THE CONTROL OF TRANSFORMATION EFFICIENCY IN PEA (PISUM SATIVUM L.) KONTROLA ÚČINNOSTI TRANSFORMACE U HRACHU SETÉHO (PISUM SATIVUM L.) Matušková P., Hanáček P., Krejčí P., Reinöhl V., Procházka S. Ústav botaniky a fyziologie rostlin, Agronomická fakulta, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno, Česká republika. E-mail: matuskova.petra@email.cz ABSTRACT Pea plants were considered to be recalcitrant to transformation procedures and therefore the first step for the obtaining of transgenic plants is the optimisation of the transformation procedure. The efficiency of the transformation was evaluated by histochemical and molecular testing of the presence and expression of the reporter gene uida (GUS). The efficiency of used plasmids and strains of Agrobacterium tumefaciens was tested by transformation of tobacco leaf discs. From the published methods, the one using embryonic segments and A. tumefaciens was used. The method is based on the work of SCHROEDER et al. (1993) modified for our laboratory conditions and dry seeds. Transient expression of the uida gene in pea tissues after cocultivation was achieved, however we have not yet succeeded in proving stable incorporation of the transgene in the analysed plants. ABSTRAKT Hrách je považován za obtížně transformovatelný a prvním krokem k získání transgenních rostlin je optimalizace postupu transformace. Účinnost transformačního postupu je vyhodnocována pomocí histochemického a molekulárně biologického testování přítomnosti a exprese reportérového genu uida (GUS). Pro porovnání je dále účinnost použitých plazmidů a kmenů Agrobacterium tumefaciens testována transformací listových disků tabáku. Z metod, které jsou u hrachu popsány jsme se zabývali metodou transgenoze embryonálních řezů pomocí A. tumefaciens. Základem byla metoda autorů Schroeder et al. (1993), modifikovaná pro suchá semena a naše laboratorní podmínky. Bylo dosaženo transientní exprese genu uida v pletivech hrachu ihned po kokultivaci, avšak stabilní včlenění transgenu se v doposud analyzovaných rostlinách nepodařilo prokázat. Klíčová slova: GUS analýzy, hrách, transformace. 1
ÚVOD Hrách setý (Pisum sativum L.) patří do čeledi bobovitých (Fabaceae). Je kulturní plodinou, planá forma není známa. Primární centrum původu je střední Asie a Středomoří. Hrách je jednoletá lysá rostlina s lodyhou chudě větvenou, poléhavou nebo popínavou, listy sudozpeřené s 1-3 jařmy, lístky široce podlouhlé až okrouhle vejčité, palisty srdčité. Květenstvím je 1-3 květý hrozen. Lusky žluté až hnědé, síťnatě žilkované. Odrůdy hrachu jsou typu linií, potomstvo jedné rostliny vzniká opakovaným samoopylením, je homogenní a homozygotní. Hrách obsahuje 14 chromozómů a genom má velikost 4,1 x 10 9 bp. V současné době je hrách hojně šlechtěnou plodinou, přičemž hlavním cílem je zvýšit výnosy suchých semen, odolnost vůči houbovým chorobám, bakteriálním chorobám, virovým chorobám a škůdcům, proti stresovým faktorům (sucho, mráz apod.) a zlepšit kvalitu semen. Klasické metody šlechtění jsou časově velice náročné, a někdy nebyly přirozené zdroje virové rezistence nalezeny, nebo je jejich přenos do cílového genotypu nemožný. V takovém případě se využívají nekonvenční přístupy založené na navození rezistence proti konkrétnímu viru začleňováním jeho genů (nejčastěji gen pro plášťový protein) do vybraného genotypu. To je také cílem projektu NAZV QF 3072 "Tvorba transgenních linií hrachu (Pisum sativum L.) se zvýšenou odolností k virovým patogenům". Hrách je ovšem považován za obtížně transformovatelný a prvním krokem k vytvoření transgenních linií hrachu se zvýšenou odolností