UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE Přírodovědecká fakulta Katedra biochemie Bc. Kateřina Růžičková Charakterizace fosfatas v rostlinách tabáku (Nicotiana tabacum L.) Characterization of phosphatases in tobacco plants (Nicotiana tabacum L.) Diplomová práce Vedoucí diplomové práce: Doc. RNDr. Helena Ryšlavá, CSc. Konzultant: RNDr. Veronika Doubnerová, PhD. Praha, 2011

Prohlašuji, že jsem tuto diplomovou práci vypracovala samostatně pod vedením školitelky doc. RNDr. Heleny Ryšlavé, CSc. a všechny použité prameny jsem řádně citovala. V Praze dne. Kateřina Růžičková 1

Ráda bych touto cestou poděkovala všem, kteří mě podporovali a pomáhali mi v průběhu této práce. Chtěla bych poděkovat své školitelce doc. RNDr. Heleně Ryšlavé, CSc. za skvělé vedení, cenné rady a trpělivost, dále RNDr. Veronice Doubnerové, PhD. za vstřícnost a všestrannou pomoc při řešení experimentální části práce. Děkuji také své rodině za jejich podporu v průběhu celého studia. Děkuji vám! 2

ABSTRAKT Fosfatasy (EC 3.1.3.x) jsou skupina enzymů, které hydrolyzují fosfoestery. Významně tak ovlivňují energetický metabolismus buňky i jeho regulaci. Fosfatasy defosforylující proteiny jsou nedílnou součástí signálních drah a odpovědí na stres a regulují enzymy. Tato práce se věnuje studiu fosfatas získaných z listů tabáku (Nicotiana tabacum L.). Byly připraveny enzymové preparáty kyselou i zásaditou extrakcí. Za použití chromogenního substrátu pnp-fosfátu byla zjištěna vyšší fosfatasová aktivita glykosylované frakce než ve frakci nezachycené na Con A Sepharose. Studium vlivu iontů na fosfatasovou aktivitu zaznamenalo aktivaci ionty Mg 2 + a Ca 2 + a inhibici ionty Co 2 + a Mn 2 +. Zn 2 + ionty fosfatasovou aktivitu neovlivňovaly. Glykosylované fosfatasy štěpily rovněž další nízkomolekulární substráty fosfoserin, ATP a glukosa-6-p. Při studiu proteinfosfatasové aktivity bylo zjištěno, že substrátem glykosylované frakce fosfatas je fosvitin, ale ne kasein ani tryptické štěpy kaseinu. Podrobným měřením bylo zjištěno, že ph optimum pro všechny substráty leží v oblasti ph 5-6. Glykosylované fosfatasy štěpí také fosfát v molekule PEPC ze semen kukuřice. Klíčová slova: fosfatasa, proteinfosfatasa, tabák, Con A Sepharosa, pnpfosfát, ATP, P-serin, glukosa-6-p, fosvitin 3

ABSTRACT Phosphateses (EC 3.1.3.x) are a group of enzymes that hydrolyze phosphoesters. That way they affect the energetic metabolism of a cell and its regulation. Phosphatases that dephosphorylate proteins are an integral part of signaling pathways, stress responses and they modulate enzymatic activity. This thesis deals with the study of phosphatases obtained from tobacco leaves (Nicotiana tabacum, L.). Solution of enzymes was prepared by extraction in both acidic and alkaline buffers. Through the use of the chromogenic substrate pnp-phosphate it was determined that there is a higher phosphatase activity in the glycosylated fraction than in the fraction that did not bind to Con A Sepharose. The research of the ions effect on the phosphatase activity has determined that Mg 2 + and Ca 2 + show positive effect on the phosphatase activity while the effect of Co 2 + and Mn 2 + is inhibitory. The Zn 2 + ions have shown no effect whatsoever. The glycosylated phosphatases also dephosphorylated low-weight-molecular substrates phosphoserine, ATP and glucose-6-phosphate. The research of protein phosphatase activity discovered the affinity to the substrate phosvitin, although neither to casein nor its tryptic cleaves. Detailed experiments have shown that the ph optima for all the substrates lie from ph 5 to 6. Glycosylated phosphatases also hydrolyze the phosphate in the PEPC molecules from Zea mays seeds. Keywords: phosphatase, protein phosphatase, tobacco, Con A Sepharose, pnp-phosphate, ATP, P-serine, glucose-6-p, phosvitin 4

Seznam použitých zkratek a - aktivita ADP - adenosindifosfát ATP - adenosintrifosfát BSA - hovězí sérový albumin DTT - dithiothreitol EDTA - kyselina ethylenediaminetetraoctová G6P - glukosa-6-fosfát K m - Michaelisova konstanta MDH - malátdehydrogenasa NADH - nikotinamid adenin dinukleotid PEP - fosfoenolpyruvát PEPC - fosfoenolpyruvátkarboxylasa PMSF - fenylmethylsulfonylfluorid pnp - para-nitrofenol PVP - polyvinylpyrrolidon SDS - dodecylsíran sodný TEMED - N, N, N', N' - tetramethylendiamin TRIS - tris(hydroxymethyl)aminomethan V li m - maximální reakční rychlost 5

OBSAH 1. ÚVOD... 9 1.1. FOSFOR A JEHO V ÝZNAM PRO ROSTLINY... 9 1.2. Fosfatasy... 9 1.2.1. Alkalické fosfatasy... 9 1.2.2. Kyselé fosfatasy... 11 1.2.2.1. Extracelulární kyselé fosfatasy... 11 1.2.2.2. Intracelulární kyselé fosfatasy... 12 1.2.2.3. Specializované fosfatasy... 13 1.2.2.3.a Phytasy... 13 1.2.2.3.b Fosfoglykolátfosfatasa... 14 1.2.2.3.c 3-fosfoglycerátfosfatasa... 14 1.2.2.3.d Fosfoenolpyruvátfosfatasa... 14 1.2.3. Proteinfosfatasy... 15 1.2.3.1. Ser/Thr proteinfosfatasy... 16 1.2.3.2. Proteinfosfatasová aktivita kyselých fosfatas... 19 1.3. VÝZKUM FOSFATASOVÉ AKTIVITY... 19 1.4. PROTEINFOSFATASA DEFOSFORYLUJÍCÍ FOSFOENOLPYRUV ÁTKARBOXYLASU... 22 2. CÍL PRÁCE... 25 3. MATERIÁL A METODY... 26 3.1. MATERIÁL A PŘÍSTROJE... 26 3.1.1. Rostlinný materiál... 26 3.1.2. Chemikálie a enzymy... 26 3.1.3. Přístroje... 27 3.2. METODY A POSTUPY... 28 3.2.1. Příprava enzymu... 28 3.1.1.1. Homogenizace a extrakce... 28 3.2.1.2. Afinitní chromatografie na Con A Sepharose... 28 3.2.1.3. Stanovení množství proteinů... 30 3.2.2. Stanovení fosfatasové aktivity... 30 3.2.2.1. Stanovení fosfatasové aktivity v závislosti na ph... 30 3.2.2.2. Stanovení fosfatasové aktivity v závislosti na koncentraci substrátu... 31 6

