KLINICKÁ HEMATOLOGIE PLAZŮ A PTÁKŮ MVDr. Zora Knotková, CSc. MVDr. Anna Musilová Prof. MVDr. Zdeněk Knotek, CSc. MVDr. Viktor Tukač, CSc. MVDr. Ladislav Taras, Ph.D. Klinika chorob ptáků, plazů a drobných savců FVL, VFU Brno
VÝZNAM HEMATOLOGICKÉHO VYŠETŘENÍ Upřesnění diagnózy Sledování zdravotního stavu pacienta Ověření účinnosti terapeutického postupu
HEMATOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ Rutinní hematologické vyšetření zahrnuje tyto parametry: Hematokrit (Hb) Koncentrace hemoglobinu (Hb) Počet erytrocytů (Ery) Erytrocytární indexy (MCV, MCH, MCHC) Celkový počet leukocytů (Leu) Diferenciální rozpočet leukocytů (leukogram) Zhodnocení morfologie krevních buněk
PREANALYTICKÁ FÁZE V této první fázi je nutné: Připravit pacienta a odběrový materiál Odebrat vzorek krve Přepravit vzorek a uchovat ho před analýzou Tato fáze zodpovídá z více než 50 % za správnost výsledků
ODBĚR KRVE 0,2 ml dostatečné pro kompletní hemogram 1,0 ml/100 g tělesné váhy je obvykle bezpečný objem pro zdravé ptáky i plazy méně u pacientů s klinickými příznaky onemocnění a příznaky dehydratace pozor na iatrogenní ztrátu krve při vzniku hematomu po odběru
ODBĚR KRVE Odběr krve by měl být proveden bezpečně a rychle. Většina ptáků, zvláště nemocní jedinci a malé druhy (např. kanáři), je při manipulaci snadno stresována. Stres spojený s odchytem a fixací pacienta může dále zhoršit jeho zdravotní stav a ovlivnit hematologické parametry.
ANTIKOAGULANTY Hematologické vyšetření by mělo být provedeno co nejdříve po odběru krve jinak mohou vznikat artefakty, jako zvýšené shlukování leukocytů a trombocytů a změny v morfologii krevních buněk EDTA (kyselina ethylendiaminotetraoctová) - nejpoužívanější antikoagulant pro hematologické vyšetření, zejména u savců - 1,5 mg/ml krve HEPARIN (lithium heparin) výhodný u ptáků a plazů - možnost použití plné krve pro hematologické vyšetření a zároveň plazmy pro biochemické vyšetření - 25 m.j./l krve
ANALYTICKÁ FÁZE Tato druhá fáze zahrnuje: přípravu vzorku analýzu vzorku Rozdíly v morfologii ptačích a plazích krevních buněk vyžadují modifikaci laboratorních technik oproti hematologickému vyšetření savců nutnost využití manuálních metod.
Počet erytrocytů (Ery, 10 12 /l) Počet leukocytů (Leu, 10 9 /l) Manuální metoda 4975 µl Natt-Herrickova roztoku + 25 µl krve (ředění 1:200) Bürkerova komůrka Ery: 20 obdélníků (1/100 mm 2 ) Leu: 50 čtverců (1/25 mm 2 )
HEMATOKRIT (Ht) Hematokrit centrifugace krve v heparinizované mikro-hematokritové kapiláře, 5 minut u ptáků, 6 minut u plazů Vzniknou 3 vrstvy: Sloupec plazmy - navrchu kapiláry obvykle bezbarvý; u některých ptačích druhů žlutý až oranžový (karotenoidní pigmenty); zelená plazma upozorňuje na možnou biliverdinémii Erytrocyty spodní část kapiláry Buffy coat - malý bílý proužek nad sloupcem erytrocytů skládá se z leukocytů a trombocytů. Obvykle výraznější při leukocytóze
KONCENTRACE HEMOGLOBINU (g/l) Celková koncentrace hemoglobinu je obvykle zjišťována použitím standardní hemiglobinkyanidové metody: 5 ml Drabkinova roztoku + 20 µl krve U ptáků a plazů nutná centrifugace po rozpadu červených krvinek (1000 g, 10 min) Spektrofotometrická analýza cyanmethemoglobinu při 540 nm
ERYTROCYTÁRNÍ INDEXY Výpočet z Ht, Hb, Ery Morfologická klasifikace anémií MCV (mean cell volume, fl) = Ht (l/l) 1000 / Ery (10 12 /l) MCH (mean cell hemoglobin, pg) = hemoglobin (g/l) / Ery (10 12 /l) MCHC (mean cell hemoglobin concentration, g/l) = hemoglobin (g/l) / Ht (l/l)
DIFERENCIÁLNÍ ROZPOČET LEUKOCYTŮ Příprava krevního nátěru Bez antikoagulantu přímo ze stříkačky okamžitě po odběru Technika nátěru sklíčko se zkosenými hranami!