vůči virové chorobě je optimalizace postupu transformace. Z metod, které byly u hrachu popsány jsme se zabývali metodou transgenoze embryonálních řezů pomocí Agrobacterium tumefaciens. Pokusy jsme prováděli na odrůdě Cezar. Základem byla metoda autorů Schroeder et al. (1993), modifikovaná pro suchá semena a naše laboratorní podmínky. Protože je transformace hrachu obtížná, použili jsme modelový systém tabákových disků jako kontrolu funkčnosti naší transformační metody. Důkaz transformace byl prováděn histochemickou analýzou exprese GUS a dále molekulárně biologickými metodami byl prováděn důkaz přítomnosti genu GUS a jeho exprese pomocí PCR resp. pomocí RT-PCR a PCR. Transformační postupy Povrchově sterilizovaná semena hrachu byla po dobu 24 hod nabobtnána ve sterilní destilované vodě na třepačce při 160 rpm a pokojové teplotě. Po odstranění testy a jedné z děloh bylo obnažené embryo rozříznuto podélně na poloviny a odstraněna větší část radikuly. Takto získané embryonální řezy byly ponořeny do tekutého média MS1/2 (medium dle Morashige a Skooga, 1962, poloviční koncentrace makro - a mikroprvků a vitamínů). K připraveným explantátům byla přidána agrobakteriální suspenze a řezy v ní byly kokultivovány 45 min na třepačce při 160 rpm. Před kokultivací jsme řezy 30 s sonikovali v ultrazvukové lázni. Poté byly 2
řezy osušeny na sterilním filtračním papíru a přeneseny na tuhé kokultivační medium P1 (MS medium s 2mg.l -1 BAP a NAA) bez antibiotik na dalších 96 hod. Kokultivované explantáty byly opláchnuty v tekutém MS1/2 mediu s přídavkem antibiotik (augmentinu) v koncentraci 500 mg.l -1 a přeneseny na medium P1 doplněné antibiotiky. Na tomto mediu docházelo k regeneraci prýtků, které byly odřezávány ve velikosti ca. 10 mm a dále kultivovány. Transformace tabákových disků byla prováděna dle standardního protokolu. Tabákové disky nařezané pomocí korkovrtu se sterilizují v 15% roztoku Sava a 96% etanolem. Korkovrtem vytvořené a sterilizované tabákové disky byly ponořeny na 5min. do bakteriální suspenze a poté přeneseny na medium MS medium bez augmentinu a phosphinotricinu. Disky byly ponechány na misce tři dny za difúzního osvětlení v kultivační místnosti a poté přepasážovány na misky s augmentinem a phosphinotricinem. Na takto připraveném selekčním mediu se disky ponechávaly 14 dní a poté byly přepasážovány na čerstvé selekční medium. Tento postup se opakoval až do vytvoření nové tabákové rostlinky. Histochemický důkaz transformace Jako důkaz přenosu a integrace transgenu do buněk hrachu bylo použito histochemické analýzy GUS. Vnesený markerový gen GUS kóduje enzym ß- glukuronidázu, který odštěpuje ze substrátu X- Gluc glukuronid při inkubaci v 37 C po dobu 24 hod a v přítomnosti katalyzátoru vzniká tmavě modrá sloučenina, kterou následně detekujeme pod mikroskopem. Reakční směs obsahovala 0,1M NaPO 4 pufr, ph 7; 0,5 M ferri- a ferrokyanid draselný a 10 mm Na 2 EDTA, ph 7; 0,1% Triton X-100 a substrát 1 mm X-Gluc. Drobné sektory modrých buněk byly nalezeny na půlených embryích hrachu ihned po kokultivaci a nebyly nalezeny na listech regenerovaných prýtků. Největší zastoupení modrých sektorů u tabákových disků bylo zaznamenáno u listové žilnatiny a okrajů listové plochy a také na listech regenerovaných rostlin tabáku. Molekulární důkaz transformace Přítomnost GUS genu byla sledována pomocí PCR ve vzorcích izolované DNA a jeho exprese pomocí RT-PCR a specifické PCR u vzorků RNA. Izolace DNA a RNA byla provedena ze vzorků embryonálních segmentů hrachu a listových disků tabáku ihned po kokultivaci a z regenerovaných prýtků hrachu resp. rostlin tabáku. Izolace DNA a RNA byla provedena pomocí DNeasy a RNeasy Plant Mini Kit firmy Qiagen podle instrukcí popsaných v návodu k produktům za použití originálních roztoků. 3
