Detekce a identifikace škodlivých fytoplazem ovocných dřevin

Detekce a identifikace škodlivých fytoplazem ovocných dřevin Fytoplazma Evropské žloutenky peckovin (ESFY, European stone fruit phytoplasma) Fytoplazma proliferace jabloně (AP, Apple proliferation phytoplasma) Fytoplazma chřadnutí hrušně (PD, Pear decline phytoplasma) Fytoplazma žloutenky aster (AY, Aster yellows phytoplasma) Navrátil Milan 1, Válová Pavla 1, Fialová Renata 1, Nečas Tomáš 2 1 Katedra buněčné biologie a genetiky PřF UP v Olomouci, Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc 2 Zahradnická fakulta MZLU, Valtická 337, 691 44 Lednice CÍL DIAGNOSTIKY Detekce a identifikace fytoplazmy Evropské žloutenky peckovin a fytoplazmy žloutenky aster z meruněk, broskvoní, slivoní a třešní; fytoplazmy proliferace jabloně z jabloní a fytoplazmy chřadnutí hrušně z hrušní pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a délkového polymorfismu restrikčních fragmentů (RFLP) PRINCIP DIAGNOSTIKY Fytoplazmy jsou detekovány v lýku izolovaném z dvouletých (jednoletých) větví, případně řapíků a centrálních žilek listů Z homogenátu je centrifugací získán sediment obohacený fytoplazmózní DNA Ze sedimentu je izolována celková DNA obsahující fytoplazmózní DNA Pomocí nested-pcr je namnožen segment DNA, který je specifický pro fytoplazmy Jednotlivé druhy fytoplazem jsou rozlišeny RFLP analýzou Metodika vychází z literatury: Ahrens, U and Seemüller, E (1992): Detection of DNA of plant pathogenic mycoplasmalike organisms by a polymerase chain reaction that amplifies a sequence of the 16S rrna gene - Phytopathology 82: 828-832 Lorenz, KH, Schneider, B, Ahrens, U, Seemüller, E (1995): Detection of the apple proliferation and pear decline phytoplasmas by PCR amplification of ribosomal and nonribosomal DNA - Phytopathology 85: 771-776 Lee, I-M, Bertaccini, A, Vibio, M, Gundersen, D E (1995): Detection of multiple phytoplasmas in perennial fruit trees with decline symptoms in Italy - Phytopathology, 85: 728-735

Heinrich, M, Botti, S, Carrara, L, Arthofer, W, Strommer, S, Hanzer, V, Katinger, H, Bertaccini, A, Laimer da Câmara Machado, M (2001): Improved detection methods for fruit tree phytoplasmas - Plant Molecular Biology Reporter 19: 169-179 VYBAVENÍ LABORATOŘE A CHEMIKÁLIE ( DNA - izolace DNA, PCR provedení PCR, RFLP provedení RFLP) Přístroje Chlazená odstředivka (14 000 g; kyvety: 30 ml) DNA Odstředivka na mikrozkumavky Eppendorf (18 000 g; 1,5 /2,0 ml) DNA PCR, RFLP Minicentrifuga (mikrozkumavky Eppendorf 1,5 /2,0 ml) Výrobník ledové tříště Vodní lázeň DNA DRY Block (37 C, 42 C, 65 C) Lyofilizér nebo Speed vac koncentrátor DNA ph metr Váhy (0,01 g) PCR cyklér PCR PCR, RFLP Transluminátor + Dokumentační systém (foto dokumentace) PCR, RFLP Laminární (PCR) box Chladnička (+ 4 C) Mraznička (- 20 C; případně nízkoteplotní zařízení - 80 C) Mikropipety 0,5 10 μl, 2 20 μl, 20 200 μl, 200 1000 μl Samostatné sady pipet: jednu pro izolaci DNA, druhou pro pipetování reakčních směsí, třetí pro pipetování vzorků a čtvrtou pro pipetování PCR produktů Horizontální elektroforéza + zdroj PCR, RFLP Mikrovlnná trouba Vortex (mikrotřepačka) Materiál Třecí misky a tloučky (cca 16 cm) DNA Skalpel s výměnnými čepelkami (nejlépe č 24) DNA Centrifugační kyvety DNA

