Teoretický úvod: MINERÁLNÍ VÝŽIVA Praktikum fyziologie rostlin 1
Teoretický úvod: MINERÁLNÍ VÝŽIVA Vedle prvk, které tvoí organické látky C, H a O funkní struktury rostlin obsahují adu dalších prvk, které se v pírod vyskytují pedevším ve sloueninách anorganických (nerostných, minerálních). Termín minerální výživa zahrnuje píjem nezbytných anorganických prvk do rostliny, jejich transport na funkní místo a vestavní do struktur nebo vstup do metabolických pochod. Dle množství v sušin rostliny jsou tyto esenciální (nezbytné, nezastupitelné, nenahraditelné) anorganické prvky oznaovány jako makro- nebo mikroelementy. Makroelementy - N, P, K, Ca, Mg, S jsou v 1 kg sušiny obsaženy v množství vtším než 1 000 mg (1 g) Mikroelementy - Fe, Mn, Zn, Cu, Cl, B, Mo jsou v 1 kg sušiny zastoupeny v množství menším než 100 mg (0,1 g). Nedostatek esenciálních minerálních látek psobí zpomalení až zastavení rstu, poruchy vývoje, asto se projeví specifickými zmnami tvaru nebo barvy, zasycháním a nekrózami pletiv. Projevy deficience (deficienní syndrom) jsou pro jednotlivé prvky charakteristické, rzné rostliny jsou však k nedostatku jednotlivých prvk rzn citlivé. Nedostatek kteréhokoli z esenciálních prvk je pro existenci rostliny limitující. Nepízniv psobí také nadbytek živin, v krajním pípad hovoíme o toxicit. Vztah mezi rychlostí fyziologického procesu a dostupnosti konkrétní živiny demonstruje obr. 1. Obr. 1. Závislost rychlosti fyziologického procesu na dostupnosti živiny (pevzato z Procházka et al. 1998) 2
Píjem živin se realizuje pedevším koeny, v menší míe také listy (nap. pi aplikaci hnojiva na list). K povrchu koene se ionty živin dostávají temi mechanismy difusí, hromadným tokem s pohybem vody a intercepcí prorstáním koene do oblastí substrátu, kde ješt nejsou živiny vyerpány (obr. 2). Dostupnost každé živiny ovlivuje míra její sorpce v pdním komplexu nejdležitjšími jsou chemická sorpce (tvorba slouenin o rzné rozpustnosti) a fyzikáln-chemická sorpce na povrchu pdních koloid. Pdní koloidy jsou jílové nebo organické ástice s velkým specifickým povrchem (10-800 m 2 g -1 ), které nesou na svém povrchu náboje a reverzibiln poutají ionty ve svém okolí (obr. 3). Obr. 2. Mechanismy písunu živin k povrchu koene (pevzato z Brady a Weil 2002) Obr. 3. Pdní koloidy kaolinit (zástupce kemiitanových jíl) a mechanismus výmny iont na povrchu koloidních ástic pevzato z Brady a Weil 2002 (levý obr.) a Taiz a Zeiger 2002 (pravý obr.) Pro píjem živin jsou dležité koenové vlásky zvtšují povrch koene, pronikají do malých pdních pór a zajišují kontakt s pdními ásticemi. Koenový systém navíc reaguje na dostupnost živin v prostedí mní svoji morfologii (rychlost rstu jednotlivých koen a intenzitu vtvení) s cílem optimáln využít nehomogenní nabídku živin v pdním horizontu. 3
Význam jednotlivých živin Dusík je pijímán z pdy jako ionty NO 3 - nebo NH 4 + nebo v aminokyselinách. V rostlin je dusík obsažen v proteinových i neproteinových aminokyselinách. Proteinové aminokyseliny tvoí proteiny s funkcí enzymatickou, strukturních nebo regulaní, neproteinové aminokyseliny jsou výchozími substráty pro syntézu dalších látek, nap. kyselina 5- aminolevulová je substrátem pro syntézu látek obsahujících pyrolové jádro, tj. chlorofyl a cytochrom. Dusík je obsažen v purinových a pyrimidinových bazích nukleových kyselin a v ad dalších látek primárního i sekundárního metabolismu. Nedostatek dusíku ovlivuje adu dležitých fyziologických pochod vetn asimilace CO 2 a projevuje se inhibicí rstu i vývoje rostliny. nedostatku Pi dusíku rostlina investuje do rozvoje koenového systému na úkor nadzemní ásti Obr. 4. Rst prýtu a koen v závislosti na dostupnosti N v prostedí pevzato z Marschner 1995 snaha o zajištní dostateného písunu limitující živiny. Fosfor je pijímán z pdy ve form fosfátového aniontu, který se zabudovává pímo do organických