Izolace DNA Přibližně 100 mg odebraných explantátů bylo zamrazeno v mikrozkumavce Eppendorf (1,5 ml) kapalným dusíkem a pomocí špičky pro mikropipety se zataveným koncem byl vzorek rozdrcen na prášek. K homogenátu bylo přidáno 400 µl pufru AP1 a 4 µl zásobního roztoku RNAsy A. Směs byla inkubována po dobu 10 min při 65 C a během inkubace byla směs několikrát promíchána. Dále bylo přidáno 130 µl pufru AP2, promícháno a inkubováno 5 min při 0 C. Lyzát byl přemístěn do QIA shredder spin kolony v mikrozkumavce 2 ml a centrifugován 2 min při 14000 rpm. Kapalná frakce byla přenesena do nové mikrozkumavky, byla přidána polovina objemu pufru AP3 a doplněna 96% etanolem. Směs byla jemně promíchána. 650 µl směsi bylo aplikováno do DNeasy mini spin kolony v mikrozkumavce 2 ml a centrifugováno 1 min při 6000 rpm. Kapalná frakce byla odstraněna a směs byla aplikována až do jejího vyčerpání. Poté bylo do kolony naneseno 500 µl pufru AW a centrifugováno 2 min při 14000 rpm. DNeasy kolona byla přemístěna do čisté mikrozkumavky, bylo do ní aplikováno 100 µl předehřátého pufru AE, poté byla ponechána 5 min inkubovat při laboratorní teplotě a nakonec byla centrifugována 1 min při 6000 rpm. Tento krok byl proveden ještě jednou, čímž byly získány 2 frakce izolované DNA. Supernatant byl skladován při 4 C. Izolace RNA 50-100 mg vzorku bylo zamrazeno v mikrozkumavce Eppendorf (1,5 ml) kapalným dusíkem a pomocí špičky pro mikropipety se zataveným koncem bylo homogenizováno. K homogenátu bylo přidáno 450 µl pufru RLT. Směs byla inkubována po dobu 5 min při 56 C a během inkubace byla několikrát zvortexována. Lyzát byl přemístěn do QIA shredder spin kolony v mikrozkumavce 2 ml a centrifugován 2 min při maximálních otáčkách. Kapalná frakce (supernatant) byla převedena do nové mikrozkumavky a bylo přidáno polovina objemu 96% etanolu. Směs byla jemně promíchána. 650 µl směsi bylo aplikováno do RNeasy minikolony v mikrozkumavce 2 ml centrifugováno 15 s při 8000 rpm. Kapalná frakce byla odstraněna. Poté bylo do kolony naneseno 700 µl pufru RW1 a centrifugováno 15 s při 8000 rpm. RNeasy kolony byla přemístěna do čisté mikrozkumavky, bylo do ní aplikováno 500 µl pufru RPE a centrifugována 15 s při 8000 rpm. Tento krok byl proveden ještě jednou pro eliminace etanolu s pufru RPE (centrifugace 2 min). RNeasy kolona byla přemístěna do čisté mikrozkumavky, bylo do ní aplikováno 25 µl redestilované vody prosté RNAs a centrifugována 5 min při maximálních otáčkách. Pro zvýšení výtěžku RNA byl tento krok ještě jednou zopakován. Celkový objem RNA rozpuštěné ve vodě byl 50 µl. Koncentrace RNA byla stanovena spektrofotometricky: 2 µl roztoku RNA bylo aplikováno do 198 µl redestilované vody prosté RNAs v kyvetě a byla změřena absorbance při vlnové délce 260 nm. Koncentrace byla přepočtena podle vztahu A 260 = 1~ 40 µg.ml -1 RNA. 4
Čištění RNA Získaný vzorek RNA byl doplněn na objem 100 µl redestilovanou vodou prostupu RNAs. K tomuto objemu bylo přidáno 350 µl RLT pufru a směs byla jemně promíchána. Ke směsi bylo přidáno 250 µl 96% ethanolu a směs byla opatrně promíchána. Vzorek (700 µl) byl aplikován do RNeasy minikolony v mikrozkumavce 2 ml a centrifugován 15 s při 8000 rpm. Kapalná frakce byla odstraněna. Poté bylo do kolony napipetováno 350 µl pufru RW1 a centrifugováno 15 s při 8000rpm. Kapalná frakce byla odstraněna. K 70 µl pufru RDD bylo přidáno 10 µl roztoku DNAse 1 a směs v uzavřené mikrozkumavce byla promíchána. Tato inkubační směs byla