Filtrační papír, papírové ručníky (role) Pasteurovy pipety PE (3 ml) DNA 1,5 ml mikrozkumavky Eppendorf (2,0 ml mikrozkumavky Eppendorf) Vyšetřovací rukavice Váženky Síťovina (např: Uhelon) DNA Špičky pro mikropipety + boxy (sterilizovatelné) Laboratorní sklo (kádinky, odměrné válce, láhve reagenční s uzávěrem autoklávovatelné) Zahradnické nůžky Pernamentní popisovač na sklo Roztoky a chemikálie 96% etanol (denaturovaný 2% benzínem) DNA 70% etanol DNA isopropanol DNA 2- merkaptoetanol DNA Třecí pufr DNA 125 mm K 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 30 mm kyselina askorbová 10 % sacharóza 0,15 % BSA 2 % PVP 10 (MW cca 10 000) ph 7,6 Zásobní roztok (2x): 16,5 g K 2 HPO 4 4,1 g KH 2 PO 4 100 g sacharóza 1,5 g BSA 20 g PVP 10 (MW cca 10 000) Přidat demineralizovanou vodu (vodivost cca 0,1 μs/cm, autoklávovaná) do celkového objemu roztoku 500 ml Zmrazit (- 20 C) objemy odpovídající denní spotřebě pro izolaci DNA Třecí pufr připravíme bezprostředně před použitím přidáním 50 ml demineralizované vody a 0,53 g kyseliny askorbové k 50 ml zásobního roztoku třecího pufru (2x), ph upravíme na 7,6 pomocí 3M NaOH

DNA-extrakční pufr DNA : (2,5%) CTAB 12,5 g (1,4 M) NaCl 40,9 g (20 mm) Na 2 EDTA 3,72 g (100 mm) Tris-HCl 6,06 g Tris (1%) PVP 44000 5 g Přidat demineralizovanou vodu (vodivost cca 0,1 μs/cm, autoklávovaná) do celkového objemu roztoku 500 ml a ph upravit na 8,0 pomocí konc HCl Těsně před použitím přidat 0,2 % 2-merkaptoetanolu tj na 20 ml DNA-extrakčního pufru přidat 40 μl 2- merkaptoetanolu Chloroform/isoamylalkohol (24:1) DNA : 240 ml chloroform 10 ml isoamylalkohol TE-pufr DNA (10 mm) TRIS 0,606 g (1 mm) Na 2 EDTA 0,186 g Přidat demineralizovanou vodu (vodivost cca 0,1 μs/cm, atoklávovaná) do celkového objemu roztoku 500 ml a ph upravit na 8,0 pomocí konc HCl Taq DNA Polymerase PCR (např: M1665, Promega, USA) Nukleotidy dttp, dgtp, datp, dctp PCR (např: U1231, U1211, U1201, U1221, Promega, USA ) 1 mm dntp: 960 μl vody + po 10 μl každého dntp o koncentraci 100 mm Syntetizované oligonukleotidy ( primery ) PCR 20 pmol/μl primer: 200 μl vody + 50 μl primeru o koncentraci 100 pmol/μl Diagnostické primery PCR Out-primery R16F1 5 - AAg ACg Agg ATA ACA gtt gg - 3 R16R0 5 - gga TAC CTT gtt ACg ACT TAA CCC C - 3 In-primery fu5 5 - Cgg CAA Tgg Agg AAA CT - 3

