Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/28.0088
Metodické základy patologie Moderní metody vizualizace buněk a tkání Ing. Bc. Ivo Überall, Ph.D. Ústav klinické a molekulární patologie LF UP v Olomouci Ústav histologie a embryologie LF UP v Olomouci Olomouc 2013
Vizualizace znázornění původně skryté skutečnosti V přírodních vědách tři přístupy 1) zvětšení struktur např. lupy, optická mikroskopie 2) zvýraznění struktur např. CT, PET, NMR 3) kombinace obou přístupů např. fluorescenční mikroskopie a její modifikace Vizualizace v patologii omezené spektrum metodik (diagnostika lege artis, pojišťovny) Patologie klinická vs. patologie experimentální (výzkumná) Program přednášky: 1) Trochu historie 2) Světelná mikroskopie a její modifikace 3) Konfokální mikroskopie a její modifikace 4) Dvoufotonová mikroskopie 5) Elektronová mikroskopie 6) Mikroskopie atomárních sil 7) Virtuální mikroskopie 8) Analýza obrazu v patologii
1. Trochu historie. výraz mikroskop začali jako první používat členové učené společnosti Academia dei Lincei 1590-1610 otec a syn Janssenové, první mikroskop 1676 A. van Leeuwenhoek (zvětšení 270 x, vyrobil 500 mikroskopů) 1826 první mikroskop v našem slova smyslu, J.J. Lister 1847 průmyslová výroba mikroskopů firmou Zeiss 1893 tzv. Köhlerův princip, základy mikroskopické fotografie 1911 C. Reichert, fluorescenční mikroskop s UV excitací 1932 F. Zernick, fázový kontrast (Nobelova cena) 1955 Nomarski, diferenciální interferenční kontrast 1968 rastrovací tandemový konfokální mikroskop 1978 laserový konfokální rastrovací mikroskop
2) Světelná mikroskopie (m.) její modifikace - maximální rozlišovací mez světelných m. je cca 200 500 nm - detaily musí být vůči pozadí dostatečně kontrastní 2a) m. v procházejícím světle objekty do 1 μm (nejpoužívanější) světlo prochází objektem - Objekty vidíme díky tomu, že jsou schopny absorpcí zeslabovat intenzitu procházejícího záření. Tato metoda je proto vhodná jen pro objekty buď zcela nepropustné, nebo alespoň barevné. 2b) m. v temném poli (ultramikroskopie) světlo neprochází objektivem Diferenciální interferenční kontrast (DIF) též. Nomarski světelné vlny odražené od nerovností povrchu se odlišují v délce dráhy, případně intenzitě. Lidské epiteliální buňky
2c) Fluorescenční mikroskopie -je založena na poznatku, že některé látky po absorbci krátkovlnného záření emitují záření o větší vlnové délce tedy jiné barvy - fluorescenční pigmenty a fluorescenční barviva (www.probes.com) Základní součásti fluorescenčního mikroskopu -světelný zdroj krátkovlnného světla Hg. Výbojka - selekční filtry propouštějí pouze krátkovlnné světlo - tepelné filtry zabraňují přehřátí preparátu - bariérové filtry odstraňují UV a vytvářejí pozadí fluorescence - optika mikroskopu speciální objektivy (FLUOR) -Nevýhody f.m. - zhášení preparátu -Výhody f. m citlivost, specifita, slabé ovlivňování buněčných pochodů barvení in situ
Aplikace fluorescenční m. 1) Studium uspořádání genomu (více viz Dr. Kořínková 3. 4. 2013) - FISH Fluorescent In Situ Hybridization) Schéma metody FISH Interfázní jádra s detekcí genů pomocí FISH Metafázní chromozómy s detekcí genové přestavby u CML
- GISH - Genomic In Situ Hybridization) PRINS - PRimed IN Situ labelling Metafáze chromozomů barvených celochromozomomi sondami GISH Schéma metody PRINS Metafáze chromozomů s detekcí jednoho genu pomocí PRINS
2) Studium genové exprese, in vivo traffickingu a kolokalizaci proteinů Aequorea victoria (Pohárkovka) GFP Green Fluorescein Protein - sekvenci DNA kódující tento protein lze přenést na libovolné místo genomu jiného organizmu. Pokud jsou tyto konstrukty v živých buňkách můžeme identifikovat zelený protein v konkrétních buňkách a studovat jeho lokalizaci nebo pokud je tato sekvence spojena s promotorem genu, můžeme rozpoznat co gen produkuje
Mitochondrie značené GFP Myška značená GFP Listy Saintpaulia mutované genem s GFP
3) Barvení cytologických struktur a kompartmentů - barvení jednoho objektu na preparátu JÁDRO MITOCHONDRIE Počítačové seskupení obrazu CYTOSKELET
a klinika..? Depozita IgM - glomerulonefritidy Tetracyklinové linie renální osteopatie Vyšetření amplifikace HER2/neu za použití FISH provedené na tkáni fixované formalinem a zalité v parafinu s přímo značenými sondami HER2/neu (červená) a CEP17 (zelená). HER2/neu je amplifikován, jestliže poměr mezi počty HER2/neu a CEP17 je > 2.