3.2.3. Stanovení fosfatasové aktivity vůči dalším substrátům... 31 3.2.3.1. Stanovení volného fosfátu... 31 3.2.3.2. Stanovení aktivity vůči nízkomolekulárním substrátům... 32 3.2.3.3. Stanovení aktivity vůči fosvitinu... 32 3.2.3.4. Příprava roztoku kaseinu a stanovení fosfatasové aktivity vůči kaseinu... 33 3.2.4. Elektroforetické metody... 33 3.2.4.1. Elektroforetická separace v prostředí SDS... 34 3.2.4.2. Detekce proteinů na polyakrylamidovém gelu... 35 3.2.5. Vliv fosfatasové aktivity na PEPC ze semen kukuřice... 35 3.2.5.1. Příprava PEPC... 35 3.2.5.2. Stanovení aktivity PEPC... 35 3.2.5.3. Vliv defosforylace na aktivitu PEPC... 36 3.2.5.4. Stanovení inhibice PEPC malátem... 36 3.2.5.5. Stanovení aktivace PEPC glukosa-6-fosfátem... 36 3.2.6. Stanovení kinetických konstant... 36 4. VÝSLEDKY... 38 4.1. PŘÍPRAV A FOSFATASY Z LISTŮ TABÁKU... 38 4.1.1. Stanovení závislosti fosfatasové aktivity na čase... 38 4.1.2. Optimalizace extrakce fosfatasové aktivity... 39 4.1.3. Afinitní chromatografie na koloně Con A Sepharosy... 40 4.1.4. Elektroforetická separace... 42 4.2. CHARAKTERIZACE FOSFATASOVÉ AKTIVITY VŮČI SUBSTRÁTU PNP-FOSFÁT... 44 4.2.1. Vliv ph prostředí na fosfatasovou aktivitu... 44 4.2.2. Vliv teploty na fosfatasovou aktivitu... 45 4.2.2.1. Teplotní stabilita... 46 4.2.2.2. Teplotní optimum... 46 4.2.3. Vliv přítomnosti iontů na fosfatasovou aktivitu... 47 4.2.3.1. Vliv hořečnatých iontů na fosfatasovou aktivitu... 47 4.2.3.2. Vliv vápenatých iontů na fosfatasovou aktivitu... 49 4.2.3.3. Vliv kobaltnatých iontů na fosfatasovou aktivitu... 50 4.2.3.4. Vliv manganatých iontů na fosfatasovou aktivitu... 51 4.2.3.5. Vliv železitých iontů na fosfatasovou aktivitu... 52 4.2.3.6. Vliv nikelnatých iontů na fosfatasovou aktivitu... 53 4.2.3.7. Vliv zinečnatých iontů na fosfatasovou aktivitu... 54 7

4.2.4. Závislost fosfatasové aktivity na koncentraci substrátu pnp-fosfátu... 55 4.3. CHARAKTERIZACE FOSFATASOVÉ AKTIVITY VŮČI NÍZKOMOLEKULÁRNÍM SUBSTRÁTŮM... 58 4.3.1. Charakterizace fosfatasové aktivity vůči P-serinu... 58 4.3.1.1. Závislost fosfatasové aktivity na čase... 58 4.3.1.2. Závislost fosfatasové aktivity na ph... 59 4.3.1.3. Závislost fosfatasové aktivity na koncentraci substrátu P-serinu... 60 4.3.2. Charakterizace fosfatasové aktivity vůči ATP... 62 4.3.2.1. Závislost fosfatasové aktivity na čase... 62 4.3.2.2. Závislost fosfatasové aktivity na ph... 62 4.3.2.3. Závislost fosfatasové aktivity na koncentraci substrátu ATP.. 63 4.3.2. Charakterizace fosfatasové aktivity vůči glukosa-6-p... 65 4.3.3.1. Závislost fosfatasové aktivity na čase... 65 4.3.3.2. Závislost fosfatasové aktivity na ph... 66 4. 3. 3. 3. Závislost fosf atasové aktivit y na koncentraci substrátu glukosa-6- fosfát... 67 4.4. CHARAKTERIZACE FOSFATASOVÉ AKTIVITY VŮČI VYSOKOMOLEKULÁRNÍM SUBSTRÁTŮM... 69 4.4.1. Charakterizace fosfatasové aktivity vůči kaseinu... 69 4.4.2. Charakterizace fosfatasové aktivity vůči proteinu fosvitinu... 69 4.4.2.1. Závislost fosfatasové aktivity na čase... 69 4.3.2.2. Závislost fosfatasové aktivity na ph... 70 4.3.2.3. Závislost fosfatasové aktivity na koncentraci substrátu fosvitinu... 71 4.5. V LIV FOSFATASOVÉ AKTIVITY NA AKTIVITU FOSFOENOLPYRUV ÁTKARBOXYLASY... 72 4.5.1. Změna aktivity PEPC po působení fosfatas tabáku... 72 4.5.2. Vlastnosti PEPC po působení fosfatas tabáku... 73 5. DISKUSE... 74 6. SOUHRN... 80 7. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 81 8

1. ÚVOD Tématem této práce je studium fosfatasové aktivity v rostlinných tkáních. 1.1. FOSFOR A JEHO VÝZNAM PRO ROSTLINY Jeden z nejvýznamnějších prvků pro růst rostlin, fosfor, je zároveň také jedním z prvků nejméně dostupných. Autotrofní organismy, kterými jsou i rostliny, získávají minerální živiny přímo z prostředí. Fosfor tak získávají ve formě fosfatového aniontu (P i ). [ 1] Hydrolýza monoesterů fosfátu v organismech je klíčovým procesem těsně svázaným s energetickým metabolismem, metabolickou regulací a širokým spektrem buněčných signálních drah. P i je také významnou strukturní jednotkou mnoha biomolekul. Z toho důvodu jsou asimilace, ukládání a metabolismus P i nezbytné pro růst a vývoj rostliny. Fosfatasy se podílí na získávání a zužitkování fosfátu. Tyto všudypřítomné enzymy hydrolysují P i z monoesterů kyseliny fosforečné termodynamicky výhodným procesem ( G ' -9kJ mol -1 ). [ 2] 1.2. FOSFATASY Tradičně jsou fosfatasy klasifikované podle jejich optimálního reakčního ph jako alkalické a kyselé. [ 2] 1.2.1. ALKALICKÉ FOSFATASY Alkalické fosfatasy (EC 3.1.3.1) jsou zpravidla dimerní molekuly, které hydrolyzují široké spektrum monoesterů při ph optimu ~8. V 9

savčích buňkách nacházíme mnohé isozymy navázané na cytoplasmické membráně, oproti tomu bakteriální enzym je volný, postrádá kovalentní modifikace jako je glykosylace nebo napojení na mastnou kyselinu. Alkalická fosfatasa z E.coli (obr. 1) byla tak jednou z prvních blíže specifikovaných fosfatas. [ 2] Obrázek 1: Struktura aktivního místa alkalické fosfatasy z E.coli. Molekuly zinku tvoří dvoujaderné centrum, které je přemostěno odštěpovaným fosfátem. [ 2 ] Rostlinné alkalické fosfatasy zpravidla vykazují úplnou substrátovou specifitu. Příkladem této skupiny fosfatas jsou cytosolické fruktosa- 1,6-bisfosfatasa (EC 3.1.3.11) a sacharosa-6-fosfátfosfatasa (EC 3.1.3.24). Obě jsou součástí glukoneogenetické dráhy. [ 1, 3] 10

1.2.2. KYSELÉ FOSFATASY Oproti tomu kyselé fosfatasy (EC 3.1.3.2) většinou tak přísnou substrátovou specifitu nemají. Přesto je lze rozlišit do dvou skupin na základě jejich substrátových preferencí. [ 1] První skupinou jsou fosfatasy skutečně nespecifické. Vyskytují se v širokém spektru rostlin a pletiv a značně se mezi sebou liší na základě jejich fyzikálních vlastností. Všechny však hrají význačnou roli v produkci, transportu a recyklaci P i. [ 1] Druhou skupinou kyselých fosfatas jsou specializované enzymy, jako jsou 3-P-glycerátfosfatasa (EC 3.1.3.38) nebo fosfoenolpyruvátfosfatasa (EC 3.1.3.60); Obě vykazují jasnou preferenci substrátu, jsou ale schopné defosforylovat i jiné substráty. Fosfatasy z této skupiny mívají jasně odlišitelné metabolické funkce. [ 1] 1.2.2.1. Extracelulární kyselé fosfatasy Extracelulární fosfatasy se mohou nacházet v buněčných stěnách, nebo být vylučované povrchem kořenů do okolní půdy. Fosfatasy vylučované kořeny jsou zodpovědné za získávání fosfátových iontů z organických i anorganických zdrojů. Funkcí fosfatas v buněčných stěnách by mohlo být vychytávání fosfatových iontů z mezibuněčných prostor. [ 1] Významnou skupinou kyselých fosfatas jsou purpurové kyselé fosfatasy (EC 3.1.3.2) jsou snadno rozlišitelné od ostatních kyselých fosfatas díky fialovému zabarvení, které má jejich roztok. To je způsobeno přítomností aktivního centra se dvěma ionty kovů V případě savčích enzymů existuje aktivní centrum ve dvou formách - oxidované Fe III -Fe III centrum je fialové a vykazuje jen malou aktivitu 11