ru3 5 - TTC AgC TAC TCT TTg TAA CA - 3 Referenční In-primery PCR In-primery R16F2 5 - ACg ACT gct AAg ACT gg - 3 R16R2 5 - TgA Cgg gcg gtg TgT ACA AAC CCC g - 3 Poznámka: Pár primerů R16F2/R2 používáme v kombinaci s out-primery R16F1/R0 Referenční univerzální nested - PCR primery PCR Out-primery PA2F 5 - gcc CCg gct AAC TAT gtg C - 3 PA2R 5 - TTg gtg ggc CTA AAT gga CTC - 3 In-primery NPA2F 5 - ATg ACC Tgg gct ACA AAC gtg A - 3 NPA2R 5 - ggt ggg CCT AAA Tgg ACT Cg - 3 Druhově specifické primery pro fytoplazmu Evropské žloutenky peckovin (ESFY) fat 5 - CAT CAT TTA gtt ggg CAC TT - 3 rprus 5 - ggc CCA AgC CAT TAT TgA TT - 3 Druhově specifické primery pro fytoplazmu žloutenky aster (AY) fay 5 - gca CgT AAT ggt ggg CAC TT - 3 ray 5 - CgA AgT TAg gcc ACC ggc TTT - 3 Poznámka: Pár primerů fat/rprus a fay/ray použijeme pro diagnostiku přímo Není možné je kombinovat v nested PCR s párem primerů R16F1/R16R0 Komentář k použití primerů: Standardní reprodukovatelné výsledky jsou získány pomocí nested-pcr s primery R16F1/R0 a fu5/ru3 Srovnatelné výsledky je možné obdržet pomocí nested-pcr s primery PA2F/PA2R a NPA2F/NPA2R Použití primerů R16F1/R0 v kombinaci s R16F2/R2 vyžaduje vyšší empirické zkušenosti při hodnocení výsledků reakce (slabé nebo vícenásobné produkty, možnost nespecifické amplifikace) Použití druhově specifických primerů umožňuje zachytit statisticky průkazně nižší počet pozitivních stromů Specifitu PCR reakce je potřebné ověřit RFLP nebo sekvenační analýzou

DNA, PCR TAE-pufr TAE pufr (1x pracovní roztok): 40 mm TRIS acetát 2 mm EDTA 50x zásobní roztok: 242 g TRIS base 57,1 ml ledová kyselina octová 37,2 g Na 2 EDTA 2H 2 O ph 8,5; doplnit H 2 O do 1000 ml TBE-pufr RFLP TBE pufr (1x pracovní roztok): 89 mm TRIS base 89 mm kyselina boritá 2 mm EDTA 10x zásobní rotok: 108 g TRIS base 55 g kyselina boritá 40 ml 0,5 M EDTA, ph 8,0 doplnit H 2 O do 1000 ml Agaróza pro DNA elektroforézu 0,7% Agarosa/TAE pro kontrolu izolované DNA 1,0% Agarosa/TAE pro kontrolu PCR produktu 3,0% Agarosa/TBE pro kontrolu RFLP znaků Ethidium bromid Zásobní roztok: 2,5 mg/1 ml H 2 O 2 μl na 50 ml agarózového gelu Ethidium bromid je látka, která se váže na šroubovici nukleových kyselin, kde pak pod UVlampou (312 nm) intenzívně růžově fluoreskuje Ethidium bromid je mutagen, proto se veškerá manipulace provádí v rukavicích Agarózové gely, vyšetřovací rukavice a plasty kontaminované ethidium bromidem se skladují odděleně v silných PE pytlích a likvidaci provádějí speciální firmy zabezpečující likvidaci nebezpečného odpadu Roztoky a pufry se dekontaminují přímo v laboratoři pomocí specifických adsorpčních kolon