- vícenásobné barvení lokalizace receptorů a jejich ligandů hipokampus potkana Metody vícenásobného barvení si vyžádaly rozvoj pokročilých zobrazovacích metod (umožnění stanovení podílu jednotlivých emisí v celkovém vzorku) metody hyperspektrálního zobrazování (dálkový průzkum Země)
4) Charakteristika intracelulárního prostředí buněk Intracelulární ph SNARF Intracelulární Ca Rhod-3 Intracelulární lipidy Lipid-TOX
Speciální metody fluorescenční mikroskopie někdy jsou přidruženy k systému konfokálnímu - slouží zejména ke studiu dynamiky buněčných struktur - podmínkou je navození stavu, kdy je pouze určitá část fluorescenčních molekul aktivní - této aktivity se docílí dvěma způsoby: 1) vybělením fotodegradací fluorescence 2) fotoaktivací fluorescence AD1) ozáření fluorochromu (GFP) v buňce ztráta fluorescence - obnovení fluorescence ve vyběleném objemu FRAP - ztráta fluorescence v okolí vyběleného objemu - FLIP FRAP analýza pohybu jednoho ze sestřihových faktorů nahromaděného v jaderných skvrnách (speckles v živé buňce. Na obrázcích je jádro savčí buňky před (A) a ihned po (B; v čase t = 0 s) vybělení fluorescence v oblasti odpovídající jedné jaderné skvrně (v bílém kroužku), následně pak v průběhu (C) a po dokončení (D) obnovy fluorescenčního signálu ve vybělené oblasti.
AD2 fotoaktivace fluorescence Příkladem je fotoaktivovatelná varianta GFP (PA-GFP). Ta je v buňkách syntetizována ve stavu, ve kterém nevykazuje žádnou fluorescenci v oblasti viditelného světla. Jestliže ji však osvítíme intenzivním zářením o krátké vlnové délce (400 420 nm), struktura molekuly PA-GFP se změní, a tím se aktivuje fluorescence v oblasti zeleného světla, obdobná jako u klasického GFP. Tato metoda tak umožňuje označit molekuly, které se během fotoaktivace nacházejí ve vybrané oblasti a je tak velmi vhodná pro pozorování pohybu molekul mezi buňkami v tkáních či mezi jednotlivými strukturami v rámci jedné buňky. Fotoaktivovatelný GFP (PA-GFP). CFP a PA-GFP byly připojeny k bílkovinám, které se nacházejí ve specifických jaderných strukturách Cajalových tělískách. Zatímco CFP je snadno viditelný, PA-GFP je před aktivací v podstatě nedetekovatelný. Po fotoaktivaci laserem o vlnové délce 405 nm se molekuly PA-GFP v místě aktivace rozsvítí a lze pozorovat jejich pohyb v buněčném jádře. Měřítko: 5 μm.
Nezářivý přenos excitační energie (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer, který popsal T. Förster v polovině 20. století. V principu jde o přenos energie mezi dvěma vhodnými fluorochromy nacházejícími se v příhodné orientaci a vzdálenosti. Pokud se molekuly fluorochromů CFP a YFP k sobě dostatečně přiblíží (typická vzdálenost pro FRET je 5 nm) a vhodně se vůči sobě natočí, je pravděpodobné, že po excitaci molekuly CFP tato molekula získanou energii nezářivě předá blízké molekule YFP, takže místo modrozelené fluorescence pozorujeme fluorescenci žlutou Nezářivý přenos excitační energie (FRET) v buněčném jádře. A CFP a YFP byly připojeny k bílkovinám, které spolu v buňce interagují. Tyto bílkoviny se hromadí v Cajalových tělískách. FRET byl měřen nepřímou metodou. (Po fotodestrukci akceptoru (YFP) ve vybrané oblasti buňky o velikosti asi 4 5 μm (bílý obdélník) se FRET projeví jako zvýšený signál donoru (CFP) v dané oblasti. Buněčné jádro je naznačeno přerušovanou čárou. B Pohled na stejnou buňku jako na obrázku A. Profily intenzit donoru před fotodestrukcí akceptoru a po ní jasně ukazují zvýšení fluorescence pouze v tělískách, ve kterých byl akceptor zničen (bílé šipky). Měřítko: 5 μm.