(obr. 2); redukovaná Fe II -Fe II forma je růžová a enzymaticky aktivní. V případě fosfatas rostlinných aktivní centrum obsahuje železitý a zinečnatý iont. Tyto enzymy se také odlišují jejich resistencí vůči vinanu, což je silný inhibitor dalších kyselých fosfatas. [ 2] Obrázek 2: Předpokládaná struktura oxidované formy aktivního centra se dvěma ionty železa v savčích purpurových kyselých fosfatasách. [ 2 ] Purpurové kyselé fosfatasy se řadí mezi extracelulární, jsou vázané v buněčných stěnách a vylučovány kořeny do půdy. [ 4] Nedávná studie ukázala, že při nedostatku fosfátu vykazuje tabák zvýšenou phytasovou aktivitu (viz níže). Kyselina phytová je důležitý zdroj fosfátových iontů v semenech a pylu, vyskytuje se ale také ve zvýšeném množství v půdě. V půdě s nízkým obsahem fosfátu kořeny tabáku vylučují zvýšené množství kyselé fosfatasy, která phytát defosforyluje. [ 5] 1.2.2.2. Intracelulární kyselé fosfatasy Intracelulární kyselé fosfatasy (EC 3.1.3.2) se zdají být všudypřítomné. Jejich přítomnost byla dokázána v semenech, listech, 12

stoncích i kořenech, květech i plodech a zásobních hlízách rostlin. Na základě jejich optimálního ph, které se zpravidla nachází mezi 5 a 6, je možné soudit, že se v buňce kyselé fosfatasy vyskytují především ve vakuolách. Tomu nasvědčují i další výzkumy [6]. Kompartmentace fosfatas do rostlinných vakuol umožňuje enzymu přístup jen k těm substrátům, které jsou skladovány ve vakuolách. Zároveň je tak buňka chráněna před značným poškozením, které by mohlo nastat při nekontrolované fosfatasové aktivitě v cytoplasmě. Některé studie ale ukázaly, že se kyselé fosfatasy v buňce mohou nacházet i v cytoplazmě, tzn. kyselé ph optimum fosfatas nezabraňuje fosfatasám fungovat v prostředí nekyselých metabolických kompartmentů. [ 1] 1.2.2.3. Specializované fosfatasy Existují specializované typy intracelulárních kyselých fosfatas, které mají zřetelnou, i když ne absolutní substrátovou specifitu. Předpokládá se, že mají více specializovanou metabolickou funkci, než fosfatasy bez jakékoli specifity. [ 1] 1.2.2.4.a Phytasy Kyselina phytová (inositol hexafosfát - obr. 3) je důležitým zdrojem fosfátu a inositolu v klíčících semenech. Její štěpení zprostředkovávají enzymy phytasy (EC 3.1.3.8). Na rozdíl od jiných specializovaných kyselých fosfatas jsou phytasy poměrně nespecifické vůči dalším substrátům a dokážou s podobnou účinností hydrolysovat spektrum přírodních i syntetických fosfoesterů. Kyselé fosfatasy v klíčících semenech tak jsou nazývané phytasami především proto, že kyselina phytová je jejich nejčastější substrát v přirozených podmínkách. [ 1] 13

Obrázek 3: Kyselina phytová. [ 5 ] 1.2.2.4.b Fosfoglykolátfosfatasa Fosfoglykolátfosfatasa (EC 3.1.3.18) se, na rozdíl od jiných kyselých fosfatas, vyznačuje absolutní substrátovou specifitou vůči svému substrátu. Fosfoglykolátfosfatasa katalyzuje konverzi P-glykolátu na glykolát, tato reakce je součástí fotorespirační dráhy. [ 1] 1.2.2.4.c 3-fosfoglycerátfosfatasa Přítomnost tohoto enzymu (EC 3.1.3.38) byla prokázána v desítkách rostlinných druhů. Katalyzuje odštěpení P i z molekuly 3- fosfoglycerátu a poskytuje tak alternativní metabolickou dráhu od glycerátu k serinu namísto fotorespirace a glykolátové dráhy v listech. Tento enzym preferuje 3-fosfoglycerát jako substrát, katalyzuje však hydrolýzu i dalších fosfoesterů. [ 1] 1.2.2.4.d Fosfoenolpyruvátfosfatasa PEP-fosfatasa (EC 3.1.3.60) defosforyluje i jiné substráty než PEP, má však k němu mnohem vyšší afinitu ve srovnání s jinými fosfoestery. 14

Zdá se také, že o PEP při nízké hladině P i iontů soupeří s cytosolickou pyruvátkinasou, která zprostředkovává přenos Pi z PEP na ADP. V případě vážného nedostatku P i iontů je pyruvátkinasa z důvodu nedostatku substrátu ADP téměř neaktivní a defosforylaci PEP zprostředkovává PEP-fosfatasa. Tato energeticky náročná adaptace umožňuje rostlinám při nedostatku P i iontů využívat fosfátové ionty získané z katabolismu adenylátů, a tak nedochází k narušení konverze PEP na pyruvát. Zdá se také, že zastává roli recyklačního systému, který hydrolyzuje (volné) fosfoestery. Získané P i ionty jsou pak reasimilovány do metabolismu hladovějících buněk. [ 7] 1.2.3. PROTEINFOSFATASY Modifikace proteinů fosforylací a defosforylací je významným regulačním mechanismem pro rozličné buněčné funkce. Proteinové fosfatasy (EC 3.1.3.16) ovlivňují metabolismus rostlin i dalších organismů jak v krátkých časových úsecích, tak dlouhodobě. Jsou součástí mnoha signálních drah a zapojují se například do odpovědi rostlin na stresové podmínky. [ 8] Proteinfosfatasy dělíme podle jejich substrátové specifity na fosfatasy defosforylující serylové a threonylové zbytky a na fosfatasy, které defosforylují zbytky aminokyseliny tyrosinu. Existují také proteinfosfatasy s podvojnou specifitou (obr. 4). [ 9] Některé proteinové fosfatasy obsahují, podobně jako kyselé purpurové fosfatasy, centra se dvěma ionty kovů. Příkladem je Ser/Thr fosfatasa typu 2B, která obsahuje centrum s iontem železa a zinku. [ 2] 15

Obrázek 4: Rozdělení proteinfosfatas podle substrátové specifity. Serylové a threonylové zbytky jsou defosforylovány proteinfosfatasami skupin PPP, PPM a DSP. Proteinfosfatasy skupiny DSP také, spolu s proteinfosfatasami skupiny PTP, defosforylují tyrosylové zbytky. [ 9 ] 1.2.3.1. Ser/Thr proteinfosfatasy Ser/Thr proteinfosfatasy se dělí na základě homologie genů do dvou skupin. Do první skupiny genů patří navzájem příbuzné enzymy skupin PP1, PP2A a PP2B, které jsou ovlivňované kalcineurinem a komplexem kalmodulinu s vápenatými ionty. Druhou skupinou je PPM, která zahrnuje enzymy rodiny PP2C a několik dalších Ser/Thr fosfatas ragulovatelných hořečnatými ionty. Na základě farmakologických vlastností a substrátové specifity vůči podjednotkám fosforylasy-kinasy můžeme Ser/Thr dělit do dvou hlavních skupin, PP1 a PP2A. Skupina PP2 se dále rozpadá do třech 16

dalších podle jejich závislosti na dvoumocných kationtech. Při rozlišování hrají roli i inhibitory, jako je kyselina okadaová, kaliculin A a cantharidin. [ 9; 10; 11] Studie rostlinných fosfatas prokázaly přítomnost proteinfosfatas, které odpovídají fosfatasam PP1 a PP2A z živočišných buněk. [ 8] Rostlinné proteinfosfatasy typu PP1 a PP2A (obr. 5 a 6) zprostředkovávají defosforylaci a regulaci několika cytosolických enzymů, jako je sacharosa-6-p synhtasa, PEP karboxylasa nebo chinát dehydrogenasa. [ 8] Obrázek 5: Model krystalové struktury proteinové fosfatasy typu 1s navázaným peptidem: kruh - katalytické centrum; trojúhelníky - tři žlábky vybíhající z katalytického centra. [ 1 2 ] 17