slouenin. V rostlin je fosfát souástí látek s vysokým obsahem energie - ATP, UTP, GPT, CPT a TTP. Tyto sloueniny slouží k syntéze nukleových kyselin nebo reagují s množstvím dalších molekul, jejichž vnitní energie se tím zvyšuje a je tak umožnn jejich vstup do dalších metabolických proces (nap. fosforylace kyseliny 3-fosfoglycerové na 1,3- bisfosfoglycerovou ped redukcí na 3-P-glyceraldehyd, vznik UDP-glukózy pro tvorbu celulózy, ADP-glukózy pro vznik škrobu, CDP-fosfatidátu pro vznik membránových fosfolipid). Vedle zmn vnitní energie molekula navázáním fosfátu získává záporný náboj. U protein fosforylace mní jejich konformaci, která ovlivuje jejich funkní vlastnosti, nap. propustnost akvaporinových kanál, enzymatickou aktivitu (místo navázání fosfátu uruje funkci kináz dependentních na cyklinech v prbhu bunného cyklu) nebo lokalizaci v buce (transport fytochromu z cytosolu do jádra a penos signálu). Fosforylaní kaskády jsou dležité pi penosu signál. Strukturn je fosfát vázán v nukleových kyselinách a ve 4
fosfolipidech membrán. V semenech je fosfát uložen ve form kyseliny fytové, substituované vápníkem a hoíkem. Fosforylovaný inositol hraje významnou roli pi penosu signálu. Draslík je pijímán ve form K + a neváže se do stabilních struktur. Hraje dležitou úlohu v osmotických pomrech buky a pi objemovém rstu buky. Ovlivuje aktivitu nkterých enzym, které katalyzují reakce fotosyntetické a respiraní. Draslík je v rostlin velmi pohyblivý a jeho deficience se projevuje pedevším na starších ástech rostliny. Vápník je pijímán jako dvoumocný kation, strukturn je vázán v bunné stn a stední lamele pedevším s pektiny. V membránách ovlivuje soudržnost fosfolipid a schopnost membrán vázat proteiny. Koncentrace vápníku v cytosolu je udržována velmi nízká (asi 0,2 M), v bunné stn je hladina Ca 2+ asi 1000M, v endoplazmatickém retikulu asi 10M. Ve vakuole, kde je koncentrace Ca 2+ 100 až 1000 M, mže tvoit s anionty organických i anorganických kyselin nerozpustné soli. V cytosolu se vápník reverzibiln váže s polypeptidem kalmodulinem a výrazn ovlivuje aktivitu enzym. Zmna jeho koncentrace v cytosolu tak navozuje metabolické zmny, které jsou souástí penosu signálu. V tchto procesech vápník funguje jako tzv. druhý posel. Hoík je pijímán jako dvoumocný kation a v této podob je distribuován po rostlin. Strukturn je vázán v chlorofylu (Obr. 5.), kde hraje dležitou úlohu pi interakci se strukturními proteiny anténních komplex. Ovlivuje aktivitu nkterých enzym, nap. Rubisco. Obr. 5. Vazba Mg v chlorofylu pevzato z Buchanan et al. 2000 Síra je pijímána ve form síranového aniontu SO 2-4, je redukována a zabudovávána do aminokyselin cysteinu a methioninu. Výrazn ovlivuje konformaci protein a umožuje navázání dalších ligand (vazba chromoforu s proteinem ve fytochromu). V kombinaci s železem tvoí tzv. Fe-S centra, struktury dležité pro penos elektronu pi fotosyntéze v cytochromovém komplexu a ve fotosystému I a v dýchacím etzci. Je dležitou složkou nkterých koenzym koenzymu A, thiaminu a biotinu. Železo je pijímáno snáze jako Fe 2+, v pd se však asto vyskytuje jako Fe 3+. Mechanismus využití trojmocného železa je odlišný u trav oproti ostatním rostlinám. Rostliny dvoudložné a jednodložné netravního typu redukují Fe 3+ cheláty pítomné v rhizosfée a uvolují Fe 2+ pro píjem do cytosolu (Obr. 6 vpravo). Trávy vyluují fytosiderofory - specifické 5