Speciální metody fluorescenční mikroskopie někdy jsou přidruženy k systému konfokálnímu Polarizovaná fluorescenční mikroskopie pomocí lipofilních sond (difenylhexatrienu) zabudovaných do buněčných membrán slouží ke sledování dynamiky membránových lipidů. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) - metody stanovení dob dohasínání fluorescence. Měříme intenzitu fluorescence jako odezvu na změnu interakcí sondy s jejím okolím metoda pracuje na principu Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET nezářivém přenosu excitační energie) využívá se pro studium prostorového uspořádání membránových receptorů nebo interakci proteinů
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) modifikace využívající totální odraz excitačního záření fluorescenci zkoumaných vzorků budí v tomto případě postupně mizející světelná vlna, která vystupuje ze skla do vzdálenosti cca 100 nm a my vidíme pouze membránové struktury přilehlé k podložnímu sklíčku a jejich nejbližších okolí
Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) - metoda vyvinutá původně pro zobrazování laterální difůze molekul v membránách. Fluorescenční molekula je fúzována se zkoumaným proteinem nebo membránovými lipidy. Po ozáření vybraného místa silným excitačním světlem je fluorescence molekul cíleně vysvícena. Pozorujeme dynamiku obnovení fluorescence ve vysvíceném místě, které svědčí o laterálním pohybu molekul v membránách, kontinuitě membránových organel (ER nebo GA), pohybu zkoumaných molekul nebo transportu molekul (cytoskelet, vápníkové ionty). Bioluminiscence resonance energy transfer (BRET) - slouží ke sledování interakcí molekul v živých organismech podobně jako u FRET, ale aspoň jeden z fluorochromů se v daném organismu vyskytuje přirozeně. Co si netřeba pamatovat: PALM, FPALM, BFPALM, PALMIRA, TFPALM, RPM, SPDM, STORM, SALM
Multifotonová mikroskopie - je založena na principu snímání světlem, jehož energie je příliš nízká pro excitaci fluorochromu. V místě fokusu dochází k setkání dvou nebo tří nízkoenergetických paprsků (fotonů) a výsledná sečtená energie se stává dostatečnou pro excitaci daného fluorochromu, a to pouze v místě zaostření. Pro osvětlení vzorku se využívá světlo s vlnovou délkou, která je násobkem absorpčního maxima použitého fluorochromu. Např. při dvoufotonové excitaci fluoresceinu (absorpční maximum při 500 nm) osvětlení laserem o vlnové délce 1000 nm vede k absorpci 2 fotonů v místě zaostření. Výhodou metody je menší rozptyl světla při vyšších vlnových délkách, nevysvěcování fluorochromu z neozářených částí vzorku, vysoká rozlišovací schopnost a vysoká citlivost. V současnosti se běžně používá dvou- či třífotonová excitace, s výhodou pro tlusté vzorky (více než 100 µm). Multiple-beam - konfokální systémy s paralelním skenováním více laserovými paprsky (nejčastěji uspořádány v linii), které zrychlují skenování limitované dobou saturace fluorochromu. Většina těchto systémů opticky rekonstruuje obraz za použití vysoce citlivých CCD detektorů. Vhodné pro velmi rychlé buněčné děje, např. studium vápníkových kanálů.
Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) - mnohostranná metoda vhodná pro zobrazení interakcí molekul při suboptických rozlišeních, využívaná i ke kvantitativním analýzám (měření nanometrových vzdáleností a jejich změn mezi molekulami in vivo a in vitro). První fluorochrom (donor) je excitován specifickou vlnovou délkou, energie je přenesena na druhý fluorochrom (akceptor), který vyzáří přijatou energii ve formě fluorescence. Základní podmínky pro FRET: 1/ Donorový a akceptorový fluorochrom, absorpční spektrum akceptoru se musí překrývat s emisním spektrem donoru. 2/ Aby došlo k přenosu energie, musí být donorový a akceptorový fluorochrom velmi blízko (většinou 10-100 A). Jednou z technik stanovení účinnosti FRET je měření vzrůstu fluorescence donoru po kompletním vysvícení akceptoru. Experimenty jsou založeny na změnách poměru fluorescence emitované oběma fluorochromy, které se stanovují ve vybraných oblastech vzorku. Rozšíření FRET podpořila dostupnost vhodných fluorochromů, dokonalejší mikroskopické systémy, metody pro korekci spektrálního prosvěcování a možnosti kombinací s dalšími technikami. FRET a FLIM jsou aplikovány při studiu interakcí protein-protein, protein-dna, studiu konformačních změn proteinů, polynukleotidů, DNA, analýze vazebných sekvencí nebo vysokovýkonném rastrování.
3) Konfokální mikroskopie a její modifikace Konfokální označuje se to, co je sdružené s ohniskem (konjugovaný + fokální = konfokální) Princip konfokální mikroskopie byl patentován r. 1957 Marvinem Minskym (1965 mikroskop s dvojitým řádkováním, Hadravský a Petráň) V případě konfokálního mikroskopu je s ohniskem čočky objektivu (tj. místem zaostření ve vzorku) sdružená jak optická soustava, která osvětluje, tak i ta, která zobrazuje = do téhož bodu je zaostřen paprsek osvětlovací i paprsek zprostředkující pozorování Buněčné struktury, které chceme pozorovat, obarvíme fluorochromem. Laserový paprsek je zaostřen do zvolené roviny, která buňkou prochází jako imaginární řez.v této zvolené rovině dojde k osvícení preparátu laserovým paprskem a fluorochrom emituje viditelné záření. Získaný obraz je zaznamená počítačem. Postupnou změnou zaostření je možné získat obraz z více rovin (imaginárních řezů) od vršku až ke spodu buňky. Zde je nejlépe patrný rozdíl proti klasické fluorescenční mikroskopii, kde září fluorochrom ve všech optických rovinách najednou (nelze tedy určit, co je nahoře a co je dole, uprostřed, atd.).
Princip laserové řádkovací konfokální mikroskopie (LSCM) Úzký svazek laseru (intenzivní bodový zdroj světla) směřuje skrz první konfokální clonku na dichromatické zrcadlo, které jej objektivem zaměřuje na určitý bod preparátu, jehož průměr odpovídá difrakční (= rozlišovací) mezi. Preparát je umístěn v ohniskové rovině, kterou vybírá počítač, resp. skenovací zařízení. Odražené (= emitované) světlo prochází opět objektivem, dichroickým zrcadlem, bariérovým filtrem, druhou konfokální clonkou a nakonec dopadá před fotonásobič. Druhá clonka filtruje světlo pocházející z oblasti mimo ohniskovou rovinu. Výsledné informace o preparátu jsou nakonec předány do skenovacího zařízení, kde jsou uloženy také informace o souřadnicích X-Y daného bodu, díky nimž je potom počítač schopen sestavit obraz celého preparátu. Základním principem LSCM je to, že netvoří obraz najednou, ale řádkováním bod po bodu. Tak jsou snímány jednotlivé optické body v rovině XY a navíc díky přesně definovanému posunu v ose Z i jednotlivé optické řezy. Obraz celé zaostřené roviny XY lze získat rastrováním bod po bodu některým z těchto postupů: 1/ rozmítání laserového paprsku 2/příčný posuv vzorku před objektivem 3/ posuv objektivu.
Konfokální mikroskop firmy Olympus
Typy konfokálních mikroskopů Laserový řádkovací (= rastrovací) KM využívá jako zdroj světla laserový paprsek, který je přes systém clonek zaměřován přímo na pozorovaný preparát, resp. bod preparátu. Preparát je tedy skenován bod po bodu tak, že je buď zdroj světla statický a preparát se pohybuje ( stage scanning ) nebo se naopak pohybuje zdroj světla a statický je preparát ( beam scanning ). LSCM je vhodný především pro zobrazování fixovaných preparátů. Jiným principem skenování preparátu je rotující disk (= spinning disc) známý také jako Nipkowovův kotouč, což je rychle rotující perforovaná destička, na které je mnoho vzájemně oddělených clonek a přes kterou je světlo zaměřováno na studovaný objekt. Umožňuje zobrazovat několik bodů preparátu najednou - snímání je tedy rychlé a na pozorovaný objekt působí světlo s nižší intenzitou. Proto je tato metoda vhodná pro pozorování rychlých dějů v živých buňkách.