Obrázek 6: Model proteinové fosfatasy typu 2A: zelená - katalytická podjednotka PP2Ac; žlutá - regulační podjednotka A; modrá - regulační podjednotka B [ 1 3 ] Funkce proteinových fosfatas přímo ovlivňuje růst rostliny, například fosfatasa prvního typu ovlivňuje tepelnou citlivost rostlin [ 14], životní cyklus buněk, syntézu proteinů a metabolismus při sníženém množství živin. V živočišných buňkách je součástí metabolismu glykogenu. [ 13] Spolu s proteinfosfatasou typu 2A dále reguluje přenos signálu kyseliny abscisové [ 15] a transmembránový přenos draselných iontů v mesofylových buňkách listů [ 16]. Proteinfosfatasa typu 2A reguluje auxinový transport [ 17, 18], podílí se na procesu dělení buňky [ 19, 20]. Dále také ovlivňuje časové řízení kvetení [ 21] a zlepšuje schopnost rostlin reagovat na stres suchem [ 22], patogeny [ 23], nebo chladem. [ 24] 18

Jednou z funkcí proteinové fosfatasy typu 2A je také defosforylace fosfoenolpyruvát karboxylasy. Té se budu věnovat později. Na stres reagují také fosfatasy typu 2C z rodiny PPM. V případě stresu suchem je jejich exprese silně zvýšená, oxidativní stres a horko naopak způsobují snížení exprese. [ 25] Ovlivňují také dráhu kyseliny abscisové a funkce rostlinného meristému. [ 26] 1.2.3.2. Proteinfosfatasová aktivita kyselých fosfatas Byla zaznamenána i fosfatasová aktivita kyselých fosfatas vůči fosforylovaným aminokyselinám a fosfoproteinům. Některé kyselé fosfatasy jsou aktivní vůči P-serinu a P-threoninu. [ 1] Lidská kyselá fosfatasa z plazmatické membrány nádorových astrocytů je striktně specifická vůči P-tyrosinu, rostlinné kyselé fosfatasy takovou specifitu nevykazují [ 27]. Přesto je však jejich afinita k P- tyrosinu vyšší, než k dříve zmiňovaným fosforylovaným aminokyselinám. V rostlinných pletivech se také nacházejí v hojném množství. [ 1] 1.3. VÝZKUM FOSFATASOVÉ AKTIVITY Přesné fyziologické role rostlinných fosfatas je kvůli jejich rozmanitosti a všudypřítomnosti těžké určit. Nejčastějším substrátem pro in vitro zkoumání fosfatasové aktivity je para-nitrofenylfosfát (pnp-fosfát - obr. 7). [ 1] Dalšími používanými substráty jsou ADP, ATP, glukosa-6-fosfát a fosfoenolpyruvát, P-serin a P-tyrosin. 30, 31, 32, 33] [ 7, 28, 29, 19

Obrázek 7: Para-nitrofenylfosfát. [ 5 ] Dosavadní výzkumy rostlinných kyselých fosfatas se věnovaly mimo jiné vlivu iontů na fosfatasovou aktivitu. Vesměs se shodují na tom, že vlivem hořečnatých a vápenatých iontů dochází ke zvýšení enzymové aktivity. Zinečnaté, železité a měďnaté ionty naopak způsobovaly snížení aktivity, stejně tak ionty olova, orthofosfát, askorbát, glutamát a aspartát. Vinan snižoval aktivitu kyselých fosfatas, s výjimkou purpurových kyselých fosfatas. Výzkumy se neshodují na vlivu molybdenátu na kyselé fosfatasy, některé mu přisoudily inhibiční vlastnosti, jiné nepozorovaly žádný vliv na aktivitu. Optimální ph kyselých fosfatas bylo stanoveno v hodnotách od 5 do 5,8, tedy v kyselém prostředí. Většina kyselých fosfatas je glykosylovaná, proto byla při jejich purifikaci často využívaná afinita ke konkanavalinu A. [ 7, 28, 29, 30, 31, 32, 33] Pro výzkum proteinových fosfatas se dále používají fosfokasein, fosfohiston a syntetické peptidové substráty. Polya a kol. uvádí, že proteinfosfatasy z klíčků pšenice nereagují s neproteinovými monofosfáty, uvádí také, že přítomnost hořečnatých a vápenatých iontů aktivitu fosfatas nijak nestimulovala. [ 34] V jiných případech jsou úspěšně používány i nízkomolekulární substráty. [ 35, 36] 20

Podobně jako kyselé fosfatasy jsou i ty proteinové inhibovány zinečnatými ionty, volným fosfátem, vanadátem a molybdenátem a ionty rtuti. Dalšími inhibitory jsou pro proteinové fosfatasy specifické kyselina okadaová (obr. 8), L-mikrocystin (obr. 9), kaliculin A (obr. 10) a cantharidin (obr. 11). Inhibitory proteinových fosfatas 1 a 2 jsou dva tepelně stálé proteiny získávané z jater a svalové tkáně. Tyto fosfatasy vykazují alkalické ph optimum. [ 2] [ 11, 35, 36] Obrázek 8: Struktura kyseliny okadaové. [ 3 7 ] Obrázek 9: Struktura mikrocystinu-lr. [ 3 8 ] 21

Obrázek 10: Struktura kaliculinu A. [ 3 9 ] Obrázek 11: Struktura cantharidinu. [ 4 0 ] 1.4. PROTEINFOSFATASA DEFOSFORYLUJÍCÍ FOSFOENOLPYRUVÁTKARBOXYLASU Aktivita fosfoenolpyruvátkarboxylasy (PEPC) a její kinetické vlastnosti jsou regulovány specifickou reversibilní fosforylací přesně stanoveného serylového zbytku poblíž N-koncové části proteinu. Fosforylace je zprostředkována specifickou Ser/Thr kinasou (PEPCk). Defosforylace probíhá za účasti proteinfosfatasy typu 2A (obr. 12). [ 4 1, 4 2] 22

Obrázek 12: Schéma regulace fosforylace PEPC [ 4 3 ] Biochemické a imunologické výzkumy ukazují podobnost této fosfatasy PP2A enzymům v dalších eukaryotických organismech. Tak jako ostatní proteinfosfatasy typu 2A se skládá z dimeru regulační podjednotky A a katalytické podjednotky PP2Ac, na který se váže regulační podjednotka typu B. Fosfatasová aktivita tohoto enzymu je nezávislá na na iontech kovů a netečná vůči inhibitorům, které působí na proteinfosfatasu typu 1, levamisolu a I-2 proteinu. Vykazuje naopak velkou citlivost vůči inhibici kyselinou okadaovou a mikrocystinem-lr. Polykationty jako protamin nebo poly-l-lysin enzym aktivují. [ 42] 23

Důležitou vlastností této proteinfosfatasy je absence striktní substrátové specifity vůči PEPC. Tím se liší od PEPC-kinasy, která je vůči svému substrátu vysoce specifická. [ 42] V případě PEPC neslouží fosforylace enzymu jako "zapnutí" do aktivního stavu, ale změnu kinetických vlastností. To může znamenat zvýšení afinity enzymu k substrátu, zvýšení maximální rychlosti reakce, zvýšení citlivosti vůči aktivaci glukosa-6-fosfátem a naopak snížení citlivosti vůči inhibici malátem, změnu Hillova koeficientu. Tato změna se pravděpodobně neprojevuje stejně pro všechny PEPC, ale závisí na typu a funkci enzymu z jednotlivých rostlinných druhů. Například purifikovaná PEPC z listů tabáku je ve fosforylované formě aktivnější a dosahuje vyšší maximální reakční rychlosti, nemění se ale její citlivost vůči malátu. Oproti tomu PEPC ze semen kukuřice ve své fosforylované formě vůči malátu citlivější je. Zajímavý je také rozdíl v závislosti rychlosti reakce na koncentraci substrátu PEP, kinetika defosforylované formy je sigmoidální. [ 43, 44, 45, 46, 52, 53] 24

2. CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce bylo: 1) Optimalizovat podmínky extrakce fasfatas z listů tabáku, rozdělit fasfatasy na glykosylované a neglykosilované. 2) Zjistit substrátovou specifitu fosfatas připravených z listů tabáku vůči pnp-fosfátu a dalším nízkomolekulárním substrátům. 3) Zjistit, zda jsou substrátem fosfatas z tabáku proteiny s vysokým obsahem fosfátu. 4) Zjistit, zda působí fosfatasy z listů tabáku defosforylaci fosfoenolpyruvátkarboxylasy ze semen kukuřice. 25

3. MATERIÁL A METODY 3.1. MATERIÁL A PŘÍSTROJE 3.1.1. ROSTLINNÝ MATERIÁL Rostliny Nicotiana tabacum L. cv. Petit Havana, SR1, byly laskavě poskytnuty RNDr. Helenou Synkovou, CSc. Ústav experimentální botaniky AV ČR (ÚEB AV ČR) Semena Zea mays L. cv. CE 205 S ve formě kukuřičné mouky 3.1.2. CHEMIKÁLIE A ENZYMY 4-nitrophenylfosfát disodná sůl hexahydrát (pnp-fosfát) - Fluka, Velká Británie Adenosintrifosfát (ATP) - Sigma, USA Akrylamid - Sigma, USA Bradfordové činidlo - Sigma, USA Con A Sepharosa - Pharmacia, Švédsko Coomasie Brilliant Blue R250 (CBB) - Sigma, USA Dithiothreitol (DTT) - Sigma, USA Dodecylsíran sodný (SDS) - Sigma, USA Ethanol - Lach-ner, ČR Ethylendiamintetraacetát (EDTA) - Lachema, ČR Fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) - Sigma, USA Fosfoenolpyruvát sodný (PEP) - Sigma, USA Fosfo-L-serin - Sigma, USA Fosvitin - Sigma, USA Glycerol - Penta, ČR Glycin - Degussa, ČR Glukosa-6-fosfát - Sigma, USA Hovězí sérový albumin (BSA) - Sigma, USA Kasein z hovězího mléka - Sigma, USA 26

Kyselina octová - Lach-ner ČR L-malát sodný - Sigma, USA Malátdehydrogenasa (M2634-5KU; 700U/mg) - Sigma, USA MgCl 2 - Sigma, USA N, N, N', N' - tetramethylendiamin (TEMED) - Serva, USA N, N'-methylenbisakrylamid - Sigma, USA NaCl - Penta, ČR NADH - Sigma, USA NaHCO 3 - Lachema, ČR Peroxodisíran amonný - Boehringer, Německo Polyvinylpyrrolidon (PVP) - Sigma, USA Standardní proteiny pro elektroforetickou separaci v prostředí SDS - Serva, Německo Tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) - Sigma, USA Trypsin - Merck, Německo Ostatní chemikálie - Lachema, ČR; Sigma, USA 3.1.3. PŘÍSTROJE Analytické váhy 100A Denver Instrument Company, USA Centrifuga Univerzal 32 R Hettich, Německo Elektroforetická souprava Whatman Biometra, Německo Inkubátor se suchou lázní Elite Schoeller instruments, Velká Británie ph metr Ultrabasic UB 10 Denver Instrument Company, USA Spektrofotometr Ultrospec 2100 Amersham Pharmacia Biotech, Velká Británie Magnetická míchačka Labortechnik, Německo 27

3.2. METODY A POSTUPY 3.2.1. PŘÍPRAVA ENZYMU 3.2.1.1. Homogenizace a extrakce Extrakční podmínky ovlivňují aktivitu zkoumaného enzymu. Roli hraje nejen ph a použitý pufr, ale také přídavek látek, které napomáhají zachovat enzymovou aktivitu. PMSF a EDTA jsou inhibitory proteas. Zatímco PMSF inhibuje serinové proteasy, EDTA vychytává volné kovové ionty, a tak inhibuje metaloproteasy. DTT zabraňuje nežádoucí tvorbě disulfidických můstků. Prvním krokem v procesu přípravy enzymu je homogenizace rostlinného materiálu. Přibližně 3 g listů tabáku jsem rozmělnila ve třecí misce. Potom jsem přidala trojnásobek navážky listů tabáku v ml objemu extrakčního pufru o složení 50 mm Tris/HCl ph 8,1 nebo 50 mm acetátový pufr ph 4,9; 1 mm PMSF; 1 mm EDTA; 1 mm DTT. V případě zkoumání vlivu extrakční směsi na enzymovou aktivitu byly inhibitory proteas a DTT přidávány samostatně. Extrakce jsem prováděla paralelně ve dvou ph (ph 8,1 a ph 4,9) pro srovnání vlivu extrakčního ph na aktivitu vůči různým substrátům. K homogenátu jsem přidala malé množství PVP, který váže fenolické látky, které tak zůstávají v sedimentu. Zkumavky jsem potom centrifugovala 15 min při 15000 g, 4 C. Před dalším postupem jsem oddělila a uchovala 1 ml supernatantu pro další měření. Tuto frakci jsem označovala 'hrubý extrakt' HE. 3.2.1.2. Afinitní chromatografie na Con A Sepharose Lektiny jsou skupina proteinů, které dokážou reversibilně vázat specifické cukerné zbytky. Imobilizované lektiny jsou nedocenitelným nástrojem při 28

izolaci a separaci glykoproteinů, glykolipidů, polysacharidů, ale i subcelulárních částic a buněk. [ 4 7 ] Lektin konkanavalin A je tetramerní metaloprotein, který specificky váže molekuly obsahující α-d-mannopyranosylové a α-d-glukopyranosylové struktury a stericky podobné cukerné zbytky. Imobilizovaný na Sepharose tak umožňuje separovat glykosylované molekuly. [ 4 7 ] Do kolony o objemu 10 ml jsem nalila přibližně 5 ml Con A Sepharosy. Tento chromatografický nosič jsem ekvilibrovala 50 ml základního pufru (0,02 M Tris/HCl ph 7; 0,5 M NaCl). Kolonu jsem následně promývala 50 ml pufru I (základní pufr s přídavkem 1 mm CaCl 2, 1 mm MnCl 2 ). Na kolonu jsem nanesla HE a nechala zapustit. Od nanesení HE jsem začala jímat eluovaný roztok do kalibrovaných zkumavek do frakcí o objemu přibližně 4 ml. Průběžně jsem měřila obsah proteinů pomocí absorbance při vlnové délce 280 nm (A 2 8 0 ) proti pufru I. Jakmile se hodnoty A 2 8 0 přiblížily nule, začala jsem kolonu promývat pufrem II (základní pufr s přídavkem 0,2 M α-d-methylglukosid), čímž jsem uvolnila navázané proteiny z nosiče, a eluované frakce jsem zachytávala po 2 ml objemu. Obsah proteinů jsem tentokrát měřila proti pufru II. Když se A 2 8 0 opět přiblížila nulovým hodnotám, chromatografii jsem ukončila. Pro každou frakci jsem pak provedla stanovení fosfatasové aktivity vůči pnp-fosfátu (viz kapitola 3.4.2.). Frakce s nejvyšší aktivitou, zvlášť pro nezachycené a pro zachycené proteiny, jsem pak spojila. ConA- jsem označovala frakci nezachycených, neglykosylovaných proteinů, ConA+ potom frakci proteinů na koloně zachycených, glykosylovaných. Pro ConA+, ConA- a HE jsem znovu změřila fosfatasovou aktivitu a stanovila jsem množství bílkovin metodou podle Bradfordové (kapitola 3.4.1.3.). 29