DIFERENCIÁLNÍ ROZPOČET LEUKOCYTŮ (10 9 /l) Barvení krevního nátěru Barviva: May-Grünwald/Giemsa- Romanowski, Wright-Giemsa Rychlé barvicí metody: Diff-Quick, Hemacolor
DIFERENCIÁLNÍ ROZPOČET LEUKOCYTŮ Doporučený postup pro hodnocení krevního nátěru: Posouzení nejméně 100 leukocytů při meandrovitém vyhledávání leukocytů od střední po koncovou třetinu nátěru Vyjádření každého typu v procentech (%) Výpočet absolutního počtu pro každý typ
POSTANALYTICKÁ FÁZE Tato fáze je založena na správné interpretaci získaných výsledků (ve vztahu k referenčním hodnotám, ostatním laboratorním parametrům, klinickému nálezu) Vnitřní a vnější faktory ovlivňující hemogram (věk, pohlaví, okolní prostředí a sezóna, zvířata volně žijící x v zajetí, stres, kontaminace vzorku krve lymfou)
HEMATOKRIT INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Ptáci Ht = 35 55 % Ht < 32 % anémie Ht > 58 % dehydratace, erytrocytóza Plazi Ht = 20 40 % Iguana iguana = 30 49 % Testudo Spp. = 23 37 % Boa constrictor = 26 40 %
HEMOGLOBIN, MCV INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Ptáci Hb = 100 180 g/l Plazi Hb = 45 120 g/l Iguana iguana = 80 120 g/l Testudo Spp. = 45 100 g/l Boa constrictor = 60 120 g/l
ERYTROCYTY Morfologie Zralé erytrocyty ptáků a plazů mají vzhled zploštělých, oválných buněk s oválným, centrálně umístěným jádrem Ptáci MCV = 120-200 fl životnost Ery = 28 35 dní Plazi MCV = 250 400 fl životnost Ery = 600 800 dní
ERYTROCYTY INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Ptáci Ery = 2,00 4,50.10 12 /l Polychromatofilní Ery = 1 5 % (normální u zdravých ptáků) Ptáci s anémií Polychromatofilní ERY 5 % střední regenerativní odpověď Polychromatofilní ERY 10 % výrazná regenerativní odpověď
ERYTROCYTY INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Plazi Iguana iguana ERY = 0,71 2,71.10 12 /l Testudo Spp. ERY = 0,23 1,12.10 12 /l Boa constrictor ERY = 0,16 1,80.10 12 /l
MORFOLOGICKÁ KLASIFIKACE ANÉMIÍ Ery index MCH normální MCH snížený MCV normální normocytární normocytární normochromní hypochromní MCV zvýšený makrocytární makrocytární normochromní hypochromní MCV snížený mikrocytární mikrocytární normochromní hypochromní
ANÉMIE Hemoragická anémie krevní ztráty Hemolytická anémie zvýšený rozpad červených krvinek Depresní anémie snížená produkce červených krvinek (poškození kostní dřeně)
HEMORAGICKÁ ANÉMIE Nejčastější příčiny tohoto typu anémie: úraz s krvácením krev sající parazité (klíšťata, roztoči, kokcidie) koagulopatie (aflatoxikóza, otrava kumariny, těžké jaterní onemocnění jako např. papovavirus) Krvácení z vnitřních orgánů (ulcerované neoplazie, žaludeční vředy, ruptura jater nebo sleziny)
HEMOLYTICKÁ ANÉMIE Tento typ anémie může vzniknout z: parazitémie (krevní parazité) bakteriální septikémie (salmonelóza, spirochetóza) otravy (aflatoxiny, určité chemické látky např. ropné produkty)
DEPRESNÍ ANÉMIE Nejobvyklejší příčiny tohoto typu anémie jsou: tuberkulóza, chlamydióza, aspergilóza chronické hepatopatie chronické nefropatie nedostatek železa, nedostatek vit. B 12 neoplazie
LEUKOCYTY Morfologie Ptáci Leukocyty v ptačí krvi zahrnují lymfocyty, monocyty a granulocyty. Granulocyty jsou dále děleny na heterofily, eozinofily a bazofily. Leukogram Lymfocyty 25 45 % Heterofily 45 75 % Eozinofily 0 2 % Bazofily 0 1 % Monocyty 0 3 %
LEUKOCYTY Morfologie Plazi V periferní krvi plazů posuzujeme v rámci diferenciálního rozpočtu heterofilní, bazofilní a eozinofilní granulocyty, lymfocyty, monocyty a azurofily.