Přednosti konfokální mikroskopie Vysoké axiální rozlišení při vysoké ostrosti obrazu Možnost optických řezů a pozorování průhledných vzorků i pod povrchem Konstrukce trojrozměrných obrazců Bezkontaktní povrchová profilometrie (i málo odrazivých materiálů) Možnost snímání barevného obrazu ve skutečných barvách Možnost pozorování nevodivých materiálů Možnost pozorování porézních materiálů není potřeba vytvoření vakua Možnost použití obrazové analýzy Možnost využití klasických metod světelné mikroskopie (světlé a tmavé pole, nomarského diferenciální kontrast, fázový kontrast, polarizační a fluorescenčnímikroskopie atd.) Možnost pozorování živých exemplářů bez nutnosti jejich usmrcení. Nedochází k degradaci vzorku Jednoduchá výměna vzorků Jednoduchá obsluha
Porovnání fluorescenční (nahoře) a konfokální mikroskopie (dole) Konfokální mikroskopie dělících se buněk
3D rekonstrukce konfokálních snímků
4) Dvoufotonová mikroskopie - 1990 Watt W. Webb z Cornellovy univerzity na Ithace - na rozdíl od jednofotonové konfokální mikroskopie využívá laser k excitaci dvěma fotony, které jsou absorbovány s prodlevou cca 100 fs - pravděpodobnost dvoufotonové excitace je nejvyšší v rovině zaostření nepotřebujeme konfokální clonku - větší hloubka proostření (400 μm) - zvýšený podíl signálu vůči šumu kontrastnější zaostření Obrázky buněk získané nově vyvinutým mikroskopem. Změny tvarů molekul v buňce se projevují změnami červeného/žlutého/zeleného zabarvení buněk
5) Elektronová mikroskopie 5a) Rastrovací (scanovací) elektronová mikroskopie - vzorek se pokryje tenkou vrstvou kovu od které se odrážejí elektrony - dochází k detekci elektronů, a to jak dopadených, tak rozptýlených - z tohoto signálu se potom rekonstruuje povrch vzorku Elektronový mikroskop JSM 6700F s ultravysokým rozlišením Nádorová buňka melanomu. Rakovinné stadium je charakteristické dendritickými výběžky, okolo melanomové buňky jsou kulovité zdravé leukocyty
5b) Transmisní (prozařovací) elektronová mikroskopie - je elektronovou obdobou světelného mikroskopu, kdy je velmi tenký vzorek prozařován svazkem elektronů Analytický transmisní elektronový mikroskop FEI Tecnai X-Twin F20
5c) Elektronová kryomikrokopie -využívá tzv. vitrifikace - vzorek zchladí (a tedy fixuje) během několika desítek mikrosekund - vzniká nekrystalické pevné skupenství vody, amorfní led, který nemá na strukturu vzorku vliv Elektronová kryomikroskopie izolovaného chromatinu. DNA se v buněčném jádře nachází v komplexu s množstvím proteinů, zejména histonů, které tvoří malé proteinové cívky nukleozomy, okolo nichž je DNA v pravidelných intervalech navinuta a vytváří chromatinové vlákno. Jednotlivé části snímku představují segmenty různé velikosti tohoto vlákna. Protože jsou zachovány ve své původní trojrozměrné konformaci, jsou nukleozomy zachyceny v různých projekcích (příklad pohledu zpředu je označen šipkou, příklad pohledu z boku hvězdičkou). Měřítko: 20 nm. B Snímek minikroužku DNA pořízený elektronovým kryomikroskopem; 156 párů bází dlouhá molekula DNA uzavřená do cirkulární formy a vytvářející miniaturní obruč o průměru přibližně 16 nm. Protože ve vitrifikované vrstvě může být volně orientovaná, lze najít i projekce čistě boční, kde se kruh mění v úsečku.