3.2.1.3. Stanovení množství proteinů Stanovení množství proteinů podle Marion Bradfordové využívá posunu maxima absorbance barvy Coomassie Brilliant Blue G-250 z 465 nm na 595 nm, ke kterému dochází při navázání aminokyseliny argininu a hydrofobních aminokyselin. Pro měření jsem vytvořila kalibrační křivku z roztoků hovězího sérového albuminu (BSA). [ 4 8 ] Pro stanovení obsahu proteinů jsem 25 min inkubovala 33 µl vzorku s 1 ml činidla Bradfordové. Absorbanci jsem měřila při 595 nm. Jako referenční vzorek sloužilo 33 µl příslušného pufru. 3.2.2. STANOVENÍ FOSFATASOVÉ AKTIVITY Jako substrát pro měření fosfatasové aktivity byl používán pnp-fosfát, fosfoderivát chromoforu para-nitrofenolu (pnp). Ten má žluté zabarvení, které lze po odštěpení fosfátové skupiny měřit při vlnové délce 405 nm. Reakční směs obsahovala 100 µl 100 mm citrátového pufru ph 5,5, 25µl destilované vody a 50 µl 20 mm pnp-fosfátu. Reakce byla zahájena přidáním 25 µl testovaného vzorku do reakční směsi. Po deseti minutách byla reakce ukončena přidáním 800 µl 0,1 M borátového pufru ph 9,0. Jako referenční vzorek pro měření A 4 0 5 sloužila reakční směs, do které byl zkoumaný vzorek přidán až po zastavení borátovým pufrem. Reakce probíhala při laboratorní teplotě. Specifická aktivita byla vypočtena jako aktivita vztažená na 1 mg proteinu. Molární absorbční koeficient pnp ε 4 0 5 =1,8.10 4 mol -1.l.cm -1. 3.2.2.1. Stanovení fosfatasové aktivity v závislosti na ph Pro získání požadované škály ph byla připravena řada 100 mm citrátových pufrů v rozsahu ph 3-6,5 a řada 100 mm Tris-HCl pufrů v rozsahu ph 7-8,7. Pro stanovení fosfatasové aktivity v závislosti na ph byl využit obdobný postup jako v kapitole 3.4.2. 30

3.2.2.2. Stanovení fosfatasové aktivity v závislosti na koncentraci substrátu Reakční směs pro stanovení aktivity v závislosti na koncentraci substrátu obsahovala 100 µl 100 mm citrátového pufru ph 5,5. Dále bylo přidáno takové množství 20 mm pnp-fosfátu, aby byla vytvořena škála koncentrací substrátu v hodnotách 0,5-7 mm. Směs byla doplněna na 175 µl destilovanou vodou. Dále byl postup obdobný jako v kapitole 3.4.2. 3.2.3. STANOVENÍ FOSFATASOVÉ AKTIVITY VŮČI DALŠÍM SUBSTRÁTŮM Kromě pnp-fosfátu jsem zkoumala i aktivitu získaných enzymů vůči dalším nízkomolekulárním substrátům (fosfoserin /P-serin/, adenosintrifosfát /ATP/ a glukosa-6-fosfát /G6P/) a vůči fosforylovaným proteinům (kasein, phosvitin). 3.2.3.1. Stanovení volného fosfátu Měření fosfatasové aktivity vůči jiným substrátům, než je pnp-fosfát, je založené na stanovení volného fosfátu. Volný fosfát reaguje s molybdenanem amonným a tvoří spolu bezbarvý komplex (NH 4 ) 3 PO 4 12MoO 4. Ten je redukován na barevný komplex, jehož přítomnost lze měřit při vlnové délce 660 nm. [ 4 4 ] Během stanovování volného fosfátu ve vzorku bylo do 200 µl zjišťovaného vzorku postupně přidáno 100 µl 5 M H 2 SO 4, 200 µl 2% (NH 4 ) 2 MoO 4, 10 µl čerstvě připraveného redukčního činidla a 490 µl destilované vody. Redukční činidlo se skládá z 0,2 g 1-amino-2-naftol-4-sulfonové kyseliny, 1,2 g NaHCO 3 a 1,2 g Na 2 SO 3. Před měřením je vždy připravován čerstvý roztok rozpuštěním 0,025 g prášku v 1 ml vody. Reakce běžela po dobu 15 min a poté byla změřena absorbance při vlnové délce 660 nm. Pro stanovení množství uvolněného fosfátu byla s pomocí fosfátového pufru sestrojena kalibrační přímka o koncentraci 0,01-0,2 mm (obr. 13). 31

Obrázek 13: Kalibrační křivka pro stanovení volného fosfátu. 3.2.3.2. Stanovení aktivity vůči nízkomolekulárním substrátům Reakční směs obsahovala 100 µl 100 mm citrátového pufru ph 5,5, 25 µl destilované vody a 50 µl 20 mm substrátu (P-serin, ATP nebo G6P). Reakce byla zahájena přidáním 25 µl enzymu. Po 15 minutách byla ukončena přidáním 100 µl 5 M H 2 SO 4, což je první krok ke stanovení volného fosfátu, jak je popsané v kapitole 3.4.3.2. Stanovování závislosti fosfatasové aktivity v závislosti na ph a na koncentraci substrátu probíhalo analogicky k postupům v kapitolách 3.4.2.1. a 3.4.2.2., jen namísto zastavení reakce přidáním borátového pufru byla reakce zastavena přidáním 5 M H 2 SO 4, jak je uvedeno výše. Jako referenční vzorek vždy sloužil vzorek bez přidaného substrátu. 3.2.3.3. Stanovení aktivity vůči fosvitinu Reakční směs pro stanovení fosfatasové aktivity obsahovala 100 µl 100 mm citrátového pufru ph 5,5, 25 µl destilované vody a 50 µl 0,1 mm fosvitinu. Reakci jsem zahájila přidáním 25 µl enzymu. Po 15 minutách byla 32

ukončena přidáním 100 µl 5 M H 2 SO 4 a pokračovala stanovením volného fosfátu, jak je popsané v kapitole 3.4.3.2. Stanovování závislosti fosfatasové aktivity v závislosti na ph a na koncentraci substrátu odpovídalo postupům v kapitolách 3.4.2.1. a 3.4.2.2. Namísto zastavení reakce přidáním borátového pufru byla reakce zastavena přidáním 5 M H 2 SO 4, jak je uvedeno výše. Jako stanovení jsem použila shodnou reakční směs, do které nebyl přidán roztok substrátu. 3.2.3.4. Příprava roztoku kaseinu a stanovení fosfatasové aktivity vůči kaseinu V 90 ml vody s přídavkem 2 ml 1 M NaOH jsem na vodní lázni rozpouštěla 5 g kaseinu. Po 9 hodinách jsem roztok zfiltrovala přes gázu a doplnila na 100 ml vodou, čímž jsem získala 5% roztok. [ 4 9 ] Stanovovala jsem fosfatasovou aktivitu vůči kaseinu podle postupu uvedeného v kapitole 3.4.3.2., jen s použitím 1 mm a 0,5 mm substrátu. Vedle kaseinu jako substrátu jsem si připravila tryptické štěpy kaseinu. 350 µl 5% kaseinu jsem smísila s 40 µl 2% roztoku trypsinu a nechala inkubovat při 36 C po dobu 2 a 24 hodin. Tyto peptidy jsem rovněž testovala jako možné substráty fosfatasové aktivity. [ 4 9 ] 3.2.4. ELEKTROFORETICKÉ METODY Elektroforéza je metoda založená na schopnosti nabitých částic pohybovat se stejnosměrným elektrickým polem. Rychlost, kterou se částice pohybují, závisí na velikosti molekuly a na velikosti jejího náboje. Jako nosič se většinou používá polyakrylamidový gel, který vzniká kopolymerací akrylamidu a N,N'-methylenbisakrylamidu. Gel je pevný a čirý a důležitou vlastností je i jeho inertnost. 33

3.2.4.1. Elektroforetická separace v prostředí SDS SDS-PAGE je elektroforetická separace, která probíhá v prostředí polyakrylamidového gelu. Při SDS-PAGE elektroforéze dochází k rozdělení proteinů podle velikosti. Přítomen je detergent SDS, který překrývá náboj proteinu a poskytuje mu jednotný záporný náboj. SDS-elektroforéza byla prováděna metodou podle Ulricha K. Laemmliho. [ 5 0] Ke vzorkům (HE, ConA-, ConA+) byl přidán SDS vzorkový pufr v poměru 1:1. Před nanesením na gel byly vzorky krátce přivedeny k varu. Byl použít 3% zaostřovací gel a 12% gel separační. Separace probíhala na elektroforetické soupravě Multigel Biometra v SDS elektrodovém pufru. Vzorky jsem do jamek nanášela pomocí Hamiltonovy stříkačky v takových objemech, aby jednotlivé vzorky odpovídaly přibližně stejnému množství proteinů. Elektroforéza probíhala při napětí 70 V pro zaostřovací gel, pro separační gel bylo napětí zvýšeno na 140 V. SDS vzorkový pufr obsahoval: 0,5 M Tris-HCl pufru ph 6,8; 100 mm DTT; 10% SDS; 20% glycerolu; 0,1 % bromfenolové modři. SDS elektrodový pufr obsahoval: 25 mm Tris pufru ph 8,3; 250 mm glycinu; 3,5 mm SDS. 3% zaostřovací gel se skládal z: 3 ml H 2 O; 0,4 ml 30% akrylamidu; 0,5 ml 1,0 M Tris/HCl pufru ph 6,8;- 40 µl 10% SDS; 8 µl TEMED; 40 µl 10% persíranu. 12% separační gel se skládal z: 4,9 ml H 2 O; 6,0 ml 30% akrylamidu; 3,8 ml 1,5 M Tris/HCl pufru ph 8,8; 150 µl 10% SDS; 6 µl TEMED; 150 µl 10% persíranu. Roztok persíranu musel být připravován vždy čerstvý. 34