neproteinogenní aminokyseliny, které váží Fe 3+. Komplex fytosiderofor-fe 3+ je následn pijímán do rostliny a v cytoplazm je Fe uvolnno (Obr. 6 vlevo). Také Mn, Cu a Zn jsou pijímány v chelátové form. Obr. 6. Mechanismus píjmu Fe u trav (vlevo) a ostatních rostlin (vpravo) pevzato z Buchanan et al. 2000 Mangan je dležitou složkou proteinového komplexu rozkládajícího vodu (OEC), který je asociován s fotosystémem II. M je dležitá složka struktur penášejících elektron, nap. plastocyaninu v primární fázi fotosyntézy nebo v cytochromoxidázovém komplexu v elektrontransportním etzci pi dýchání. Zinek je dležitou strukturní složkou ady enzym a transkripních faktor, tzv. zinkové prsty. Chlór hraje dležitou roli v osmotických pomrech buky a stabilizuje komplex rozkládající vodu ve fotosyntetickém aparátu. Bór je nezbytný pro syntézu nukleových kyselin a rst pylových láek. Pijímán je jako H 3 BO 3. Molybden je pijímán jako anion MoO 2-4. Je vázán v enzymech, nap. v nitrátreduktáze. Hodnocení rstu Rst je dynamický proces probíhající v ase, proto se jeho parametry sledují bhem uritého období. Sledují-li se 2 nebo více soubor, lze provést srovnání ve stejném ase. Jako kriterium rstu se nejastji užívá suchá hmotnost = sušina = hmotnost dehydratovaného materiálu, tj. vysušeného do konstantní hmotnosti pi 105 C. erstvá hmotnost je mén spolehlivé kriterium rstu. Velmi dležité je, aby byl materiál po odebrání vážen co nejdíve a aby u všech srovnávaných variant byly dodrženy stejné 6
podmínky a stejný postup. Z rozdílu erstvé a suché hmotnosti pak lze stanovit obsah vody v materiálu (hydrataci), který se obvykle vyjaduje v % erstvé hmotnosti. Dalšími používanými kriterii rstu jsou délka nebo plocha orgánu. Literatura: Brady, N.C. and Weil, R. R. The Nature and Properties of Soils. Prentice Hall. 2002 Buchanan, B., Gruissem, W. and Jones, R. (Eds.) - Biochemistry and Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologist. 2000. Marschner, H. - Mineral Nutrition of Higher Plants. Academic Press. London. UK. 1995 Procházka a kol. Fyziologie rostlin. Academia Praha 1998 (kapitola Vodní provoz, autor J. Šantrek) Taiz, L. and Zeiger, E. Plant Physiology. Sinauer Associates, Inc., Publichers. 2002. 7
Zadání praktických úloh k tématu: MINERÁLNÍ VÝŽIVA Pehled úloh k vypracování: Úkol 1: Vizuální projevy nedostatku živin 1a) Pomocí powerpointového klíe identifikujte minerální živinu, která je v nedostatku 1b) Provete biometrickou analýzu rostlin, které byly kultivovány v neúplných živných roztocích 1c) Pomocí analýzy obrazu charakterizujte koenový systém rostlin kultivovaných v plném živném roztoku a roztoku N-deficientním 8
Úkol 1: Vizuální projevy nedostatku živin (deficienní syndrom) Cíl: Demonstrovat význam jednotlivých živin pro rst rostlin. Hypotéza, kterou bhem práce ovíme: Nedostatek urité živiny má charakteristický vizuální projev, který souvisí s významem (funkcemi) dané živiny v rostlin i možnostmi její retranslokace v rámci rostlinného tla. Dílí úlohy: 1a) Pomocí powerpointového klíe identifikujte minerální živinu, která je v nedostatku 1b) Provete biometrickou analýzu rostlin, které byly kultivovány v neúplných živných roztocích 1c) Pomocí analýzy obrazu charakterizujte koenový systém rostlin kultivovaných v plném živném roztoku a roztoku N- deficientním Princip: Rostlina potebuje pro svj optimální rozvoj dostatek všech esenciálních prvk (makro- i mikroelement). Její rst je proto vždy limitován tou živinou, které je v prostedí nejmén (zákon minima). Pi nedostatku se rozvíjí syndrom deficience, soubor vizuálních znak (nap. snížená rychlost rstu, morfologické odlišnosti, barevné zmny, zasychání list), charakteristický pro každou živinu v závislosti na jejích funkcích v rostlin a možnostem recyklace v rámci rostlinného tla. Vhodnou metodou pro navození a studium deficience je kultivace rostlin v živném roztoku, postrádajícím nkterý z esenciálních prvk. V tomto pípad byly rostliny kultivovány v živném roztoku Hoagland 3. Tento roztok anorganických solí je koncipován tak, aby svým složením poskytoval rostlinám všechny nejdležitjší esenciální prvky v pimeném množství. Jeden prvek však byl vždy vynechán a rostlina vystavena jeho nedostatku. 9