Vzorkovací roztok pro nanášení vzorků (PCR a RFLP produktů) do gelů 0,1% bromfenolová modř v 30% glycerín/h 2 O nebo např Blue/Orange 6x Loading Dye, Cat No G190A, Promega, USA PCR, RFLP Standard molekulové váhy pro ELFO např: 100 bp DNA ladder, Cat No G2101, Promega, USA ODBĚR A SKLADOVÁNÍ VZORKŮ Viz: "Metodika pro odběr vzorků hrušní podezřelých z výskytu fytoplazmy chřadnutí hrušně (PD)", "Metodika pro odběr vzorků jabloní podezřelých z výskytu fytoplazmy proliferace jabloně (AP)" a "Metodika pro odběr vzorků meruněk podezřelých z výskytu fytoplazmy Evropské žloutenky peckovin (ESFY)" na http://genetikaupolcz; vědeckovýzkumná činnost, fytoplazmy IZOLACE DNA (modifikace podle Ahrense a Seemüllera, 1992) 1 K 50 ml zásobního roztoku třecího pufru (2x) přidáme stejný objem demineralizované vody a 0,53 g kyseliny askorbové Po rozpuštění upravíme ph pomocí NaOH na 7,6 Pufr dáme chladit do ledové tříště Toto množství postačuje na zpracování cca 6 až 8 vzorků 2 Centrifugační kyvety předchladíme v ledové tříšti nebo chladničce 3 Třecí misky a paličky předchladíme (skladujeme v +4 C) Před použitím dáme třecí misku a paličku do nádoby s ledovou tříští 4 Předchladíme centrifugu (4 C) 5 Vodní lázeň vyhřejeme na 60 C Extrakční pufr předehřejeme před použitím ve vodní lázni na 60 C 6 Do předchlazené třecí misky na ledě pipetujeme cca 7 ml třecího pufru 7 Odstřihneme poškozený konec vzorku (zaschlý, hnědé lýko) 8 Skalpelem oloupeme kůru a lýko seškrábeme přímo do připravené třecí misky s pufrem Dbáme na to, aby lýko bylo ihned inkubováno v pufru (!!!lýko nesmí zhnědnout na vzduchu!!!) Ze čtyř výhonů připravíme proporcionální směsný vzorek, tj celkem 0,5 1,0 g lýka Pletivo necháme inkubovat v pufru cca 5 10 minut; přidáme mořský písek a důkladně homogenizujeme Homogenát přelijeme do chlazené centrifugační kyvety; paličku a třecí misku 2-3 x vypláchneme třecím pufrem Celkem získáme 15 až 25 ml homogenátu Kyvety vyvažujeme třecím pufrem 9 Centrifugujeme 5 minut, 1100 g (maximálně 1500 g), 4 C

