii štěpením ATP na ADP nebo AMP; katabolické dráhy potom dodávají energii pro resyntézu ATP. 2.1 Katabolické dráhy V katabolických drahách jsou nejdůležitější reakce oxido-redukční. Přenos redukčních ekvivalentů se děje v živých systémech především prostřednictvím NAD + nebo NADP +. 1. Oxidace substrátu XH 2 : XH 2 + NAD + = X + NADH 2 2. Redukce substrátu Y: Y + NADH 2 = YH 2 + NAD + 2.1.1 Metabolismus dusíku u chemoorganotrofních bakterií Katabolické dráhy slouží k tvorbě energie přeměnou složitějších organických látek na látky jednodušší. Tedy na látky s nižší energetickou hladinou. Tyto procesy probíhají buď v nepřítomnosti kyslíku, kdy dochází k anaerobní dehydrogenaci (kvašení neboli fermentace) nebo v přítomnosti kyslíku, kdy je ATP vytvářen oxidativní fosforylací. 2.1.1.1 Zdroje dusíku Nejčastějším zdrojem dusíku u chemoorganotrofních bakteríí jsou aminokyseliny a proteiny (mimo amonné soli, amoniak, dusičnany a močovinu). Pro mnohé z nich mohou být 11

zároveň zdrojem uhlíku a energie. Proteiny mohou využívat jen ty bakterie, které produkují proteolytické enzymy pro štěpení těchto látek na aminokyseliny. Podle účinku na peptidický řetězec se dělí na exopeptidázy (atakující koncové články) a endopeptidázy (působí podél peptidického řetězce). Účinkem proteolytických enzymů je molekula bílkoviny štěpena až na volné aminokyseliny, které mohou být využívány mikroorganismy přímo jako základní stavební kameny pro anabolické pochody nebo jsou dále mikroorganimy disimilovány. 2.1.1.2 Zdroje energie Chemoorganotrofní bakterie získávají energii oxidací organického substrátu, který je primárním donorem vodíku a elektronů a jejich akceptorem je organická, anorganická látka nebo molekulární kyslík. APT se v tomto procesu tvoří oxidativní fosforylací a organický substrát slouží též jako zdroj uhlíku. Podle typu akceptoru elektronů se u chemoorganotrofních bakterií rozlišují tyto způsoby respirace: 1. Anaerobní respirace (denitrifikace, desulfurikace) - akceptorem elektronů není přímo molekulární kyslík, ale molekula obsahující kyslík; donorem elektronů je organická látka. 2. Kvašení (fermentace). 3. Aerobní respirace donorem elektronů je organická látka, jejich akceptorem molekulární kyslík. 2.1.1.2.1 Denitrifikace Je procesem, při kterém akceptorem elektronů je dusičnan, který se elektrony redukuje na dusitan popřípadě až na N 2, probíhá podle schématu: NO 3 - - NO 2 NO N 2 O N 2. Elektrotransportní systém je lokalizován na cytoplazmatické membráně a je společný s aerobním elektrontrasportním systémem s výjimkou cytochromu b 556, který je specifický pro nitrátreduktázový systém. Jde tedy o alternativní způsob přenosu elektronů v anaerobních podmínkách, Obr. 2 (Němec a Horáková, 2002). Některé bakterie mohou dusičnany redukovat na amoniak, který pak zabudují do vlastních bílkovin. Proces nazýváme asimilační redukcí dusičnanů, též označovanou jako nepravá dentrifikace, neboť nedochází ke ztrátám dusíku, ale pouze k jeho přeměně (Němec, 1986). Uskutečňují ho bakteri r. Bacillus, Alcaligenes, Pseudomonas a další. Bakteriální redukci, při níž dochází ke vzniku těkavých produktů molekulového dusíku, označujeme pravou denitrifikací (Němec, 1986). Způsobuje 12

ztráty v dusíkaté bilanci, neboť dusík v podobě plynu uniká do ovzduší. V přírodě se s denitrifikačními bakteriemi setkáváme v půdě, chlévské mrvě a ve znečistěných vodách. Obr. 2. Alternativní způsob přenosu elektronů v procesu denitrifikace. Převzato Němec a Horáková (2002). 2.1.1.2.2 Kvašení aminokyselin Cílem kvašení aminokyselin není většinou získání energie, ale jejich transformace. Při těchto reakcích nevzniká žádná nebo jedna molekula ATP. Výjimečně mohou vzniknout dvě molekuly ATP. Rozklad aminokyselin je již uveden v podkapitole 2.1.1.1, v této podkapitole je něj pohlíženo jako na proces, kterým může mikroorganismus získat energii. Kvašení aminokyselin může probíhat dvojím způsobem (Němec a Horáková, 2002): 1) Kvašení jednotlivých aminokyselin dochází buď k reduktivní deaminaci a vzniku NH 3 (Pseudomonas aeruginosa) nebo k transaminaci (Clostridium butyricum). 2) Kvašení dvojice aminokyselin tyto reakce se označují jako reakce Sticklandovy, jde o spřažení oxidace a redukce dvou aminokyselin, z nichž jedna je donorem a druhá akceptorem vodíku. 2.1.2 Metabolismus dusíku u chemolitotrofních bakterií Chemolitotrofní bakterie stejně jako fotolitotrofní získávají uhlík z CO 2, který je fixován přes Calvinův cyklus. Energii získávají oxidací jednoduchých anorganických látek a převádějí ji do molekul ATP. Syntéza ATP je tedy spřažena s oxidací donoru elektronů, což je anorganická látka. Podle donoru elektronů se pak chemoautotrofní bakterie dělí na vodíkové energii získávají oxidací vodíku, který se také účastní redukce CO 2 ; sirné bakterie jako zdroj energie slouží sirovodík, thiosíran, elementární síra atd., konečným produktem je většinou síran; bakterie oxidující železo oxidují Fe 2+ na Fe 3+ (tato oxidace probíhá v kyselém 13

prostředí) a nitrifikační bakterie oxidace amoniaku (nitritační bakterie) nebo dusitanů (nitratační bakterie). 2.1.2.1 Proces nitrifikace Nitrifikace má v přírodě zásadní význam, protože vede ke vzniku dusičnanů, tj. rozhodující formy dusíku pro jeho příjem rostlinami. Probíhá ve dvou krocích, prvním krokem je oxidace amoniaku na dusitany nitritačními bakteriemi dle rovnice: - 2 NH 3 + 3O 2 2 NO 2 + 2 H 2 O + 2H +, druhým krokem je následná oxidace dusitanů na dusičnany nitratačními bakteriemi dle rovnice: - 2 NO 2 + O 2 2 NO - 3. Oxidace amoniaku na kyselinu dusitou je uskutečňována zástupci rodů Nitrosomonas (vyskytují se především na dobře obdělávaných půdách), Nitrosospira (vyskytují se hlavně v nekultivovaných půdách) a Nitrosococcus (nacházející se převážně v tropickém pásmu). Bakterie rodu Nitrobacter jsou schopny provádět obě části procesu. Nitrifikační bakterie jsou striktně autotrofní (Němec, 1986). Nitrifikace je velice citlivá na teplotu (tepelné optimum je 30 C), dostatečný přísun kyslíku, k ph půdy a obsahu organické hmoty v prostředí, ale také k množství těžkých kovů. 2.2 Anabolické dráhy V katabolických procesech nezískává bakteriální buňka jenom energii a redukční ekvivalenty, ale také meziprodukty, které mohou sloužit jako stavební kameny v drahách anabolických. Biosyntetické dráhy mohou být v podstatě shodné s dráhami katabolickými, ale v opačném pořadí. Některé kroky jsou však specifické. Při biosyntéze je energie spotřebována, jsou to tedy ve většině případů reakce endergonické. 2.2.1 Fixace molekulového dusíku Tento proces je velice energeticky náročný. Je specifický pro úzký okruh organismů, jejichž specifita je dána přítomností enzymového komplexu nitrogenázy. Fixace může probíhat jako symbiotická (Rhizobium, Frankia, Anabaena, Nostoc), nebo v rámci asociativní symbiózy (Azotobacter, Klebsiella, Bacillus, Azospirilum) či nesymbiotická (Azotobacter, Clostridium). Reakce probíhá podle sumární rovnice: N 2 + 8e - + 8H + + 16 ATP 2 NH 3 + H 2 + 16 ADP + 16 P i. 14

2.2.2 Biosyntéza aminokyselin Ve většině případů je bakteriální buňka schopna syntetizovat aminokyseliny de novo. Pro tvorbu uhlíkatých skeletů slouží meziprodukty vznikající v katabolických drahách. Do těchto uhlíkatých skletů se aminoskupiny zavádí přímou aminací nebo transaminací. Přechod anorganické formy dusíku do organické se však vždy děje přes amoniak (Němec a Horáková, 2002). 15