3.2.4.2. Detekce proteinů na polyakrylamidovém gelu Separační gel jsem opatrně opláchla a vložila do barvící lázně obsahující Coomasie Brilliant Blue. Po obarvení byla přebytečná barva vymývána odbarvovacím roztokem. Barvící lázeň obsahovala: 2 g Coomasie Brilliant Blue R 250; 0,5 g Coomasie Brilliant Blue G 250; 425 ml ethanolu; 100 ml kyseliny octové; 50 ml methanolu; 425 ml H 2 O. Odbarvovací roztok se skládal z: 650 ml H 2 O; 250 ml ethanolu; 100 ml kyseliny octové. 3.2.5. VLIV FOSFATASOVÉ AKTIVITY NA PEPC ZE SEMEN KUKUŘICE 3.2.5.1. Příprava PEPC Ke 30 g homogenizovaných kukuřičných semen jsem přidala 200 ml pufru A (100 mm Tris-HCl ph 7,8; 1 mm DTT; 1 mm EDTA; 5 mm MgCl2; 5% glycerol) a vše lehce míchala po dobu 30 min. Po přefiltrování přes dvě vrstvy gázy jsem extrakt centrifugovala 45 min při 9600 g a 4 C. Provedla jsem precipitaci síranem amonným při hodnotách nasycení 30% a 60%. Po každém srážení byl roztok centrifugován 45 min při 9600 g a 4 C. Precipitát získaný po 60% nasycení jsem resuspendovala ve 2 ml pufru B (25 mm Tris-HCl ph 7,8; 0,5 mm DTT; 5 mm MgCl2; 1 mm EDTA; 5% glycerol). 3.2.5.2. Stanovení aktivity PEPC Aktivitu PEPC jsem měřila spřaženou reakcí s malátdehydrogenasou (MDH) jako pokles absorbance při 340 nm. Reakční směs pro detekci aktivity obsahovala 100 mm Tris-HCl ph 8,1; 5 mm NaHCO3; 2 mm MgCl2; 0,2 mm NADH; 2 mm PEP; ~4 U MDH v celkovém objemu 1 ml. 35

Výsledná rychlost reakce byla získána lineární regresí 10 měření absorbance v průběhu 3 minut. 3.2.5.3. Vliv defosforylace na aktivitu PEPC 250 µl PEPC jsem smísila v poměru 1:1 s fosfatasou a průběžně po dobu 2 h sledovala vliv defosforylace stanovením aktivity PEPC, jak je popsáno v kapitole 3.4.5.2. Jako referenční vzorek mi sloužila směs 1:1 PEPC s pufrem (0,02 M Tris/HCl ph 7; 0,5 M NaCl). Ta byla používána jako paralelní vzorek pro navazující měření. 3.2.5.4. Stanovení inhibice PEPC malátem Reakční směs obsahovala 100 mm Tris-HCl ph 7,3; 5 mm NaHCO3; 2 mm MgCl2; 0,2 mm NADH; 2 mm PEP; ~4 U MDH; 2 mm malát v celkovém objemu 1 ml. Jako referenční vzorek sloužila směs bez přídavku malátu. Aktivita PEPC byla stanovena metodou popsanou v kapitole 3.4.5.2. 3.2.5.5. Stanovení aktivace PEPC glukosa-6-fosfátem Reakční směs obsahovala 100 mm Tris-HCl ph 7,3; 5 mm NaHCO3; 2 mm MgCl2; 0,2 mm NADH; 0,2 mm PEP; ~4 U MDH; 2 mm G6P v celkovém objemu 1 ml. Jako referenční vzorek sloužila směs bez přídavku G6P. Aktivitu PEPC jsem stanovila metodou popsanou v kapitole 3.4.5.2. 3.2.6. STANOVENÍ KINETICKÝCH KONSTANT Kinetické parametry Michaelisovu konstantu (K m ) a maximální reakční rychlost (V li m ) jsem vypočítala nelineární regresí v programu MS Excel proložením experimentálních dat hodnotami vypočtenými z příslušné rovnice (rovnice 1). 36

Rovnice 1: v V K + m = lim [ S] [ S] v... reakční rychlost [S]... koncentrace substrátu V li m... maximální reakční rychlost K m... Michaelisova konstanta 37

4. VÝSLEDKY V této práci jsem se zabývala fosfatasovou aktivitou přítomnou v listech tabáku. Měření jsem prováděla jednak za použití chromogenního substrátu para-nitrofenylfosfátu, dále za použití fosforylovaných nízkomolekulárních látek. Enzymové preparáty s fosfatasovou aktivitou jsem také testovala, zda mají proteinfosfatasovou aktivitu. 4.1. PŘÍPRAVA FOSFATASY Z LISTŮ TABÁKU 4.1.1. STANOVENÍ ZÁVISLOSTI FOSFATASOVÉ AKTIVITY NA ČASE Stanovovala jsem časový průběh štěpení pnp-fosfátu při reakci katalyzované fosfatasami metodou popsanou v kapitole 3.2.2. Z obr. 14 je patrné, že je přírůstek p-np za dobu 20 min lineární a nedochází k jeho zpomalení. Pro další měření jsem tak mohla použít jakoukoli reakční dobu z tohoto intervalu. Obrázek 14: Závislost množství produktu p-np vzniklého defosforylací p-npp na čase. 38

4.1.2. OPTIMALIZACE EXTRAKCE FOSFATASOVÉ AKTIVITY Testovala jsem vliv extrakčních podmínek na fosfatasovou aktivitu. Použila jsem extrakci v kyselém prostředí (50 mm acetátový pufr ph 4,9) a v prostředí alkalickém (50 mm Tris/HCl pufr ph 8,1). Do těchto pufrů jsem ještě přidávala inhibitory proteas, 1 mm PMSF, 1 mm EDTA a/nebo redukční činidlo 1 mm DTT. Výsledky testování různých extrakčních podmínek na fosfatasovou aktivitu dokumentuje obr. 15. Fosfatasová aktivita měřená za standardních podmínek (pnp-fosfát 5 mm; ph 5,5; 25 C; 10 min) byla vyšší při použití alkalické extrakce než při použití extrakce kyselé. Při alkalické extrakci neměly jednotlivé inhibitory proteas a DTT podstatný vliv na fosfatasovou aktivitu, při použití v kombinaci došlo k 20% zvýšení aktivity. Při kyselé extrakci je patrný malý nárůst aktivity za použití jednotlivých inhibitor proteas, jejich kombinace pak už k dalšímu zvýšení aktivity nevedla. Obrázek 15: Vliv extrakčních podmínek na fosfatasovou aktivitu. 39