10 Supernatant přelijeme přes sítko (Uhelon) do čisté centrifugační kyvety Kyvety vyvážíme třecím pufrem 11 Centrifugujeme 25 minut, 14 000 g, 4 C 12 Supernatant vylijeme (ihned po ukončení centrifugace), kyvetu postavíme dnem vzhůru na filtrační papír (papírový ručník) a necháme odkapat Filtrační papír používáme jednorázově 13 Připravíme si odpovídající množství extrakčního pufru (cca 2 ml/vzorek) a přidáme 40 l 2-merkaptoetanolu na 20 ml extrakčního pufru Pufr předehřejeme před použitím ve vodní lázni na 60 C 14 Pasteurovou pipetou přidáme 2,0 ml předehřátého (60 C) extrakčního pufru, sediment oplachováním a třením o stěnu kyvety rozpustíme a přeneseme do čisté centrifugační kyvety (nebo rozdělíme do dvou 2 ml mikrozkumavek Eppendorf) 15 Kyvety inkubujeme10 až 20 minut při 60 C, po 5 až 10 minutách obsah promícháme 16 Po inkubaci kyvety před přidáním směsi chloroform/isoamylalkohol ochladíme na ledu 17 Získaný lyzát extrahujeme stejným objemem směsi chloroform/isoamylalkohol (24:1, v/v) a protřepeme (20 x kyvetu obrátíme) 18 Centrifugujeme 5 minut při 5000 g, 4 C nebo při pokojové teplotě (cca 20 C) 19 Po centrifugaci pečlivě přepipetujeme horní vodní fázi obsahující rozpuštěnou DNA do čistých 1,5 ml mikrozkumavek Eppendorf (tj 2 x 0,5 ml) Pokud není horní fáze bezbarvě čirá, opakujeme krok 16 až 18 Dbáme na to, aby vodní fáze nebyla kontaminována sedimentem nebo dokonce chloroformovou fází Přidáme dvojnásobek isopropanolu (tj 1 ml) předchlazeného na 20 C (skladován v mrazicím boxu při 20 C) Pečlivě promícháme (20x obrátíme) a izolovanou DNA srážíme v 20 C minimálně 1 hodinu Je možné nechat DNA srážet přes noc nebo dokonce uchovávat vysráženou DNA v tomto stavu několik dní (např přes víkend) 20 Centrifugujeme 5 min při 18 000 g (minimálně 16 000 g) 21 Supernatant opatrně vylijeme, mikrozkumavku necháme okapat dnem vzhůru na filtračním papíru, který použijeme jednorázově Malý čirý nebo mléčně zabarvený sediment opláchneme 70% etanolem (1 ml) Klepáním odlepíme sediment a protřepeme 22 Centrifugujeme 5 minut při 18 000 g (min 16 000 g) 23 Supernatant slijeme a mikrozkumavku položíme dnem vzhůru na filtrační papír, až na stěnách mikrozkumavky nejsou vidět kapky etanolu 24 Sediment vysušíme pod vakuem (sediment zbělá) Vysušené sedimenty můžeme dlouhodobě uchovávat v 20 C

25 Vysušený sediment rozpustíme ve 100 l (250 l) demineralizované vody (případně TE pufru), protřepeme na Vortexu a centrifugujeme na minicentrifuze Správně izolovaná DNA se zcela rozpustí 26 Pro dokonalé rozpuštění sedimentu můžeme inkubovat roztok izolované DNA 10 minut při 65 C 27 Ověříme přítomnost izolované DNA (elektroforéza na agarózovém gelu, UV spektrofotometricky, fluorometricky) 28 Rozpuštěnou izolovanou DNA můžeme uchovávat při 20 C Upozornění: Během celého postupu izolace DNA popisujeme kyvety a mikrozkumavky označením vzorku Musíme vzít v úvahu, že použité reagencie rozpouštějí inkoust používaných popisovačů a může dojít k jeho smazání Poškození popisek naznačuje malou pečlivost při práci a možnou kontaminaci mezi vzorky Rovněž okapávání nebo částečně vysušování kyvet a mikrozkumavek na filtračním papíru může být zdrojem nežádoucí kontaminace, a proto používáme filtrační papír jednorázově, aby nemohlo dojít ke kontaminaci mezi zkumavkami Pipetujeme vždy tak, aby nevznikaly aerosoly (prasklé kapičky na špičkách) Při nechtěném nasátí vzorku do pipety musí být pipeta dekontaminována Při práci dáváme přednost využití jednorázových plastů, které vyhazujeme do mikrotenových pytlů a po práci ihned odnášíme z laboratoře Třecí misky, tloučky a kyvety dekontaminujeme po důkladném umytí v roztoku 0,1 M HCl (obvykle přes noc), důkladně opláchneme demineralizovanou vodou a sterilizujeme v horkovzdušné sušárně Špičky mikropipet (pokud nekupujeme sterilní) před použitím autoklávujeme a dosušíme v horkovzdušné sušárně Pro izolaci DNA ze vzorků je možné použít komerčně dostupné soupravy na izolaci genomické DNA, jako např Invitrogen: Easy-DNA TM Kit for genomic DNA isolation, Qiagen: DNeasy Plant Mini, Promega: WIZARD SV Genomic DNA Purification System, Promega: WIZARD Genomic DNA Purification Kit, Machery-Nagel: NucleoSpin R Tissue Pro úspěšnou izolaci DNA pomocí izolačních kitů je nezbytné provést nejdříve homogenizaci a zakoncentrování fytoplazem do sedimentu, tzv enrichement postup podle metody Ahrense a Seemüllera (1992) viz kapitola Izolace DNA - kroky 1 až 12) a dále pokračovat v izolaci DNA z tohoto sedimentu podle návodu