3. Chemismus fixace molekulového dusíku Volný dusík se v atmosféře vyskytuje ve formě dvouatomových molekul N 2 (78 obj. %). Tyto atomy jsou vázány trojnou vazbou, která svojí pevností zapříčiňuje nízkou reaktivitu dusíku, a proto její redukce při průmyslovém využití vyžaduje velmi vysokou teplotu (500 C), tlak (300 atm.) a železo jako katalyzátor - tzv. Haber-Boschova syntéza amoniaku. V přírodě jsou redukce molekulového dusíku schopné pouze omezené skupiny organismů (jedná se výhradně o prokaryota), u kterých se v průběhu evoluce vyvinul mechanismus, jímž je molekula N 2 asimilována do organické hmoty. Klíčem k tomuto mechanismu je enzym nitrogénáza a tedy shopnost organizmů pro její syntézu. Enzym byl objeven v roce 1960 v buněčném extraktu Clostridium pasteurianum. Tento enzym i samotný proces fixace je velice citlivý na kyslík. 3.1 Struktura nitrogenázy Nitrogenáza je enzymový komplex tvořený dvěma metaloproteiny (nehemovými proteiny). Větší z nich je tzv. FeMo-protein, menší pak Fe-protein (Obr. 3). Klíčové postavení má molekula molybdenu. U některých organismů např. u bakterie rodu Azotobacter chroococcum může být molybden nahrazen vanadem. Jestliže nitrogenáza obsahuje jiný atom než Mo, nazývá se alternativní nitrogenázou. Obr. 3. Struktura enzymu nitrogenázy. 16

3.1.1 FeMo - protein FeMo-protein je tetramer α 2 β 2 o molekulové hmotnosti 220 240 000, který je složen ze dvou alfa (2 x 50 000) a dvou beta (2 x 60 000) podjednotek. Tento protein obsahuje dva atomy Mo, asi třicet atomů Fe a několik S 2- iontů. Atomy železa jsou lokalizovány ve čtyřech Fe 4 S 4 klastrech, tzv. p-klastrech a ve dvou železo-molybdenových kofaktorech (FeMoco). Předpokládá se, že FeMo-protein obsahuje dvě nezávislé funkční jednotky, z nichž každá je tvořena železo-molybdenovými kofaktory a polovinou p-klastrů (které jsou buď ve formě velkého klastru, nebo dvou velmi těsně spojených Fe 4 S 4 klastrů) a které jsou od sebe vzdáleny asi 7 nm, takže se nalézají blízko povrchu proteinu (Bishop a Joerger, 1990). 3.1.2 Fe - protein Je tvořen dvěma stejnými podjednotkami, mezi nimiž se nachází jedno centrum Fe 4 S 4. Molekulová hmotnost tohoto proteinu je 57 72 000. Ionty železa jsou uspořádny v klastru tvaru krychle, který je navázán na polypeptidy právě přes atomy železa. Volné Fe-proteiny mají redoxní potenciál E m podle původu 240 až 393 mv. V přítomnosti MgADP nebo MgATP se redox potenciál dále snižuje. Stejně tak jako FeMo-protein tak i Fe-protein je extrémně citlivý na kyslík. 3.2 Mechanismus funkce nitrogenázy Pro nitrogenázovou redukci je zapotřebí nízký redoxní potenciál (asi 450 mv), který se dosahuje v Fe-proteinu po jeho spojení s MgATP. Během redukce molekuly N 2 jsou přenášeny elektrony postupně z Fe-proteinu na MoFe-protein. Během tohoto procesu se spotřebují dvě molekuly ATP. Vlastní redukce probíhá v těchto krocích (Obr. 4): 1. Redukce Fe-proteinu redukovaným ferredoxinem nebo flavodoxinem. 2. Aktivace Fe-proteinu pomocí ATP. 3. Vazba redukovatelného substrátu na nitrogenázu (přesněji na FeMo-protein). 4. Asociace aktivovaného Fe-proteinu a FeMo-proteinu. 5. Přenos elektronů uvnitř tohoto komplexu. 6. Přenos elektronu na substrát. 7. Rozpad komplexu: uvolnění redukovaného produktu, ADP a P i (Škára a Ferenčík, 1983). 17

Obr. 4. Schéma reakce nitrogenázy. Upraveno podle Gloser (1998). Pomalá disociace proteinů je příčinou toho, že nitrogenáza je pomalý enzym - jeden úplný redukční cyklus trvá déle než 1 s (Leigh, 1988). Zdrojem ATP jsou u heterotrofních bakterií organické látky, u fotoautotrofních bakterií a sinic je ATP tvořeno v průběhu cyklické nebo necyklické fosforylace. Zdrojem elektronů je ferredoxin nebo flavodoxin, pro jejich redukci se elektrony získávají rozkladem organických látek - baktérie nebo vody sinice (Šimek, 1993). ATP se účastní reakce jako komplex s Mg 2+. Na přenos 8 elektronů, které jsou potřeba k redukci jedné molekuly N 2 a 1 molekuly H +, se spotřebuje 16 molekul MgATP (960 kj mol -1 ), podle rovnice: N 2 + 8H + + 16MgATP 2NH 3 + H 2 + 16MgADP + 16Pi U některých bakterií (např. rhizobií) a sinic (Bothe a kol., 1991) byl zjištěn enzym hydrogenáza, který který oxiduje část nebo všechen vznikající H 2. To vede k efektivnějšímu metabolismu a vyššímu výtěžku dusíkatých sloučenin. Tyto kmeny se označují jako tzv. Hup + kmeny (hydrogen uptake positive); (Šimek, 1993). 3.3 Alternativní nitrogenázy U většiny organismů schopných fixovat vzdušný dusík nitrogenáza ve svém kofaktoru obsahuje molybden (FeMoco). Existují však i nitrogenázy, které mají ve svém aktivním centru místo molybdenu vanad (tzv. nitrogenáza 2 nebo také V-nitrogenáza). Mimo tyto dva typy nitrogenázy je znám také enzym, který se tvoří za Mo- a V-deficitních podmínek. V aktivním centru má pravděpodobně Fe (Bishop a Joerger, 1990) a nazývá se nejčastěji nitrogenáza 3. 18

Alternativní nitrogenázy byly doposud zjištěny pouze u několika rodů bakterií (např. rod Azotobacter) a u několika málo rodů sinic. Většinou jsou to organismy žijící buď za nízkých teplot nebo v prostředí extrémně Mo-deficitním, např. v kyselých půdách s vysokým obsahem oxidů železa (Bishop a Joeger, 1990). V podstatě se nitrogenázy vzájemně odlišují strukturně a částečně i funkčně. Strukturní rozdíly spočívají: 1. V různém obsahu prvků různé zastoupení S 2-, Fe, V a Mo. 2. V přítomnosti další podjednotky proteinu δ (enzym má potom toto podjednotkové složení: α 2 β 2 δ 2 ); subjednotka δ je poměrně malá, její molekulová hmotnost je 13 15 000 a její sekvence aminokyselin se nepodobá žádnému proteinu (Leigh, 1988). 3. V rozdílné sekvenci aminokyselin produktů strukturních genů nitrogenáz. Funkční rozdíly spočívají: 1. V různě účinné redukci N 2 ; zatímco v případě Mo-nitrogenázy je za optimálních podmínek distribuce elektronů mezi redukcí N 2 a tvorbou H 2 v poměru 3:1, v případě V-nitrogenázy je tento poměr 1:1 (Leigh, 1988). U nitrogenázy 3 je rozdíl v efektivitě ještě zřetelnější. Celkově jsou tedy V-nitrogenáza a Fe-nitrogenáza méně efektivní než Mo-nitrogenáza. 2. V rozdílné redukci acetylénu a tvorbě produktu (tzv. acetylenová analýza, užívá se pro testování aktivity jednotlivých nitrogenáz). 3. V rozdílné schopnosti redukovat další substráty; nitrogenázy katalyzují redukci celé řady substrátů, mezi než patří: hydrazin (redukce na amoniak), azid (na amoniak nebo N 2 ), alkiny (na alkeny např. acetylén na etylén), alén (na propen), oxid dusný (na N 2 ), cyklopropen (na cyklopropan nebo propen), nitrily a izonitrily aj. (Leigh, 1988). 3.4 Regulace funkce nitrogenázy Aktivita nitrogenázy závisí na řadě faktorů. Mezi nejdůležitější z nich patří kyslík. Kyslíkem je nitrogenáza irreverzibilně inhibována, přičemž extrémně citlivé jsou oba proteiny, tvořící tento enzym, tedy jak Fe-protein tak i FeMo-protein. Např. k regulaci koncentrace kyslíku u organismu, který fixuje dusík jako symbiont, slouží leghemoglobin, u sinic je to tvorba heterocytů. Dalším aspektem je přítomnost dusíku v jiných formách než N 2 v prostředí, v němž organismus žije. Proces fixace dusíku je velice energeticky náročný, takže organismus dává 19

raději přednost anorganickým případně organickým formám dusíku. Jako inhibitor se uplatňuje i ADP. U bakterií Rhodospirillum rubrum a Azospirillum sp. je popsán systém represe a dereprese nitrogenázové aktivity přítomností NH + 4. Amonné ionty kontrolují přímo tvorbu nitrogenázy na úrovni transkripce a nepřímo represí aktivity glutamin-syntetázy (Škára a Ferenčík, 1983). Dostupnost iontů molybdenu, železa a hořčíku je odpovědna za efektivitu fixace. Nepřítomnost molybdenu může být vyvážena tvorbou V-nitrogenázy nebo Fe-nitrogenázy. Nepřítomnost hořčíku snižuje účinnost fixace, protože ATP vstupuje do reakce jako komplex s Mg 2+. 20