aplikovány přímo RNeasy kolonu a ponechána 15 min při pokojové teplotě. Na RNeasy kolonu bylo poté aplikováno 350 µl pufru RW1, byla centrifugována 15 s při 8000 rpm. Supernatant byl odstraněn. RNeasy kolona byla přemístěna do čisté mikrozkumavky, bylo do ní aplikováno 500 µl pufru RPE a byla centrifugována 15 s při 8000 rpm. Tento krok byl proveden ještě jednou pro eliminaci etanolu z pufru RPE (centrifugace 2 min). RNeasy kolona byla přemístěna do čisté mikrozkumavky 1,5 ml, bylo do ní aplikováno 25 µl redestilované vody prosté RNAs a byla centrifugována 5 min při maximálních otáčkách. pro zvýšení výtěžku RNA byl tento krok zopakován. Celkový objem RNA rozpuštěné ve vodě byl 50 µl. Metoda dvoukrokové reverzní PCR Ze vzorku RNA získaného izolací z kokultivovaných segmentů byla cdna syntetizována s použitím Enhanced Avian RT- PCR Kit firmy Sigma. Do 200 µl mikrocentrifugačních zkumavek bylo napipetováno 8 µl RNA templátu (tabák) nebo1 µl RNA templátu (ostatní vzorky), 1 µl směsi deoxynukleotidů (dntpmix) a 1 µl oligo (dt) 23, směs byla doplněna vodou na celkový objem 10 µl. Rychlou centrifugací bylo zabráněno ulpívání směsi na stěnách zkumavky. Zkumavky byly přeneseny do termocykleru a ponechány 10 min při 70 C. Zkumavky byly poté uloženy na ledu a bylo do nich přidáno 6 µl vody, 2 µl pufru pro AMV- RT (10x koncentrovaný), 1 µl inhibitoru RNAsy a 1 µl Enhanced Avian RT. Zkumavky byly přemístěny do termocykleru na 50 min při 45 C. Získaná cdna byla dále připravena pro PCR reakce (druhý krok dvoukrokové RT-PCR). Metoda PCR PCR analýza DNA a cdna genu uida byla provedena s použítím primeru Gusint 1 (5 - GAT CGC GAA AAC TGT GGA AT) a Gusint 2 (5 - TCT GCC AGT TCA GTT CGT TG), lokalizovaných před a za intronem. Ve všech PCR reakcích byla jako pozitivní kontrola použita bakteriální DNA a DNA listů transgenního tabáku. PCR reakční směs pro amplifikaci DNA fragmentů obsahovala 20 µg templátové DNA nebo cdna, jednu jednotku Red Tag polymerázy a jedenkrát koncentrovaný Red Tag pufr (5 µl), 3 µm primerů, 200 µm od každého 5
dntps, 1,5 mm MgCl 2, do 25 µl bylo doplněno vodou. Amplifikace byla provedena pomocí termocykleru Techne Genius s následujícím programem: 1 cyklus: 3min při 94 C, 30s 56,5 C, 30s 72 C 35 cyklů: 30s 94 C, 30s 56,5 C, 30s 72 C Amplifikované fragmenty byly rozděleny na 1% agarozovém gelu a vizualizovány pomocí ethidiumbromidu. Obr. 1: Výsledky analýzy cdna (1, 8 100 Kb DNA Ladder; 2, 3 vzorky cdna hrachu; 4 cdna tabáku; 5 DNA plazmidu pgt89; 6 DNA netransformovaného hrachu; 7 - kontrola bez DNA) 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 8 V případě analýzy DNA byla ve všech vzorcích odebraných ihned po kokultivaci dokázána přítomnost genu uida, analýzou cdna byla opět ověřena přítomnost genu uida ve vzorcích; vzorky 2-4 (obrázek 1) prokazují expresi tohoto genu. Další testování bylo provedeno na prýtech hrachu přežívajících selekci, avšak přenos transgenu do pletiv prýtů ani následně zakořeněných a dopěstovaných rostlin nebyl na testovaných vzorcích prokázán na rozdíl od regenerovaných rostlin tabáku. ZÁVĚR Byla otestována a zavedena metoda transformace listových disků tabáku jako kontrola pro optimalizaci transformace hrachu a byly zavedeny histochemické a molekulární metody testování přenosu transgenu. Pomocí těchto metod byla prokázána transformace rostlin tabáku a zatím pouze transientní exprese reportérového genu GUS u hrachu. POUŽITÁ LITERATURA SCHROEDER H.E., SCHOTZ A.H., WARDLEY-RICHARDSON T., SPENCER D., HIGGINS T.J.V. (1993): Transformation and Regeneration of Two Cultivars of Pea (Pisum sativum L.). Plant Physiol 101: 751-757. 6