UNIVERZÁLNÍ DETEKCE FYTOPLAZMY EVROPSKÉ ŽLOUTENKY PECKOVIN, FYTOPLAZMY PROLIFERACE JABLONĚ A FYTOPLAZMY CHŘADNUTÍ HRUŠNĚ POLYMERÁZOVOU ŘETĚZOVOU REAKCÍ A JEJÍ IDENTIFIKACE RESTRIKČNÍ ANALÝZOU PROVEDENÍ PCR REAKCE Příprava PCR reakční směsi (pro celkový objem PCR reakce 20 μl) Nejdříve si podle počtu vzorků a zvoleného objemu reakce připravíme tzv PREMIX, a to smícháním položek 1 až 7 v daném pořadí (viz tabulka 1) Do první PCR reakce, tzv "direkt", vezmeme kombinaci out-primerů: R16F1/R16R0 Po důkladném promíchání (Vortex) a stočení na minicentrifuze rozpipetujeme PREMIX do předem připravených a popsaných PCR zkumavek (o objemu 0,2 ml) a přidáme vzorek Opět promícháme, stočíme a vložíme do předem naprogramovaného PCR cykléru PCR produkt získaný "direkt" reakcí naředíme 40x demineralizovanou sterilní vodou a stejným způsobem provedeme druhou, tzv "nested", reakci pouze s tím rozdílem, že použijeme in-primery (fu5/ru3, případně F2/R2) Tab 1: Příprava reakční směsi PCR (PREMIX) Položka Koncetrace Konečná Pipetuj prac roztoku koncentrace 1 test 1 Voda 12,1 μl 2 Pufr 10 x 1 x 2 μl 3 MgCl 2 25 mm 1,5 mm 1,2 μl 4 dntp 1 mm 100 μm 2 μl 5 f-primer 20 pmol/μl 0,25 μm 0,25 μl 6 r-primer 20 pmol/μl 0,25 μm 0,25 μl 7 Taq pol 5 U/μl 1 U/reakce 0,2 μl CELKEM PREMIX Objem reakce 18 μl 20 μl VZOREK 2 μl Upozornění: Do jedné reakce PCR je vhodné vzít 5-20 ng vzorkové DNA Řádově vyšší množství DNA může vyvolat nespecifické amplifikace a v ojedinělých případech i inhibici PCR reakce

Podmínky PCR reakce v cykléru pro primery R16F1/R16R0 a R16F2/R16R2 Počáteční denaturace 94 C, 2 min 1 cyklus 1 Denaturace 94 C, 1 min 2 Hybridizace primerů (annealing) 50 C, 2 min 35 cyklů 3 Prodlužování primerů (extension) 72 C, 3 min Finální extension 72 C, 10 min 1 cyklus Podmínky PCR pro primery fu5/ru3, fat/rprus a fay/ray Počáteční denaturace 94 C, 2 min 1 cyklus 4 Denaturace 94 C, 1 min 5 Hybridizace primerů (annealing) 55 C, 1 min 35 cyklů 6 Prodlužování primerů (extension) 72 C, 1 min Finální extension 72 C, 10 min 1 cyklus Podmínky PCR pro univerzální primery PA2F/ a PA2R Počáteční denaturace 94 C, 2 min 1 cyklus 7 Denaturace 94 C, 30 s 8 Hybridizace primerů (annealing) 60 C, 75 s 9 Prodlužování primerů (extension) 72 C, 90 s Finální extension 72 C, 10 min 1 cyklus 35 cyklů Podmínky PCR pro univerzální primery NPA2F/ a NPA2R Počáteční denaturace 94 C, 2 min 1 cyklus 10 Denaturace 94 C, 30 s 11 Hybridizace primerů (annealing) 50 C, 30 s 12 Prodlužování primerů (extension) 72 C, 45 s Finální extension 72 C, 10 min 1 cyklus 35 cyklů Během přípravy PCR reakční směsi je potřebné dodržovat následující pravidla: 1 Reakční směs připravujeme a pracujeme s ní vždy ve chlazených zkumavkách (chladicí stojánek, ledová tříšť) 2 S Taq polymerázou manipulujeme jen po nezbytně nutnou dobu; vždy ji chladíme a ihned ukládáme do mrazícího boxu (-20 C)

