Investice do rozvoje vzdělávání Charakterizace slepičích protilátek proti sarkosinu Dagmar Uhlířová 7.2.2014 Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 NanoBioMetalNet Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu Obsah Sarkosin Metody stanovení sarkosinu Imunochemické metody antigeny protilátky příprava protilátek Cíle práce Sarkosin Charakterizace 1847 izolován Justusem von Liebigem Přírodní, netoxická, bezbarvá, pevná látka patřící mezi aminokyseliny Methylderivát glycinu nazýván také N methylglycin Meziprodukt metabolismu cholinu Hapten Použití Léčba schizofrenie Marker rakoviny prostaty 1
Možnosti stanovení sarkosinu Enzymově (enzym sarkosin oxidáza) LOD 100 pg/ml Imunochemicky (ELISA, EIA) LOD 0,1 ug/ml Chromatografie (GC, UHPLC, HPLC VIS) LOD 1 10 ug/ml Hmotnostní spektrometrie (LC/MS, GC/MS, CE/MS, HPLC/MS) LOD 2 ng/ml Elektrochemické metody LOD 10ng/ml Imunochemické metody Reakce antigen protilátka Lze stanovit v biologickém materiálu celou řadu cizorodých látek (farmaka, toxické látky ), látky infekčního původu nebo specifických protilátek Aglutinace Turbidimetrie a nefelometrie Imunodifúze Imunoelektroforéza (IE) Radioimunolanalýza (RIA) Enzymová imunoanalýza (EIA) Heterogenní enzymová analýza (ELISA) Antigen Látka, která vyvolává imunitní reakci Imunogen = kompletní Hapten = nekompletní Nízká molekulová hmotnost Nevyvolává tvorbu protilátek Potřebuje nosič 2
Protilátky Glykoproteiny, které jsou schopny identifikovat a zneškodnit antigen Těžký (H) řetězec Vazebná místa pro antigen Složen z 4 5 strukturně podobných domén H 2N NH 2 Velikost 50 75 kda H 2N NH 2 Lehký (L) řetězec Lehký řetězec Složen 2 imunoglobulinových domén HOOC COOH Velikost přibližně 25 kda Variabilní oblast 1976 Susumu Tonegawa B Lymfocyt Konstantní oblast dokáže rekombinovat části genomu a dokáže Těžký řetězec tak vytvořit všechny variace struktur protilátek HOOC COOH Izotypy: IgG, IgE, IgD, IgA, IgM, IgY Fc fragment Specifita protilátek Polyklonální protilátky směs protilátek různé afinity a specifity vytvořeny v organismu po vpravení cizorodého imunogenu nehomogennost je způsobena existencí řadou determinantních míst na molekule antigenu odpověď každého jedince má do značné míry individuální charakter Monoklonální protilátky Všechny molekuly produkovaných Ig jsou identické Mají shodnou afinitu i specifitu Rekombinantní protilátky při jejich přípravě lze genovými manipulacemi přesněji ovlivňovat specifitu protilátek postup přípravy je založen na izolaci genů kódujících protilátky, na jejich klonování a expresi Příprava protilátek Polyklonální protilátky Monoklonální protilátky 3
Slepičí protilátky ze žloutku Vyrobeny firmou Hena s.r.o. IgY, polyklonální Produkovány ve vaječném žloutku Bez imunoafinitní purifikace Sarkosin byl přes oligopeptidové raménko konjugován k proteinu hemokyaninu (KLH)* Funkčnost byla ověřena pomocí reaktivity k ke konjugátu sarkosin BSA pomocí ELISA * Srovnání koncentrace IgY u slepic před a po imunizaci* Sar 1, Sar2 260 150 Rozeznávají tyto protilátky volný sarkosin? 100 75 Jak to ověřit? Sar 1 50 kda Mr Sar1 rsar1 Sar2 rsar2 37 IgY HC Fab Sar 2 25 20 10 LC Protilátka Číslo Protein Reaktivita se (mg/ml) sarkosin BSA Sar 1 211112 19.4 dobrá Sar 2 251112 18.2 vynikající *Data od výrobce ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay Imunoenzymatické reakce Reakce antigen protilátka Mikrotitrační destička Metody Sendvičové Přímá Nepřímá Kompetitivní Dot ELISA Výhledy do budoucna: Testování imunoreaktivity připravených protilátek k volnému sarkosinu za použití sendvičové metody ELISA Použití paramagnetických částic pro imunoanalýzu sarkosinu Stanovení sarkosinu v živočišných vzorcích 4
Poděkování Prof. Ing. René Kizek, Ph.D. Ing. Soňa Křížková, Ph.D. Mgr. Ondřej Zítka, Ph.D. Děkuji za pozornost Poděkování: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu CZ.1.07/2.4.00/31.0023 NanoBioMetalNet Reg.č.projektu: CZ.1.07/2.4.00/31.0023 NanoBioMetalNet Název projektu: Partnerská síť centra excelentního bionanotechnologického výzkumu 5