4. Nitrogenázové geny a jejich exprese Genetika fixace dusíku je dobře prostudována jen u několika málo bakterií, zejména u bakterie Klebsiella pneumoniae. Funkce mnoha produktů nitrogenázových genů je dosud objasněna jen částečně, nebo není známa vůbec. 4.1 Nitrogenázové geny Geny, které nesou informaci o nitrogenáze se nazývají nif geny (nitrogen-fixing genes). Některé geny jsou společné pro organismy mající různé typy nitrogenáz (nitrogenáza 1, 2, 3), např. nifb a nifm. Naproti tomu určité struktury V- a Fe-nitrogenáz jsou kódované specifickými geny vnf (pro V-nitrogenázu; 2) a anf (pro Fe-nitrogenázu; 3). 4.1.1 Nif geny u Klebsiella pneumoniae U této bakterie je 20 nif genů (Obr. 5) a nacházejí se na 22-24 kb úseku DNA, a to v osmi operonech (transkripčních jednotkách): nifj, nifhdkty, nifenx, nifusvwz, nifm, niff, nifla a nifbq. Ve většině případů jsou tytéž geny přítomny i u jiných fixátorů molekulárního dusíku. Tedy jak u volně žijících, tak i u symbiotických fixátorů N 2. Geny nifb, Q, E, N, V, K, D a T kódují strukturu většího proteinu - FeMo-proteinu nitrogenázy včetně FeMoco, geny nifh a nifm pak strukturu menšího z nich - Fe-proteinu. Transport elektronů k nitrogenáze regulují produkty genů niff a nifj. Funkce ostatních genů je prozatím neznámá (Zehr a Turner, 2001). Obr. 5. Organizace nif genů u bakterie Klebsiella pneumoniae. Převzato od Šimek (1993). 21

4.1.2 Nif geny u N 2 -fixujících sinic Ve srovnání s bakteriemi jsou v organizaci nif genů u sinic jisté rozdíly. Existují také značné rozdíly v organizaci genů u jednobuněčných sinic (např. jejich nifhdk operon se podobá bakteriálnímu) a u vláknitých sinic (kde nifk je ve vegetativní buňce oddělen od nifdh genů) a také u vegetativních buněk a heterocytů heterocytických sinic (Šimek, 1993). Během změny vegetativní buňky v heterocyt dochází ke změnám v jejím genomu (Golden a kol., 1987) tak, že v sousedství nifd a nifs genů jsou vypuštěny úseky 11 kb a 55 kb, (Obr. 6). Pro vyvolání diferenciace vegetativní buňky v heterocytů jsou také nezbytné specifické geny, které nemají ve vegetativních buňkách žádnou funkci (cca 60 genů). Příkladem mohou být geny heta a hetb u sinice Anabaena 7210 ( Kang a kol., 2005). U sinic byl již také zjištěn regulační gen ntrc. Obr. 6. Organizace genů u sinice Anabaena sp. Převzato od Šimek (1993). 4.1.3 Nif geny u rhizobií Průběh vytváření fixačního systému u rhizobií a leguminóz a jeho funkce se účastní tzv. sym geny, které se dělí na nod geny (nesou informaci o látkách, které jsou potřebné při tvorbě hlízek), nif geny (nesoucí informaci o tvorbě enzymu nitrogenázy) a fix geny (některé geny, které jsou nezbytné pro funkčnost fixačního systému). Plazmidové Nod geny ke své expresi potřebují rostlinné induktory, jimiž mohou být flavonoidy nebo betainy. U volně žijících 22

bakterií se exprimuje pouze gen nodd, který je regulační a exprimuje se stále. Geny noda, nodb a nodc jsou geny obecné, vlastní všem symbiotickým druhům kmene Rhizobium. Kódují enzymy zajišťující syntézu základní glukosaminové kostry Nod faktorů. Zmíněné nif geny rhizobií jsou v podstatě analogy nif genů volně žijících bakterií a sinic (Catoira a kol., 2000). U některých kmenů rhizobií jsou specifické geny - tzv. hup geny, kódující hydrogenázu (enzym, jež je schopen redukce produkovaného H 2 ). 4.2 Regulace exprese nif genů Nif geny jsou podřízené dvěma regulačním úrovním: globální souvisí s regulačním systémem metabolismu dusíku v buňce, a specifické - pro fixaci N 2. Kontrola a regulace fixace dusíku je důležitá hned z několika důvodu. Patří mezi ně především energetická náročnost tohoto procesu (tato energie ve formě ATP by mohla být využita pro jakýkoli jiný děj v buňce), dále je to velmi malá rychlost nitrogenázy a tedy potřeba nasyntetizovat jí co nejvíce a konečně i aktivní ochrana nitrogenázy před kyslíkem. V podstatě jsou známy dva regulační mechanismy syntézy nitrogenázy: regulace dusíkem a regulace kyslíkem. Metabolismus dusíku v buňce regulují tři ntr geny. Systém regulace zajišťuje, že organizmus nesyntetizuje nitrogenázu, jestliže je k dispozici buď dostatek metabolizovaného dusíku NH 3, nebo příliš mnoho kyslíku v prostředí (Postgate a kol., 1986). Ntr geny regulují celý nif regulon prostřednictvím přímé regulace transkripce nifla operónu, jehož produkt reguluje expresi ostatních nif genů, viz Obr. 7. Regulace kyslíkem funguje přímo vlivem O 2 na nifl gen, jehož exprese zastaví syntézu nitrogenázy (Postgate a kol., 1986). Genetický aparát a jeho regulace u symbiotického fixačního systému rhizóbií a leguminóz je složitější, a to díky tomu, že zahrnuje dva zcela různé organismy. Regulaci metabolismu dusíku zajišťují nif-ntr geny a dále geny, které zajišťují hostitelskou specifitu a tvorbu hlízek. 23

Obr. 7. Regulace nitrogenázy. Vysvětlivky: Mechanismy regulace syntézy nitrogenázy: pozitivní regulace ------------- negativní regulace nespecifikované vazby GRMN = globální regulace metabolismu dusíku v buňce Upraveno podle Šimek (1993). 24

5. Mikroorganismy fixující molekulový dusík Mikroorganismy schopné využívat molekulární dusík jsou někdy označovány jako diazotrofové (fixátoři molekulárního dusíku). Velká většina organismů včetně všech rostlin a živočichů není schopna syntetizovat enzym nitrogenázu a je tedy odkázána na příjem dusíku v podobě různých sloučenin. Přítomnost tohoto enzymu v organismu však poskytuje možnost přežití v takových podmínkách, kde by jiné organismy mohly jen těžko existovat (např. v oblastech, kde je koncentrace dusíku v prostředí, v jiné podobě než N 2, velice nízká). Diazotrofové jsou organismy žijící buď samostatně, nebo od různě volných až po mutualistické soužití (symbiózu) s jiným organismem. 5.1 Volně žijící organismy fixující molekulární dusík Mezi tyto organismy řadíme bakterie a sinice žijící jak heterotrofně tak autotrofně; aerobně, fakultativně anaerobně, mikroaerofilně i anaerobně; organismy fotosyntetizující či nikoli (Tab. 2). Mikroorganismy žijící ve volném prostředí si stejně tak jako organismy žijící v symbióze musí vytvořit pro průběh fixace molekulové dusíku vhodné anaerobní prostředí. Tvoří jej např. pomocí obalových struktur či změnou metabolického systému buňky (př. sinice (rod Anabaena) heterocyty). Biologická fixace u symbiotických systémů využívá energii získanou rostlinnou fotosyntézou a u volně žijících organismů z organických látek v půdě. Dostatečný přísun energeticky bohatých látek je tedy vzhledem k poměrně vysoké energetické náročnosti biologické fixace jejím rozhodujícím činitelem. Volně žijící fixátoři vzdušného dusíku jsou schopni za rok fixovat 8 120 kg dusíku/ha (Procházka a kol., 1998). Nejčastěji zmiňovaným organismem v souvislosti s volně žijícími fixátory dusíku jsou gramnegativní bakterie rodu Azotobacter. Řadí se do čeledi Azotobacteraceae třídy Gamaproteobacteria. Zástupci tohoto rodu mají tyčkovitý až pleomorfní tvar, většinou jsou pohyblivé (často peritrichálně obrvené). Nacházejí se v půdě, vodě a ojediněle na kořenech rostlin. Slouží jako modelový organismus pro výzkum alternativní nitrogenázy. Dalšími častými mikroorganismy vyznačujícími se schopností vázat N 2 jsou bakterie rodu Pseudomonas a Xanthomonas (třída Gamaproteobacteria), Beijerinckia a Xanthobacter (třída Alfaproteobacteria). První dva zmíněné rody patří do čeledi Pseudomonadaceae jsou to gramnegativní rovné až mírně zakřivené tyčky, pohyblivé pomocí polárního bičíku, striktně aerobní, žijící v širokém rozmezí teplot (4 43 C). Dalším zástupcem je rod Beijerinckia samostatný rod třídy Alfaproteobacteria. Jeho zástupci mají tvar tyčky, někteří mohou tvořit 25