3 Pipety, které používáme k přípravě zásobních roztoků a PREMIXU, nikdy nepoužijeme k pipetování vzorků nebo produktů reakce Podobně nemůžeme stejnou pipetu používat k pipetování vzorků a PCR-produktů V těchto případech hrozí nebezpečí kontaminace, kdy jsou výsledkem falešné pozitivní reakce ELEKTROFORÉZA PCR-PRODUKTU Příprava 1% agarózového gelu a provedení elektroforézy PCR produktu 1 Rozvaříme 1 g agarózy ve 100 ml TAE pufru (reagenční láhev se šroubovacím uzávěrem, mikrovlnná trouba) Připravený agarózový gel je možné uchovávat při +2 až 8 C (K vyhodnocení můžeme použít i 0,8% agarózový gel) 2 Připravíme si vaničku (10 x 10 cm) horizontální elektroforézy, čela pečlivě přelepíme izolepou a vsadíme hřebínek Vaničku je nutné umístit na vodorovnou plochu 3 Do 50 ml rozvařeného agarózového gelu (cca 50-60 C) přidáme 2 μl pracovního roztoku ethidium bromidu (2,5 mg/ml H 2 O), promícháme a vlijeme do připravené vaničky Po ztuhnutí gelu (cca 10 min) odlepíme izolepu, opatrně vyjmeme hřebínek a vaničku vložíme do elektroforetické komůrky (jamky u katody - ) Komůrku naplníme TAE pufrem tak, aby byl gel převrstven 2 až 5 mm vrstvou pufru 4 Vzorek pro analýzu výsledku PCR připravíme smícháním 5 10 µl PCR-produktu se 2 µl vzorkovacího roztoku 5 Vzorky do jamek v gelu plníme mikropipetou (maximálně 10 15 μl/jamka) Obvykle je nanášíme zleva doprava a jejich rozmístění zaznamenáme do protokolu; jako první umístíme standard molekulové váhy (např 100 bp ladder) 6 Zapojíme elektrické pole (černý vodič -, červený + ) Negativně nabité molekuly DNA se pohybují od katody (-) k anodě (+) 7 Na zdroji nastavíme 80 V a necháme probíhat elektroforetickou separaci, až modrá zóna odpovídající bromfenolové modři urazí dráhu cca 2 cm 8 Po rozdělení vzorků vypneme zdroj a odpojíme elektroforetickou komůrku od elektrického proudu Gel opláchneme destilovanou vodou (můžeme inkubovat v destilované vodě až 10 minut) a umístíme na UV transparentní podložku, se kterou gel prohlížíme UV transluminátorem Pozitivním výsledkem je fluoreskující proužek ( band ) odpovídající velikosti amplifikovanému segmentu DNA (viz tabulka 3) RESTRIKČNÍ ANALÝZA (RFLP) fu5/ru3 nebo R16F2/R2 PCR PRODUKTU