Laboratorní postup: Poteby pro úlohy 1a-c: rostliny kukuice kultivované v kompletním živném roztoku rostliny kukuice kultivované v neúplných živných roztocích powerpointový klí k urování deficiencí nžky mítko laboratorní váhy váženky nebo alobal skener program pro analýzu obrazu NIS Elements s modulem pro zpracování koenového systému (RootAnalyzator) 0,1% roztok agaru pinzeta program Excel Úloha 1a) Pomocí powerpointového klíe identifikujte minerální živinu, která je v nedostatku Provedení úlohy 1a): V nádobách jsou pipraveny rostliny kultivované v kompletním živném roztoku (kontrolní rostliny) a rostliny deficientní. Rostlinný materiál si dobe prohlédnte a pro každý soubor rostlin urete pomocí powerpointového klíe, která živina je v nedostatku. Zaznamenejte všechny vizuální projevy nedostatku (vzrst, morfologie, barva list, zasychání). Všímejte si, která ást rostliny je nejvíce ovlivnna a zkuste vysvtlit pro. Vše zaznamenejte do protokol. Úloha 1b) Provete biometrickou analýzu rostlin, které byly kultivovány v neúplných živných roztocích Provedení úlohy 1b): 1. Provete detailní analýzu rostlinného materiálu v jednotlivých variantách. U každé rostliny stanovte následující charakteristiky: délka prýtu (nadzemní ásti rostliny) - mte mítkem od obilky ke špice nejdelšího listu délka koenového systému - mte mítkem od obilky ke špice nejdelšího koene erstvá hmotnost prýtu erstvá hmotnost koen 2. Hmotnost prýtu a koen použijte pro výpoet celkové erstvé hmotnosti rostliny a pomru R/S (z anglického root/shoot), tj. pomru hmotnosti koen a nadzemní ásti. 3. Délkové parametry, celkovou hmotnost rostliny a R/S pomr zaznamenejte do tabulky 1, pomocí programu Excel vypoítejte prmrné hodnoty a smrodatné odchylky. Výsledky vyjádete graficky. 10
U všech sledovaných parametr najdte statisticky významné rozdíly pomocí programu NCSS nebo jiného statistického programu. Statisticky významné hodnoty zaznamenejte do graf. Tab. 1. Biometrické charakteristiky rostlin délka prýtu (cm) rostlina 1 rostlina 2 rostlina 3 rostlina 4 rostlina 5 prmr smrodatná odchylka kontrola -N -P -Ca -Mg -K - Fe délka koenového systému (cm) rostlina 1 rostlina 2 rostlina 3 rostlina 4 rostlina 5 prmr smrodatná odchylka kontrola -N -P -Ca -Mg -K - Fe celková erstvá hmotnost rostliny (g) rostlina 1 rostlina 2 rostlina 3 rostlina 4 rostlina 5 prmr smrodatná odchylka kontrola -N -P -Ca -Mg -K - Fe pomr hmotnosti koen a nadzemní biomasy rostlina 1 rostlina 2 rostlina 3 rostlina 4 rostlina 5 prmr smrodatná odchylka kontrola -N -P -Ca -Mg -K - Fe 11
Úloha 1c) Pomocí analýzy obrazu charakterizujte koenový systém rostlin kultivovaných v plném živném roztoku a roztoku N- deficientním Provedení úlohy 1c): 1. Pro analýzu použijte koeny rostlin z úlohy 2a. 2. Koeny naskenujte pomocí skeneru, který byl speciáln upraven pro metodu snímání ve vodním sloupci. Jako medium použijte 0,1% agar, který umožní lepší rozprostení koen díky vtší hustot. Koenový systém peliv rozprostete, minimalizujete tak kížení koen a obtížnost následného vyhodnocení analýzou obrazu. 3. Získaný obrázek analyzujte v programu Lucia G s modulem RootAnalyzator. Postupujte podle piloženého návodu. Získaná data exportujte do programu Excel. Ze získaných dat vyhodnote následující parametry: celkovou délku koenového systému délku osy hlavního koene poet postranních koen 1. ádu a 2. ádu Urením tchto parametr získáte pedstavu o uspoádání koenového systému v závislosti na podmínkách kultivace. V protokolech vyhodnote, zda rostlina preferovala spíše délkový rst hlavního koene nebo rozvoj laterálních (postranních) koen. Vyhodnocení experimentu: Vypracujte protokol, ve kterém vyhodnotíte získaná data. Zamyslete se nad vztahem mezi dostupností živin a morfologií rostliny. Zkuste odpovdt na následující otázky: O em vypovídá zmna R/S pomru rostliny? Pro je pro rostliny výhodné zvýšit R/S pomr pi nedostatku dusíku? Jaké to má dsledky pro pežívání rostliny v mnících se podmínkách prostedí? 12