kapsulu, mohou být obrvené i bez bičíků. Vyskytují se v půdě tropických oblastí. Zástupci rodu Xanthobacter se vyznačují pleomorfním tvarem buněk, tvorbou žlutého pigmentu a výskytem v promáčených půdách (tedy v půdách obsahujících velké množství organického materiálu). Tab. 2. Volně žijící organismy schopné fixace molekulárního dusíku. Volně žijící Vztah k energii Vztah ke kyslíku Mikroorganismus baktérie a sinice heterotrofní aerobní Azobacter, Azomonas, Acetobacter, Azotococcus, Pseudomonas, Beijerinckia, Derxia, Xanthobacter, Nocardia, Pullalaria autotrofní Upraveno podle Šimek (1993). mikroaerofilní fakultativně anaerobní fakultativně anaerobní fotosyntetizujícíaerobní fotosyntetizujícíanaerobní nefotosyntetizujícíaerobní nefotosyntetizujícíanaerobní Azospirillum, Aquaspirillum, Campylobacter, Herbaspirillum, Arthrobacter, Thiobacillus, Rhizobium, Frankia, Baggiatoa, Thiothrix Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Vibrio, Achromobacter Clostridium, Desulfotomaculum, Desulfovibrio, Propionispira Anabaena, Calothrix, Nostoc, Gleothece, Cylindrospermum, (aj. sinice, celkem asi 40 druhů) Chromatium, Rhodospirillum, Rhodopseudomonas, Rhodomicrobium, Rhodocyclus, Chlorobium Methylococcus Methanobacterium, Methylosinus, Methanosarcina, Methanococcus 5.2 Symbioticky žijící organismy fixující molekulární dusík Symbiózu mezi bakteriemi fixujícími molekulární dusík a rostlinami lze rozdělit na symbiózu asociativní, nodulující a nenodulující. 26

Organismy žijící v mutualistickém vztahu s vyššími rostlinami jsou schopni ročně fixovat 45 400 kg N/ha. V případě asociativní symbiózy je to pouze 3 10 kg N/ha (Procházka a kol., 1998). Množství fixovaného dusíku zástupci rodu Rhizobium je uvedeno v Tab. 4. Z uvedených údajů vyplývá, že právě díky mutualistickému způsobu života je baktérie schopna vázat dusík se značnou efektivitou. 5.2.1 Asociativní symbióza Asociativní symbióza je v podstatě synergický vztah ustavující se mezi půdními mikroorganismy a rostlinou (př. bakteriální rody Azotobacter, Beijerinckia, Arthrobacter a Pseudomonas a kořeny rostlin s fotosyntetickou drahou typu C4). Tento druh symbiózy je hojně rozšířen především v subtropických a tropických oblastech, kde se právě rostliny s touto drahou vyskytují (dokáží lépe využít světelnou intenzitu a vyšší teploty prostředí). Příklady dalších asociativních symbióz jsou uvedeny v Tab. 3. Některé rostliny vytváří a transportují do kořenů zvýšené množství uhlíkatých látek, které částečně vylučují ve formě kořenových exudátů do půdy. Tyto exudáty představují lehce dostupný zdroj energie a uhlíku pro bakterie fixující N 2. Tab. 3. Příklady asociativních systémů. Asociativní bakterie r. Azospirillum tropické rostliny (Paspalum notatum) systémy bakterie vyšší rostliny (v rhizosféře) bakterie, sinice rostliny (v nadzemních částech) Upraveno podle Šimek (1993). 5.2.2 Nodulující symbióza Jedná se o symbiózu mezi rostlinami čeledi Fabaceae (motýlokvěté) s bakteriemi rodu Rhizobium, dále pak Mimosaceae (citlivkovité) a Caesalpiniaceae (saponovité) s bakteriemi rodu Rhizobium, Bradyrhizobium, Phyllobacterium (tzv. hlízkovité bakterie) nebo aktinomycety rodu Frankia. Hlízkovité bakterie jsou běžnou součástí mikrobiálního společenstva půdy. Žijí-li však v půdě volně a upřednostňují saprotrofický způsob života, přičemž většinou dusík nefixují (Gade, 2004). Tyto bakterie přesto zásobují rostlinu dusíkem a dokáží svou aktivitou pokrýt až 80 % nároků rostliny na dusík. První tři jmenované rody patří do čeledi Rhizobiaceae třídy Alfaproteobacteria. Jsou to vesměs pleomorfní tyčkovité organismy, většinou pohyblivé, mohou tvořit extracelulární 27

sacharidová pouzdra. Jako symbiont vyšších rostlin se nejčastěji uplatňují baktérie rodu Rhizobium (Tab. 4). Bakterie rodu Bradhyrhizobium jsou za určitých podmínek schopny fixovat vzdušný dusík i mimo hlízku. Phyllobacterium je rodem, jehož zástupci tvoří uzliny na listech vyšších rostlin, především v tropických oblastech. Tab. 4. Zástupci rodu Rhizobium žijící v symbióze s bobovitými rostlinami. Rostliny Druhy rodu Množství fixovaného Rhizobium dusíku(kg/ha/rok) jetel (Trifolium) R.trifolii 45-340 fazol (Phaseolus) R.phaseoli 63-340 čočka (Lens) R.leguminosarum 88-114 hrách (Pisum) R.leguminosarum 52-77 Vlčí bob (Lupinus) R.lupini 142-203 vojtěška (Medigago) R.meliloti 90-340 Upraveno podle Pocházka a kol. (1998). 5.2.3 Nenodulující symbióza Příkladem tohoto typu symbiózy může být soužití sinic rodu Anabaena nebo Nostoc s houbami, kapraďorosty nebo mechorosty, přičemž si sinice zachovávají schopnost vázání N 2. Symbióza sinic s houbami se vyskytuje přibližně u 8% druhů lišejníků. V tropech je velmi rozšířená symbióza sinice Anabaena s vodní kapradinou Azolla. Často se hojně vyskytují na povrchu rýžových polí, kde svou aktivitou zajišťují až 75% nároků rýže na dusík (Procházka a kol., 1998). Ostatní možnosti nodulující i nenodulující symbiózy jsou uvedeny v tabulce 5. Tab. 5. Příklady symbiotických systémů. Symbiotické Mikroorganismus Rostlinný symbiont systémy Rhizobium, Bradyrhizobium, leguminózy (byliny i dřeviny, Azorhizobium více než 280 druhů) Frankia olše (Alnus), Myrica, Eleagnus aj. (více než 25 rodů z 8 čeledí) sinice houby => lišejníky sinice kapradina (Azolla) sinice řasy, játrovky, rostliny řádu Cycadales, krytosemenné rostliny Upraveno podle Šimek (1993). 28