Fytoplazmy Evropské žloutenky peckovin (ESFY), proliferace jabloně (AP) a chřadnutí hrušně (PD) mohou být rozlišeny restrikční analýzou PCR produktu pomocí restrikčních endonukleáz RsaI a SfeI (=BfmI, =SfcI) Tab 2: Příklad přípravy reakční směsi RFLP pro 1 vzorek: Položka Množství DNA (vzorek) 10,0 µl Restrikční endonukleáza (RsaI nebo 0,2 µl SfeI) Pufr 10x 1,5 µl Destilovaná voda 3,3 µl Celkový objem 15,0 µl Při přípravě reakční směsi postupujeme vždy podle návodu dodaného výrobcem restrikční endonukleázy Reakční směs inkubujeme při 37 C po dobu 2 hodin nebo přes noc po dobu 16 hodin Produkt restrikční analýzy (7,5 l + 2 l vzorkovací roztoku) separujeme na 2% nebo 3% agarózovém gelu v TBE pufru Výsledky dělení porovnáme s restrikčními spektry kontrolních vzorků a se schématem v této metodice (viz obr 1 a 2) Poznámka: Pomocí RFLP můžeme analyzovat pouze jednoznačně pozitivní PCR produkty (čistý jasně viditelný proužek o velikosti odpovídající použitým primerům (viz tabulka 3) Ke kontrole štípání vždy používáme dříve připravenou pozitivní kontrolu VÝSLEDKY Kontrola správného provedení Kontrola izolace DNA: 1 pás genomické DNA na 0,7% agarózovém gelu Koncentrace DNA: fluorometricky: minimálně 1μg celkové DNA/1 ml spektrofotometricky: A260/280 = 1,6-2,0; více než 1μg celkové DNA/1 ml Kontrola PCR : současně se vzorky vždy dáváme do reakce pozitivní a negativní kontrolu a slepý vzorek (blank)

Kontrola RFLP: zkontrolujeme velikost štěpných fragmentů pozitivní kontroly a analyzovaného vzorku a neštípaného produktu Kombinace primerů Tab 3: Kontrola velikostí PCR a RFLP produktů Velikost PCR produktu [bp] Produkty štěpení RsaI [bp] Produkty štěpení SfeI [bp] R16F1/R0 1300 --------------------------- --------------------------- R16F2/R2 1239 ESFY: 280, 390, 500 AP: PD: 500, 660 500, 660 fu5/ru3 876 ESFY: 360, 390 AP: PD: 365, 450 365, 450 ESFY: (370 + 400), 470 AP: 390, 840 PD: (370 + 400), 470 ESFY: (250 + 260), 370 AP: 250, 630 PD: 250, 260, 365 PA2F/R 1187 --------------------------- --------------------------- NPA2F/R 485 --------------------------- --------------------------- fat/rprus 480 --------------------------- --------------------------- fay/ray 320 --------------------------- ---------------------------

Obr 1: RFLP analýza fu5/ru3 PCR produktu RsaI rozlišuje ESFY -- AP a PD -- AY SfeI rozlišuje AP a AY -- ESFY a PD 2654 RsaI SfeI 1198 676 460 222 M ESFY AP PD AY ESFY AP PD AY M marker pgem, ESFY - fytoplazma Evropské žloutenky peckovin, AP fytoplazma proliferace jabloně, PD fytoplazma chřadnutí hrušně, AY fytoplazma žloutenky astry

Obr 2: RFLP analýza R16F2/R2 PCR produktu RsaI rozlišuje ESFY -- AP a PD -- AY SfeI rozlišuje AP a AY -- PD a ESFY 100 bp AP PD ESFY AY-B AY-C ladder 500 Rsa I 500 AP PD ESFY AY-B AY-C Sfe I AP fytoplazma proliferace jabloně, PD fytoplazma chřadnutí hrušně, ESFY - fytoplazma Evropské žloutenky peckovin, AY-B fytoplazma žloutenky astry (subgoup I-B), AY-C fytoplazma žloutenky astry (subgoup I-C)