4.1.3. AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE NA KOLONĚ CON A SEPHAROSY Separaci na sloupci Con A Sepharosy jsem provedla způsobem popsaným v kapitole 3.4.1.2. Při ní došlo k oddělení glykosylovaných a neglykosylovaných proteinů z extrahované směsi. Separaci jsem prováděla pro enzymovou aktivitu získanou jak kyselou, tak alkalickou extrakcí. Na kolonu jsem nanesla přibližně 5 ml hrubého extraktu. Při chromatografii jsem jímala frakce o objemu přibližně 3 ml, v nich jsem průběžně sledovala obsah bílkovin měřením absorbance při vlnové délce 280 nm. Dále jsem ve frakcích proměřovala fosfatasovou aktivitu za standardních podmínek (pnp-fosfát 5 mm; ph 5,5; 25 C; 10 min). Na obrázcích 16 a 17 vidíme průběh chromatografie. Hlavní část enzymů s fosfatasovou aktivitou byla zachycena na sloupci Con A Sepharosy. Z něj byla eluována pomocí roztoku 0,2 M α-d-methylglukopyranosidu. Frakce s měřitelnou fosfatasovou aktivitou jsem spojila a změřila jejich výslednou aktivitu, specifickou aktivitu a obsah bílkovin. Výsledné hodnoty pro vzorky z alkalické i kyselé extrakce jsou uvedeny v tabulkách 1 a 2. Tabulka 1: Rozdělení fosfatasové aktivity na koloně Con A Sepharosy, pro alkalickou extrakci. Frakce Obsah proteinů [mg/ml] Aktivita [µmol/min*ml] Specifická aktivita [µmol/min*mg] Získaný objem [ml] HE 1,268 0,14 4,54 6 ConA- 0,524 0,01 0,73 6 ConA+ 0,023 0,12 205,99 6 40

Tabulka 2: Rozdělení fosfatasové aktivity na koloně Con A Sepharosy, pro kyselou extrakci. Frakce Obsah proteinů [mg/ml] Aktivita [µmol/min*ml] Specifická aktivita [µmol/min*mg] Získaný objem [ml] HE 0,426 0,11 10,77 5 ConA- 0,106 0,01 3,61 8 ConA+ 0,01 0,07 277,33 6 Obrázek 16: Chro matografická separace fosfatasové aktivity získané alkalickou extrakcí na sloupci Con A Sepharosy; obsah bílkovin - absorbance při 280 nm (modrá); fosfatasová aktivita (žlutá); E - eluce 0,2 M α-d-methylglukopyranosidem; ConA- - spojená neglykosylovaná frakce; ConA+ - spojená glykosylovaná frakce. 41

Obrázek 17: Chro matografická separace fosfatasové aktivity získané kyselou extrakcí na sloupci Con A Sepharosy; obsah bílkovin - absorbance při 280 nm (modrá); fosfatasová aktivita (žlutá); E - eluce 0,2 M α-d-methylglukopyranosidem; ConA- - spojená neglykosylovaná frakce; ConA+ - spojená glykosylovaná frakce. 4.1.4. ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE Zastoupení bílkovin v jednotlivých frakcích bylo sledováno elektroforetickou separací v prostředí SDS. Pro porovnání byly použity vzorky z extrakce pufrem Tris/HCl ph 8,1 a acetátovým pufrem ph 4,9; hrubý extrakt, nezachycená frakce (neglykosylovaná) a frakce zachycená na Con A Sepharose (glykosylovaná). Použitá metoda je popsaná v kapitole 3.2.4.1. Jako standardy relativních molekulových hmotností jsem použila albumin (66 000), ovalbumin (45 000), glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenasu (36 000), karbonát anhydrasa (29 000), trypsinogen (24 000), inhibitor trypsinu (20 000). Z obrázku č. 18 můžeme soudit, že glykosylovaná frakce (kcona+, acona+) obsahuje především molekuly o relativní molekulové hmotnosti přibližně 30 000. Lze také pozorovat slabší tenký proužek bílkovin o relativní molekulové hmotnosti přibližně 23 000. Širší slabší proužek 42

vidíme také v oblasti relativních molekulových hmotností okolo hodnoty 66 000. Dráhy hrubého extraktu (HE) a neglykosylované frakce (ConA-) jsou si navzájem podobné a můžeme na nich pozorovat větší množství bílkovin. Je také patrné, že při kyselé extrakci jsou získávány jiné proteiny než při extrakci alkalické. V případě vzorků získaných kyselou extrakcí (khe, kcona-) vidíme několik výraznějších proužků především v oblasti od 23 000 do 45 000. V drahách alkalické extrakce (ahe, acona-) můžeme pozorovat proužky 45 000 a 66 000 a větší množství bílkovin v nerozlišených vyšších hodnotách. Obrázek 18: Gel po elektroforetické separaci v denaturujícím prostředí barvený Coomasie Brilliant Blue; LM - standard; stbsa - standard BSA; kcona+ - glykosylovaná frakce z extrakce v ph 4,9; kcona- - neglykosylovaná frakce z extrakce v ph 4,9; khe - hrubý extrakt z extrakce při ph 4,9; acona+ - glykosylovaná frakce z extrakce v ph 8,1; acona- - neglykosylovaná frakce z extrakce v ph 8,1; ahe - hrubý extrakt z extrakce při ph 8,1. 43

4.2. CHARAKTERIZACE FOSFATASOVÉ AKTIVITY VŮČI SUBSTRÁTU PNP-FOSFÁT 4.2.1. VLIV PH PROSTŘEDÍ NA FOSFATASOVOU AKTIVITU Sledovala jsem fosfatasovou aktivitu glykosylované a neglykosylované frakce v rozsahu ph 3,0-8,7 (viz 3.2.2.1.) a to jak pro vzorky získané jak kyselou, tak alkalickou extrakcí. V případě alkalické extrakce (obr. 19) vidíme, že ph optimum fosfatasové aktivity leží při ph 5,5. Pro glykosylovanou frakci (ConA+) je nárůst aktivit v oblasti ph optima výrazný, a to především v kyselé oblasti, až o 40% na jeden stupeň ph. Směrem k alkalické oblasti je pokles pozvolnější, přesto však značný. Neglykosylovaná frakce (ConA-) má také ph optimum 5,5, nárůst i pokles aktivity je však méně výrazný, jen asi 20% na jeden stupeň ph. Obrázek 19: Závislost fosfatasové aktivity na ph pro substrát pnp-fosfát pro vzorky získané alkalickou extrakcí; ConA+ - glykosylovaná frakce (osa vlevo); ConA- - neglykosylovaná frakce (osa vpravo). 44

Vzorky získané kyselou extrakcí (obr. 20), a to jak glykosylované (ConA+), tak neglykosylované (ConA-), taktéž vykazovaly nejvyšší fosfatasovou aktivitu při ph 5,5. Pro glykosylovanou frakci byl nárůst opět velmi výrazný, a to především v kyselé oblasti až o 65% na jeden stupeň ph. Směrem k alkalické oblasti byl pokles zprvu pozvolnější a to přibližně až k ph 7, poté opět došlo k prudkému poklesu. Podobně jako u vzorků získaných alkalickou extrakcí, i zde zaznamenala fosfatasová aktivita neglykosylované frakce jen mírný nárůst, asi 50% na jeden stupeň ph. Obrázek 20: Závislost fosfatasové aktivity na ph pro substrát pnp-fosfát pro vzorky získané kyselou extrakcí; ConA+ - glykosylovaná frakce (osa vlevo); ConA- - neglykosylovaná frakce (osa vpravo). 4.2.2. VLIV TEPLOTY NA FOSFATASOVOU AKTIVITU Sledovala jsem vliv teploty na fosfatasovou aktivitu glykosylované frakce získané extrakcí v kyselém prostředí a stanovila teplotní stabilitu a teplotní optimum fosfatasové aktivity. Aktivitu jsem stanovovala při ph optimu enzymu (ph 5,5). Metoda stanovení je popsána v kapitole 3.2.2. 45

4.2.2.1. Teplotní stabilita Sledovala jsem vliv inkubační teploty enzymu na jeho stabilitu. Enzym byl po dobu 10 min inkubován v lázni při teplotách v rozmezí 22-80 C. Jak ukazuje obrázek 21, fosfatasová aktivita zůstávala stabilní až do teploty 50 C. Při vyšších teplotách začala fosfatasová aktivita klesat, při 70 C došlo k inaktivaci enzymu. Obrázek 21: Vliv teploty na stabilitu enzymu s fosfatasovou aktivitou z glykosylované frakce kyselé extrakce pro substrát pnp-fosfát. 4.2.2.2. Teplotní optimum Sledovala jsem také vliv teploty reakční směsi na aktivitu enzymu. Z grafu je patrné, že fosfatasová aktivita nejprve zvolna vzrůstá a dosahuje maxima při 60 C, poté nastává prudký pokles aktivity. Teplotní optimum pro fosfatasovou aktivitu je 60 C. 46