6. Nesymbiotická fixace molekulového dusíku Výčet organismů, které nevystupují jako symbionti v mutualistickém vztahu s jiným organismem a přesto dokáží fixovat vzdušný dusík je uveden v tabulce 1. (Kapitola 5). Mikroorganismy schopné fixace N 2 syntetizují výše zmíněný enzym nitrogenázu, jež je ireverzibilně inhibován kyslíkem, a proto je třeba jej před ním chránit. Organismům vystupujícím jako symbionti většinou pomáhá hostitel. Bakteriím rodu Rhizobium pomáhají buňky kořene luskovin tím, že kódují protein, jež reguluje koncentraci kyslíku v kořenových buňkách, tzv. leghemoglobin. Nesymbiotický způsob fixace tedy může probíhat pouze u organismů, kteří jsou schopni si koncentraci kyslíku ve svém okolí uhlídat samy, typickým příkladem jsou sinice. 6.1 Azotobacter Aerobní bakterie rodu Azotobacter jsou schopny v kyslíkatém prostředí v laboratorních podmínkách fixovat až 30 kg dusíku/ha/rok. V přirozených podmínkách je množství nižší, okolo 5 10 kg dusíku na 1 ha za rok (Němec, 1986). Azotobacter je ve své činnosti limitován faktory vnějšího prostředí, i v dobře obdělávaných černozemích je jeho výskyt poměrně nízký, pohybuje se v rozmezí 10 3 10 4 v 1 mg půdy. Jako zdroj uhlíkaté výživy využívá cukry, alkoholy i organické látky, je však velmi náročný na dostatečnou koncentraci kyslíku ve svém prostředí. Vyžaduje půdy, které jsou dobře provzdušněné, mají vhodnou vlhkost a neutrální až alkalické ph. Dalším faktorem ovlivňujícím růst a fixaci N 2 u této bakterie je přítomnost jiné půdní mikroflóry (prospěšný vztah se sinicemi, řasami, prvoky, pseudomonádami, bakteriemi schopnými rozkladu celulózy, aj.). Mladé buňky spotřebují 70 90 % vázaného dusíku na syntézu bílkovin, zbývající množství je transportováno do vnějšího prostředí. Během generační doby stoupá množství transportovaného dusíku vně buňky (Němec, 1986). 6.2 Clostridium Klostridia jsou mikroorganismy schopné fixace vzdušného dusíku v anaerobních podmínkách (jsou to striktně anaerobní bakterie). Mezi nejvýznamnější druhy patří Clostridium pasteurianum. Energii potřebnou pro fixaci N 2 získává zkvašováním cukrů na kyselinu máselnou a octovou (Němec, 1986). Mezi druhy tohoto rodu vyznačujícími se schopností fixace dusíku patří Cl. aceticum, Cl. acetobutyricum, Cl. beijerinckii, Cl. butyricum, Cl. perfringens, Cl.felsineum, aj. Jsou 29

rozšířeny v půdách obdělávaných a podzolových i v rašeliništích a bahnech a to díky toleranci k ph prostředí (ph optimum se pohybuje v rozmezí 6,9 7,3). Fixace těmito organismy jsou významné především v lesních a kyselých půdách. 6.3 Fixace N 2 u sinic U cyanobacterií dochází ke střetu dvou v podstatě neslučitelných pochodů. Ve všech vegetativních buňkách probíhá fotosyntéza, která vede k uvolňování molekul kyslíku. Ty jsou však neslučitelné s vázáním N 2. Z tohoto důvodu se u sinic vyvinuly strategie prostorové a časové separace fotosyntézy a fixace N 2. U vláknitých sinic pododdělení Nostocales a Stigonematales dochází při nedostatku dusíkatých látek k diferenciaci buněk specializovaných na fixaci heterocytů. Informace uvedené v této podkapitole byly převzaty z http://www.sinicearasy.cz. 6.3.1 Prostorová separace Během přetváření vegetativní buňky v heterocyt dochází ke změnám ve struktuře i funkci celé buňky. Jako první se ukládá trojvrstevná stěna vně původní buněčné stěny. Vnitřní vrstva je tvořena glykolipidem, střední polysacharidem a vnější nekompaktními vlákny téhož polysacharidu. Tento krok je na buňce patrný již po 6 12 hodinách od započetí diferenciace. Výsledkem je stále metabolicky aktivní buňka se silnou buněčnou stěnou proheterocyt. Následuje řada dalších biochemických změn, během nichž je systém thylakoidů uvnitř buňky zcela přestavěn v nový membránový systém. Zcela mizí fotosystém II s OEC (centrum pro štěpení vody a uvolňování kyslíku), zatímco fotosystém I i s chytochromálními komplexy jsou zachovány. Fotosystém I slouží k uskutečňování cyklického procesu, který vede ke generaci ATP a na cytochromech probíhá dýchací řetězec, což je další z prostředků, který vede ke snížení hladiny O 2. Z buňky také mizí enzym Rubisco. Posledním krokem je syntéza vlastních enzymů provádějících reakci nitrogenáza (U sinic se většinou vyskytuje FeMo-nitrogenáza. Byly však izolovány i kmeny např. Anabaena obsahující alternativní V-nitrogenázu), GS-glutamin syntetázu (přenáší amonný iont na glutamát) a GOGAT (enzym zajišťující regeneraci glutamátu). Celý proces diferenciace je striktně regulován a obvykle trvá 12 20 hodin, může však trvat až 30 hodin. Zralý heterocyt komunikuje se sousedními vegetativními buňkami pomocí sept v místě styku s nimi (tzv. polární noduly). Jde o pór se složitou strukturou, který je 30

perforovaný několika desítkami mikroplasmodesmat, jimiž dochází k transportu dusíkatých látek okolním buňkám a dodávce redukčních ekvivalentů NADH z okolních buněk. Podobný systém prostorové separace se uskutečňuje ještě u několika dalších rodů sinic. Příkladem může být mořský rod vláknitých sinic Trichodesmium. Tyto sinice na svém vlákně tvoří úsek asi 5 vegetativních buněk, ve kterých přestává fungovat fotosyntéza, avšak dýchání probíhá dále. Tyto buňky se nazývají diazocyty. 6.3.2 Časové oddělení fixace N 2 a fotosyntézy Toto oddělení obou dějů se vyvinulo u řady vláknitých ale i kokálních typů sinic. Během dne dochází ve vegetativních buňkách k fotosyntéze, čímž se získává energie potřebná pro růst a akumulaci NADP a ATP. V noci pak v důsledku snížení fotosyntézy, ale stále stejně efektivně probíhajícímu dýchání, se snižuje hladina kyslíku uvnitř buňky a tedy k vytvoření prostředí vhodného k fixaci dusíku. (Dynamika procesu je naznačena na Obr. 8). Tento způsob byl prokázán např. u sinic Plectonema boryanum a Aphanothece. Obr. 8. Dynamika fixace N 2 u různých typů sinic. noc den noc Vysvětlivky: Nitrogenázová aktivita je uvedena v katalech = množství enzymu, které přemění 1 mol substrátu za 1 sekundu. Upraveno podle http://www.sinicearasy.cz. 31

7. Symbiotická fixace molekulového dusíku Symbiotická fixace N 2 je podmíněna vznikem oboustranně výhodného soužití mezi některými druhy rostlin a bakteriemi nebo houbami. Bakterie (včetně sinic) vystupují jako fixátoři dusíku a houby poskytují rostlinnému hostiteli živiny rozpuštěné ve vodě (Pawlowski a Bisseling, 1996). V případě hlízkovitých bakterií, mykorrhizy a podvojného organismu (lišejníku) mluvíme o tzv. mutualistickém vztahu. Mutualismus je trvalé a nezbytné soužití obvykle dvou druhů organismů, kteří mají ze soužití prospěch a jsou na sobě závislí. V případě asociativní symbiózy půdních mikroorganismů na kořenech vyšších rostlin mluvíme o protokooperaci. Tento vztah je volnější než mutualismus. (Populace A a populace B jsou v prospěšném, nikoliv nutném soužití.) Vzájemné vztahy organismů jsou uvedeny v tabulce 6. Tab. 6. Vzájemné vztahy organismů. Typ vztahů Vliv na druh A Vliv na druh B Neutralismus 0 0 Konkurence Amensalismus 0 Parazitismus + Predace + Komensalismus + 0 Protokooperace + + Mutualismus + + Vysvětlivky: - populace je ovlivněna negativně, + populace je ovlivněna pozitivně, 0 populace není ovlivněna Symbióza mezi rostlinou a mikroorganismem může být několika typů: asociativní, nenodulující a nodulující (s leguminózami nebo s jinými rostlinami). 7.1 Nodulující (hlízkovité) symbiózy Nejvýznamnější symbiotický vtah, vzhledem k množství fixovaného dusíku, se vytváří mezi leguminózní rostlinou a rhizóbii. Vnějším znakem vytvoření tohoto vztahu je tvorba hlízek na jejich kořenech. Hlízkovité bakterie se vyznačují vysokou specifitou ve vztahu k 32