6) Mikroskopie atomárních sil Mikroskopie atomárních sil (AFM z anglického atomic force microscopy) je mikroskopická technika, která se používá k trojrozměrnému zobrazování povrchů. Prvně ji realizovali v roce 1986 Binnig, Quate a Gerber. Obraz povrchu se zde sestavuje postupně, bod po bodu. Metoda dosahuje velmi vysokého rozlišení může zobrazovat i atomy. Techniku AFM lze použít nejen k zobrazování, ale také k tvorbě struktur či zpracování povrchů v nanometrové oblasti. V principu je AFM podobná metoda jako tunelová mikroskopie. K detekci však neslouží elektrický proud, ale vzájemná meziatomová přitažlivost. Detekuje se pohyb zkoumacího hrotu při průchodu nad vzorkem. Umí zobrazovat i nevodivé vzorky. Nazývá se někdy také SFM (scanning force microscopy). Základem AFM je velmi ostrý hrot, který je upevněn na ohebném nosníku (angl. cantilever, tento termín se používá i v češtině).
7) Virtuální mikroskopie - virtuální mikroskopie je obor, který kombinuje metody klasické mikroskopie a metody digitálního zpracování obrazu (digitální mikroskopie) -1997 Computer Science Department at University of Maryland and the Pathology Department at Johns Hopkins Hospital, Baltimore, Maryland první systém virtuální mikroskopie - v současnosti dynamicky se rozvíjející obor s mnoha aplikacemi Instrumentárium virtuální mikroskopie - mikroskop vybavený kvalitní CCD kamerou s vysokým rozlišením - výkonná PC stanice s příslušným programem analýzy obrazu - přidružené periferie (např. podavač preparátů) - úložiště digitalizovaných snímků s dostatečnou kapacitou - IT platforma (server, rozvody, periferní PC stanice.)
Systém virtuální mikroskopie Tissue Gnostic Systém virtuální mikroskopie dotslide fy. Olympus
Hlavní výhody virtuální mikroskopie - možnost opakovatelného hodnocení snímků - lepší reprodukovatelnost a kvalita - menší nároky na personální zabezpečení - práce s větším souborem objektů (buněk) - lepší standardizace a mezilaboratorní porovnávání Systémy virtuální mikroskopie a analýza obrazu poskytují prostor pro zdokonalování v těchto oblastech zdravotnictví: - vytváření databáze virtuálních snímků - diagnostika, prognóza a predikce lékařská praxe - e-teaching, e-learning, telepatologie - vzdělávání Záludnosti virtuální mikroskopie - v první fázi vysoké finanční nároky, které se však časem vrátí - citlivost systému nutné zaškolení - kvalitně připravené preparáty (kontrast, tloušťka.) - dostatečná kapacita úložného zařízení!! - dobrá spolupráce s odborníky na IT - časová náročnost (se vzrůstající kvalitou snímků, vzrůstá vedle objemu dat i čas scanování) - správné nastavení celého scanovacího systému (kalibrace.)
Inovace výuky mikroskopické morfologie v hematologii zavedením internetové virtuální interaktivní metody Parametry digitalizovaného snímku Slovní nebo audio popis nálezu - editace hematologických nálezů v prohlížeči OlyVIA
8) Analýza obrazu v patologii Analýza obrazu je moderní metoda, která vznikla ve snaze o objektivizaci posuzování jakosti výrobků. Nahrazuje vizuální subjektivní hodnocení, při kterém může právě dojít k rozdílnému ohodnocení určitého znaku zkoumaného předmětu. Oblast použití analýzy obrazu v technologii masa je velice rozmanitá, umožňuje přizpůsobivost a opakovatelnost rozboru, nedochází k destrukci vzorku, vyžaduje však výkonné počítačové vybavení. Analýza obrazu pracuje s barevnými prostory RGB i CIELab. Princip analýzy obrazu spočívá v počítačovém vyhodnocení digitálního obrazu sledovaného objektu sejmutého digitální kamerou, digitálním fotoaparátem nebo scannerem. Obraz (rozdělený na jednotlivé body pixely) lze rovnou zpracovat přímo ve formátu *.jpg, nebo jej příslušný software (LUCIA 5.20, NIS- Elements 2.20) převede na grafický soubor *.lim.) Kvantifikace zastoupení zánětlivých buněk u BHP
TissueFAXS kvantifikace exprese fluorescenčně značených proteinů
HistoFAXS kvantifikace exprese fluorescenčně značených proteinů
Děkuji za pozornost