LEUKOCYTY Interpretace výsledků Ptáci Leu = 3,50 15,00.10 9 /l Plazi Iguana iguana Leu = 5,80 16,50.10 9 /l Testudo Spp. Leu = 3,00 8,00.10 9 /l Boa constrictor Leu = 6,00 12,00.10 9 /l
HETEROFILY Morfologie Heterofily ptáků a plazů bývají okrouhlé, průměr mají okolo 8,8 µm. Jádro zralého heterofilu je laločnaté (dva nebo tři laloky). Jádro je často částečně zakryto cytoplazmatickými granulemi. Cytoplazma normálního zralého heterofilu je bezbarvá a obsahuje eozinofilní granula Granula jsou typicky oválná až vřetenovitá, tmavě oranžové až jasně červené barvy.
HETEROFILIE stres (kortikosteroidy-indukovaná leukocytóza) bakteriální infekce, pox- a herpesvirové infekce, parazitární infekce, plísňové infekce záněty, např. žloutková peritonitida otrava olovem/kouřem krváceniny, hemolýza
HETEROPENIE Bakteriální a virové infekce s postižením kostní dřeně Záněty s výraznou tkáňovou nekrózou Neoplazie leukémie, lymfosarkom
LYMFOCYTY Morfologie Lymfocyty ptáků a plazů připomínají savčí lymfocyty. Jsou to typicky kulaté buňky s kulatým, centrálně nebo mírně excentricky umístěným jádrem. Cytoplazma je slabě bazofilní (světle modrá). Lymfocyty mohou obsahovat azurofilní granula. Vzhled cytoplazmy je důležitý při rozlišování malých lymfocytů od trombocytů. Cytoplazma trombocytů je čirá a bezbarvá, často obsahuje vakuoly s několika specifickými granulemi.
LYMFOCYTÓZA Chronické infekce bakteriální, virové, plísňové, parazitární Lymfoidní neoplazie lymfosarkom, lymfatická leukémie
LYMFOPENIE Akutní stres Akutní celkové infekce Imunosuprese kortikosteroidy, ozáření
MONOCYTY Morfologie Monocyty ptáků a plazů jsou největšími leukocyty v periferní krvi. Mohou mít různý tvar od kulatého až po améboidní. Jádro může mít různý tvar od kulatého až po laločnaté. Cytoplazma je hojná, modro-šedé barvy. Mohou být přítomny vakuoly nebo eozinofilní granula. Monocyty vykazují fagocytární aktivitu a migrují do tkání, kde se z nich stávají makrofágy.
MONOCYTÓZA Chronické granulomatózní záněty Chronické infekce mykobakterióza, chlamydióza, aspergilóza Nedostatek zinku
EOZINOFILY Morfologie Průměr většiny eozinofilů ptáků a plazů je 7,9 µm. Jádro je laločnaté a obvykle se barví tmavěji než jádro heterofilů. Cytoplazma se barví jasně modře v kontrastu k bezbarvé cytoplazmě normálních zralých heterofilů. Eozinofilní granula v cytoplazmě jsou typicky okrouhlého tvaru. Mají tendenci barvit se intenzivněji ve srovnání s granulemi heterofilů, můžou být červeno-oranžová, světle modrá nebo bezbarvá.
EOZINOFILIE vnitřní a vnější parazité hypersenzitivní odpověď typu IV
BAZOFILY Morfologie Bazofily ptáků a plazů obsahují metachromatická granula, která často zakrývají jádro. Jádro je obvykle nedělené. Cytoplazmatická granula bazofilů jsou často ovlivněna barvením, mohou se částečně rozpadnout.
BAZOFILIE Funkce ptačích a plazích bazofilů není zcela známá bazofily produkují, skladují, a uvolňují histamin, takže mohou mít funkci při okamžitých hypersenzitivních reakcích. uvolňují mediátory pro aktivaci trombocytů, způsobují kontrakce hladké svaloviny, otoky, ovlivňují koagulaci
AZUROFILY Morfologie Azurofily plazů jsou mononukleární buňky s excentricky uloženým jádrem, modrošedá cytoplazma obsahuje zřetelná azurofilní granula. Zastoupení v periferní krvi se liší v závislosti na rodu i druhu plazů (0 15 %). Vyšší počty jsou zaznamenávány u zdravých hadů, téměř je nenalézáme u některých druhů zdravých želv a ještěrů. Funkcí azurofilů je fagocytóza.
TROMBOCYTY Morfologie Trombocyty ptáků a plazů jsou jaderné buňky, typicky malé, kulaté až oválné, u plazů až jehlicovitého tvaru, s kulatým až oválným jádrem. Cytoplazma normálních zralých buněk je bezbarvá, narůžovělá až slabě šedá. Vakuolizace v cytoplazmě se může vyskytnout u aktivovaných nebo fagocytujících trombocytů.