hostiteli, např. rhizobia izolovaná z hlízek na kořenech fazole nejsou schopna vytvářet hlízky na hrachu a naopak (Němec, 1986). Nodulující symbiotická fixace není výsadou pouze mutualistického vztahu leguminóza rhizobium, ale vytváří se i u jiných organismů, např. Alnus, Casuarina, Coriaria, Elaeagnus, Hippophae, Shepherdia, Myrica, aj. Také některé tropické rostliny z čeledí Rubiaceae a Myrsinaceae vytváří útvary podobné hlízkám. Rozdíl od leguminóz je v jejich umístění netvoří se na kořenech, ale na listech. Bakterie tvořící tyto hlízky jsou schopné fixovat dusík i mimo hostitelskou rostlinu a byly zařazeny do rodu Klebsiella a Chromobacterium. Tvorby kořenových hlízek jsou schopné i sinice rodu Anabaena, Nostoc či Chlorococcum a to v případě, že žijí v symbiotickém vztahu s rostlinnými zástupci Cycadales. 7.2 Nenodulující symbióza - lišejníky (Lichenes) Lišejníky bývají označovány jako duální organismy. Jde totiž o symbiotickou spolupráci dvou (někdy i více) rozdílných typů organismů: houby (mykobiont) a zelené řasy nebo sinice (fotobiont). Počet druhů je odhadován na 13 500 až 17 000, rostoucích od tropů až po polární oblasti. Některé druhy rostou dokonce na kůře stromů jako epifyty (většinou v tropických deštných pralesích). 7.2.1 Mykobiont Několik málo druhů hub (asi 20 druhů) tvořících součást lišejníků patří do skupiny hub Basidiomycota, ale většinu představují zástupci skupiny Ascomycota, které často vytvářejí fruktifikační orgány ascocarpy (jsou to obvykle útvary diskovitého tvaru nazývané apothecia). Téměř polovina všech hub vyskytujících se na zemi patří mezi Ascomycota a velké procento z nich se vyskytuje pouze jako součást lišejníku. Ačkoliv jsou jejich spóry (uvolňované z fruktifikačních orgánů) rozptýleny do prostředí, nejsou schopny samostatného života. Jsou to pomalu rostoucí organismy, kterým navíc chybí enzymový systém pro degradaci komplexů polymerů. Mykobiont má v principu dvě funkce: chrání fotosyntetického partnera před přímým slunečním světlem a vysoušením a absorbuje ve vodě rozpuštěné minerální látky z podloží. Je také schopen vázat atmosférické kontaminanty (Deacon, 2005). Hyfa houby obvykle vytváří krátké větve, které penetrují buněčnou stěnu řasy. Tyto útvary se nazývají haustoria a slouží houbě k absorpci živin z řasy. V případě, že je fotobiont sinice 33

(např. lišejník rodu Peltigera), houba nevytváří haustoria, ale produkuje tenkostěnné výčnělky, které penetrují hydrofilní gelovitý obal obklopující buňku sinice. 7.2.2 Fotobiont V porovnání s množstvím hub tvořících součást lišejníků, existuje pouze okolo 100 fotosyntetických partnerů. Nejběžnější je jednobuněčná zelená řasa rodu Trebouxia. Tato řasa roste samostatně jen zřídka. Jiným také běžným fotosymbiontem je vláknitá zelená řasa rodu Tretepohlia rostoucí výhradně ve středomořských a tropických oblastech. Tento rod zelených řas se v přírodě vyskytuje pouze jako součást lišejníku (Deacon, 2005). Fotosyntetickým partnerem mohou být i sinice vyskytují se asi u 10 % lišejníků. Nejčastěji se vyskytujícím rodem je Nostoc. U některých druhů lišejníků obsahujících jako fotosymbionta zelenou řasu není výjimkou, že mají na svém povrchu i sinici (vytvářející bradavičnaté struktury). Struktura lišejníku je znázorněna na Obr. 9. Funkce fotosymbionta spočívá v syntéze organických látek z CO 2, může také fixovat vzdušný dusík (lišejník druhu Collema tenax) a poskytovat mykobiontu fosfor. Díky možnosti fixovat dusík se zvětšuje jejich šance na přežití i v opravdu nevhodných podmínkách. Obr. 9. Struktura lišejníku. Upraveno podle Němec (1986). 34

8. Fixace molekulového dusíku u leguminózních a neleguminózních rostlin Kořenové hlízky, ve kterých úspěšně dochází k fixaci N 2 byly dosud nalezeny u 10 rostlinných čeledí zahrnujících jak byliny tak i stromy a keře. Tyto rostliny tvoří nejčastěji symbiotický (mutualistický) vztah s bakteriemi rodu Rhizobium a Frankia. Pojmem leguminózní (opak neleguminózní) jsou myšleny vikvovité rosliny mezi než patří i Medicago sativa nebo Lotus japonicus, které souží jako modelové organismy pro analýzy genů nezbytných pro symbiotickou fixaci N 2. 8.1 Vzájemná výměna signálů mezi mikroorganismem a leguminózní rostlinou Začátkem 90. let biologové rozluštili chemické signály, které spouští rannou symbiotickou reakci. Kořeny hostitelských rostlin produkují flavonoidy - luteolin, apigenin, daidzein, naringenin (Obr. 10), betainy (trigonellin, stachydrin a další) nebo kyselinu aldonovou. V nízkých koncentracích tyto látky působí jako signál pro chemotaxi bakterie. Avšak ve vyšších koncentracích, blíže k povrchu kořene, spouští expresi plazmidových nod genů pro tvorbu lipochitooligosacharidových molekul tzv. Nod faktorů (Catoira, 2000). Každý rostlinný druh vylučuje specifickou směs flavonoidů. To zajišťuje, že jeho chemický signál bude přijat správným bakteriálním druhem. Navíc rostlina tvoří na povrchu svých kořenových vlásků lektiny (bílkoviny specificky vážící oligosacharidové řetězce), které usnadňují vazbu a průnik bakterie do vlásku (Parniske, 2004). Obr. 10. Struktura 7,4 - dihydroxyflavonu. Základem molekuly Nod faktoru je tři až pět β 1,4 N acetyl D glukozaminových řetězců. Tyto řetězce mají redukující a neredukující konec. Na neredukující koncové oblasti jsou N acylovány řetězci mastných kyselin a redukující koncová oblast oligosacharidové páteře molekuly bývá modifikována druhově specifickými skupinami, mezi něž patří sulfát, acetát, fruktóza nebo arabinóza (Obr. 11). 35

Obr. 11. Struktura Nod faktoru. Nod faktory jsou rostlinou vnímány díky receptorovým komplexům uloženým v plazmatické membráně epidermálních buněk kořene (Madsen a kol., 2003; Radutoiu a kol., 2003). Tyto komplexy jsou tvořeny extracelulární a intracelulární oblastí. Vnější oblast obsahuje LysM domény, jež byly nalezeny již dříve v proteinech vázajících peptidoglykany (Bateman a Bycroft, 2000). Produkty genů NRF1 a NRF5 (nodulation-specific Nod-factor receptor) jsou vhodnými kandidáty na pozici receptorů Nod faktorů, protože obsahují LysM motivy, které dokáží vázat molekuly obsahující N- acetyl-glukosamin (Parniske, 2004). Intracelulární doménou je serin/treoninové kináza, která po zachycení signálu mění svoji aktivitu a v roli enzymu pozměňuje aktivitu dalších bílkovin v buňce (dochází ke spuštění signální receptorové kaskády). Důležitou úlohu v přijmu signálu rostlinou mají DMI1, DMI2, DMI3 geny (z ang. DOESN T MAKE INFECTIONS). V Medicago truncatula se předpokládá iontový kanál kódovaný DMI1 (běžný SYM gen) (Parniske, 2004)., který vykonává svoji činnost proti transportu vápenatých iontů (stejně tak jako DMI2). Naproti tomu DMI3 je aktivován po směru transportu vápenatých iontů (Wais a kol. 2000; Oldroyd a Long, 2003). 36

8.1.1 Reakce rostliny na bakteriální Nod faktory Nod faktory umožňují bakteriím infikovat kořen hostitelské rostliny a iniciovat celou soustavu kroků vedoucí k tvorbě kořenové hlízy a rozvoji symbiotické fixace N 2. Baktérie kontaktující kořen rostliny způsobuje morfologické změny v jeho epidermálních buňkách. Tyto změny probíhají v několika krocích (Obr. 12): 1. Deformace a stáčení kořenového vlásku. 2. Tvorba infekčního vlákna a jeho růst. 3. Vznik kořenové hlízky. 4. Tvorba bakteroidů. Obr. 12. Průběh infekce hostitelské rostliny. 37

8.1.1.1 Deformace a stáčení kořenového vlásku Prvními morfologickými změnami, které jsou indukovány produkty genetické exprese v rhizobiích jsou deformace a stáčení kořenového vlásku. Vlásek se pod jejich vlivem stane na několik sekund propustný pro ionty. Dochází k depolarizaci plazmatické membrány způsobené importem Ca 2+ a H +. Z buňky jsou současně vylučovány ionty draslíkové a chloridové. Po prvním influxu vápníku následuje ještě série menších. Tato oscilace koncentrace vápníkových iontů má za následek spuštění exprese celé řady rostlinných genů, jejichž produkty jsou nutné pro další kroky a k vyvolání změny v postavení aktinových filament. Deformace kořenových vlásků se ve většině případů vyskytuje jen u těch, které právě ukončily svůj přirozený růst (Heidstra a kol., 1994). Je u nich nově indukován izotropní růst. Jeho směr je vždy určen oblastí vlásku, která zachytila Nod faktor a která je atakována bakteriemi (Esseling a kol., 2003). Tímto způsobem se vlásek otočí o 360 a tím bakterii uzavře do vzniklého prostoru (tzv. vaku). Funkce této izolace není ještě dostatečně objasněna. Nejspíše je důležitá pro vytvoření dostatečného turgorového tlaku potřebného pro vstup bakterie do buňky (Esseling a kol., 2003). Množství infekčních bakterií, které vstupují do buněk kořene si musí rostlina regulovat sama, kdyby tomu tak nebylo, mohlo by se stát, že by bakterie rostlinu zahltily a později vytvořily velké množství hlízek, které by ji nutričně zcela vyčerpaly. Jedním z regulátorů je etylén, který tlumí odpověď rostliny na Nod faktory. Kromě jiného je schopen zastavit také vápníkovou oscilaci (Petr, 2004). 8.1.1.2 Tvorba infekčního vlákna V místě buněčné stěny, která je v kontaktu s bakterií, dochází během vytvoření vaku z kadeře vlásku k její hydrolýze. Plazmatická membrána se vchlipuje dovnitř rostlinné buňky a tvoří tubulární strukturu - infekční vlákno (Endre a kol., 2002). Látky, které tvoří membránu a obsah infekčního vlákna jsou produkovány hostitelskou rostlinou i bakteriemi. Infekční vlákno prorůstá k primární kůře kořene, kde se indukuje tvorba primordia (Van Spronsen a kol., 1994). Uvnitř infekčního vlákna se rhizobia množí a rostou. Při styku s buňkou nodulu se membrána infekčního vlákna rozpouští, bakterie se uvolní do mezibuněčného prostoru a následně vstupuje do buněk obalena membránou odvozenou z plazmatické membrány buňky hostitelské rostliny (Heidstra a kol., 1994). 38

8.1.1.3 Vznik kořenové hlízky Základ hlízky (primordium) tedy vzniká ve vnějších nebo vnitřních vrstvách primární kůry, především v blízkosti xylémových částí centrálního radiálního cévního svazku. Pokud základ nodulu vzniká v hlubších vrstvách, buňky primární kůry mění uspořádání cytoplazmy a připravují infekčnímu vláknu k základu nodulu cestu, tím že se v prostoru mezi buněčnými stěnami tvoří cytoplazmatický most, kterým infekční vlákno prostupuje, jak je znázorněno na Obr. 12. a 13. (Yang a kol., 1994). Během iniciace tvorby hlízky se u rostliny exprimuje cyklin CycA2, jehož nadměrná tvorba vlivem přítomnosti Nod faktorů aktivuje buněčný cyklus (mitózu) a obnovuje dělení již diferencovaných buněk (Roudier a kol., 2000). Auxin (rostlinný hormon) také ovlivňuje buněčné dělení, tím že jej stimuluje a působí na diferenciaci buněk, proto se ve velkém množství akumuluje v hlízkovém primoridiu (Dutis a kol., 1993; Whightman a kol., 1980). Koncentrace auxinu v kořenech může být regulována jeho transportem z kořene ven nebo oxidací (Bandurski a kol., 1995; Lomax a kol., 1995). Obr.13. Endosymbiotický vstup do rostlinné buňky. a) Intracelulární penetrace u leguminózních rostlin b) Intercelulární penetrace u neleguminózních rostlin Upraveno podle Pawlowski a Bisseling (1996). 39

8.1.1.4. Vytvoření bakteroidů Bakteriální buňky tedy vstupují do prostoru hlízkovitého primordia procesem podobným endocytóze. Membrána obklopující bakterii je nazývána peribakteriální membránou a vzniká z cytoplazmatické membrány buňky nodulu i proteinů bakteriálního původu a má některé složky i vlastnosti tonoplastu (Vercher, 1989). Zde se bakterie mění na bakteroid formu, která je schopna fixace molekulového dusíku (schopna syntetizovat enzym nitrogenázu) (Brewin, 1991). Peribakteriální membrána zajišťuje transport látek a signálů mezi bakterií a rostlinou. Z nodulu do cytosolu hostitelské buňky je transportován NH + 4. Zpětně jsou transportovány především organické látky (dikarboxylové kyseliny a pyruvát), H 2 O (specifickým typem aquaporínů) i potřebné produkty asimilace NH + 4. Amoniový iont je transportován díky specifickému a netypickému transportéru, tzv. SAT1, s jednou transmembránovou doménou, kódovanou hostitelskou rostlinou (Oke a Long, 1999). Vstup kyslíku do buňky je regulován specifickým proteinem s hemovou prostetickou skupinou leghemoglobinem, který je syntetizován hostitelskou buňkou. Noduly jsou dvojího typu nedeterminované a determinované. V nedeterminovaném tzv. meristematickém typu nodulů se buňky v jeho apikální části dělí a infikují, v bazální potom stárnou a odumírají. Tvoří je především druhy rostlin mírného pásma exportující amidy. V determinovaným nodulech dělení buněk ustává, hlízka se jako celek zakládá, vyvíjí, zraje, stárne a poté odumírá. Tento typ vytváří tropické druhy rostlin čeledi Fabaceae, které exportují amidy a ureidy. Hlízky přetrvávají na kořenech do té doby, než rostlina začne vytvářet plody (Vercher, 1989). 8.2 Fixace N 2 u neleguminózních rostlin Zástupci rodu Rhizobium nejsou jedinými mikroorganizmy, které mohou žít jako endosymbionti v kořenech rostlin (ve většině případů motýlokvětých). Tuto schopnost mají i jiné mikroorganismy, např. actinomycety rodu Frankia, které žijí v symbiotickém vztahu s vytrvalými neleguminózními rostlinami mezi něž patří olše (Alnus), olivy, přesličník (Casuarina), tamaryšek (Myrica), jilm (Ulmus) a další (Berry a Sunell, 1990). Frankia je bakteriální rod patřící mezi actinomycéty, které jsou charakteristické svým pomalým růstem a vysokým procentuálním zastoupením guaninu a cytosinu v DNA (Benson and Silvestr, 1993). 40

Je znám však i případ, kdy se vytváří mutualistický vztah mezi neleguminózní rostlinou (Parasponia) a bakterií rodu Rhizobium. 8.2.1 Infekce neleguminózní rostliny bakteriemi Geny potřebné k infekci rostliny jsou velice podobné genům umožňujícím symbiózu: leguminózní rostlina Rhizobium. Časné nodulační geny jsou exprimovány před započetím fixace dusíku jsou důležité pro infekci rostliny, pro vznik a vývoj hlízky, zatímco pozdní nodulační geny slouží k diferenciaci metabolických aktivit, nutných pro správnou funkci kořenové hlízky. Infekce může probíhat dvojím způsobem: intercelulárně a intracelulárně. Intercelulární infekce byla popsána pouze u rodu hlošina (Elaeagnus); (Diouf a kol., 2003) a v tomto případě proces není spojen se vznikem prenodule, s výjimkou rodu Ceanothus, u něhož byla zaznamenána nízká mitotická aktivita bez buněčné expanze nebo infekce (Diouf a kol., 2003). Intracelulární infekci zahajují dosud neurčené signály, které produkují bakterie a vyvolávají tak stáčení kořenového vlásku (Prin a Rougier, 1987). Bakterie proniká do deformovaného kořenového vlásku, který je lokalizován u základu postranního kořene a zde indukuje hydrolýzu buněčné stěny. Poté, co bakterie vstoupí do korové buňky, je obdána membránou odvozenou z plazmalemy buňky (obsahuje celulózu, pektiny a hemicelulózy) (Newcomb a Wood, 1987; Smith a Smith, 1990). Tento proces je spojen s posunem jádra rostlinné buňky, pohybem cytoplazmy a objevením se struktury podobné fragoplastu (útvar objevující se v rostlinných buňkách při nepřímém dělení buněčného jádra, tam kde vzniká přehrádka). Infekční vlákno obsahující bakterie nejdříve kolonizuje (infikuje) dělící se buňky kořenové kůry za vniku prenodule. Prenodule se už ve zralou hlízku nepřeměňuje. Buňky Frankia, které pronikly do prenodule, zahajují fixaci dusíku (Laplaze a kol., 2000). Rozvoj procesu fixace v prenoduli spustí mitotickou aktivitu v buňkách pericyklu (v oblasti proti protoxylému) a vytvoří se primordium (Obr. 13, 14). Prenodule by mohla představovat prekuzor pro kořenovou hlízku (Laplaze a kol., 2000). Hlízky jsou obvykle tvořeny velkým počtem laloků, z nichž každý přestavuje pozměněný postranní kořen bez kořenové čepičky (Benson a Silvestr, 1993), mají nedeterminovaný růst a mohou nebo nemusí vytvářet hlízkovitý kořen (Diouf a kol., 2003). Fixace probíhá v přítomnosti leghemoglobinu (stejně jako v případě symbiózy: Rhizobium leguminózní rostlina), který kóduje Frankia (Fleming a kol., 1987). Ještě předtím než bakterie infikuje rostlinu (žije v tzv. volném stádium) je schopna syntetizovat nitrogenázu. Vytváří totiž na konci vláken měchýřky, uvnitř kterých je tento 41

enzym lokalizován a chráněn před přístupem kyslíku vícevrstevnou lipidovou membránou. (Berry, 1994). Obr. 14. Infekce a časná organogeneze kořenové hlízky (laloku) v aktinorhizální rostlině. Upraveno podle Obertello a kol. (2003). 8.2.2 Symbiotický vztah: neleguminózní rostlina - Rhizobium Pouze v jednom případě dochází ke změně prenodule v pravou kořenovou hlízku, a to při infekci rosliny rodu Parasponia (Ulmaceae) bakteriálním rodem Rhizobium. Rhizobia se však na rozdíl od symbiózy s leguminózními rostlinami, nediferencují v bakteroidy. Primordium vzniká stejně jako při infekci rodem Frankia v pericyklu kořene. Přetrvávající infekční vlákno je obklopeno a uzavřeno cytoplazmatickou membránou a fibrilárním materiálem (Pawlowski, 1997). Infikovaná zóna kořenové hlízky je složena ze dvou buněčných populací infikovaných a neinfikovaných. Neinfikované buňky mají zatím neznámou funkci. 42

9. Arbuskulární mykorhizální symbióza a fixace molekulového dusíku Termín mykorhiza je označení pro symbiotický vztah cévnaté rostliny a houby. Rostlina je v tomto mutualistickém (oboustranně výhodném) vztahu nazývána fykobiontem a houba mykobiontem. Více než 80 % suchozemských rostlin vytváří arbuskulárně mykorhizní (AM) symbiózu, která zlepšuje jejich nutriční příjem (zejména relativně nepohyblivého fosforu) (Parniske, 2004). Arbuskulární mykorhiza není přítomna jen u několika málo rostlin, a to především vodních, mokřadních a ruderálních. Tato symbióza je typem endomykorhizním, tzn. hyfy houby vstupují do kortikálních buněk kořenů hostitelské rostliny a vytváří zde typické útvary arbuskuly a vesikuly. Některé skupiny hub vytváří pouze arbuskuly. Rostlina z tohoto vztahu získává především vodu a minerální látky (může ale získat i některé vitamíny a růstové látky) a houbě poskytuje sacharidy a lipidy (Bago a kol., 2003). Všechny houby vytvářející AM symbiotický vztah s rostlinami patří do oddělení Glomeromycota (např. rody: Glomus, Gigaspora, Acaulosprora a Sclerocystis) jde většinou o skupiny hub, které se na Zemi objevily před více jak 450 milióny lety a jejíž zástupci se podíleli na kolonizaci souše rostlinami (Remy a kol., 1994). Symbiotický vztah totiž umožňuje vývoj rostliny i za nedostatku živin a různých stresových podmínek (Parniske, 2004). Hlavními kroky, které se musí udát, aby došlo k úspěšné kolonizaci a vzniku arbuskulární mykorhizy, jsou: 1. Germinace spóry. 2. Růst hyfy a její větvení. 3. Vznik appresoria. 4. Průnik houbového vlákna do kořene rostliny a vytvoření arbuskule. 9.1 Germinace spóry; vzájemná výměna signálů mezi hyfou a rostlinou Pro vyklíčení spóry nejsou důležité rostlinou produkované signální molekuly, ale důležitější se zdají být abiotické faktory. První rostlinné rozpoznávací signály vnímá houba až v době, kdy ze spóry vyklíčila v hyfu (Novero a kol., 2002). Houba tedy reaguje na látky vylučované do půdy kořenem rostliny. Reakcí na ně je započetí větvení volně žijící houbové hyfy, aby se zvětšila pravděpodobnost jejího setkání s kořenem rostliny (Diouf a kol., 2003) a také syntéza difuzibilních signálů. Chemická struktura látek vylučovaných budoucím rostlinným hostitelem, tzv. branching factors, byla popsána zatím jen částečně (Buee a kol., 2000) a nebyla dosud zcela dokumentována. 43

Difuzibilní signály rozpoznávané rostlinou jsou zachycovány extracelulárními LysM doménami transmembránových receptorů v plazmatické membráně buněk kořene. Dále jsou převáděny přes komplexy receptorů do nitra buňky, kde vedou k aktivaci exprese genů, které jsou důležité pro rozvoj symbiotického vztahu (Catoira a kol., 2000). 9.2 Vznik apresoria, průnik hyfy do kořene a vznik arbuskule Vlákna hub vytváří nejprve v místě styku s povrchem kořene apresoria (Obr. 15), které se však netvoří na nekompatibilních rostlinách. Z apresorií vyrůstají hyfy hub a postupně kolonizují celý povrch kořene. Zároveň produkují hydrolytické enzymy, které slouží k narušení buněčné stěny. Teprve potom může dojít k jeho penetraci. Penetraci napomáhá sama rostlina tím, že produkuje pektinolytické látky. Vlákno houby pokračuje v růstu a postupně proniká přes exodermální buňky do buněk vnitřní kůry kořene. Vlákna se dále větví a v hlubších vrstvách vnitřní kůry se vytvářejí symbiotické útvary arbuskule. Dále se mohou tvořit vezikuly - ztluštěniny obsahující zásobní látky jako jsou lipidy nebo smyčky (tělíska) z hyf (Nagahashi a Douds, 1997; Novero a kol., 2002). Tvorba vezikul může začít až po vytvoření arbuskul. Vezikuly mohou ve srovnání s abruskulemi přetrvávat na rostlině podstatně déle. Vezikuly a spóry jsou reprodukční a také jsou velice tolerantní k nepříznivým podmínkám (Diouf a kol., 2003). Obr. 15. Apresoria na povrchu rostlinného kořene. 9.3 Výměna živin mezi houbou a rostlinou Arbuskule se v buňce vyskytují v podobě rozvětveného vlákna, které obklopuje membrána odvozená od plazmatické membrány rostlinné buňky. Je také místem, kde dochází k výměně látek (živin a vody) mezi houbou a hostitelskou rostlinou (Obr. 16). Houba rostlině poskytuje vodu a anorganické látky, kterými je nejčastěji organický fosfor. Mykorhizní houba produkuje fosfatázu potřebnou pro jeho utilizaci. Fosfát se dostává do cytoplazmy rostliny z půdního 44

prostředí přes transportní bílkoviny v symbiotické membráně. Rostlina také může přijímat sodík, hořčík, vápník, železo, měď a síru. Naproti tomu symbiont od rostliny získává glukózu a fruktózu (Roth, 1988). Houba má také protektivní účinky chrání rostlinu před některými patogeny žijícími v půdě. Houba chrání rostlinu jednak fyzickou bariérou (tvorba pochev), jednak produkcí antimikrobiálních látek (Duchesne a kol., 1989; Morin a kol., 1999). Obr. 16. Hyfy houby tvořící mykorhizální struktury v kořeni rosliny. Upraveno podle Diouf a kol. (2003). 9.4 Arbuskulární mykorhizální symbióza vs. fixace molekulového dusíku; ektomykorhiza Houby vystupující v AM symbiotickém vztahu nefixují atmosférický dusík. Nicméně jsou schopny produkovat enzymy jako jsou nitrátreduktáza a glutaminsyntetáza pro příjem dusičnanů a amoniaku (Diouf a kol., 2003). U mnoha rostlin je možné najít i velmi složitý symbiotický vztah např. rostlina Frankia - houba. V tomto vztahu jsou obsaženy dva mutualistické vztahy, které se vzájemně doplňují a jejich výsledkem je fixace N 2 a výměna živin rostlina-houba (Diouf a kol., 2003). Vliv na příjem dusíku z půdy mají houby žijící v ektomykorhitickém vztahu s kořeny vyšších rostlin. Mají na příjem N 2, především ve formě amonných iontů, pozitivní vliv (Charlot a Braun, 1998). 45