Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti 11.Metody molekulové spektrometrie pro kvantitativní analýzu léčiv Vadym Prokopec Vadym.Prokopec@vscht.cz
11.Metody molekulové spektrometrie pro kvantitativní analýzu léčiv 12.NMR spektrometrie při analýze roztoků 13.Kvantitativní NMR spektrometrie 14.Hmotnostní spektrometrie pro identifikaci farmaceutických látek
Chemometrie
Chemometrie v IČ spektroskopii
Jednoduchý Lambert-Beerův zákon Použití této metody vyžaduje měření výšky nebo plochy jediného pásu pro každou komponentu každá komponenta musí mít nejméně dvě koncentrační hodnoty Pro každou komponentu je vytvářena samostatná kalibrační závislost Tímto způsobem je možno řešit jednoduché analytické problémy: pásy jednotlivých komponent se nepřekrývají (pokud ano, tak jen málo) stálá základní linie závislost mezi absorbancí a koncentrací je lineární nebo téměř lineární mezi komponentami není, nebo je velmi malá chemická interakce (maxima pásů se příliš nepohybují) matrice vzorků je dobře definovaná (v neznámých vzorcích se neobjevují nenadále nové komponenty)
Jednoduchý Lambert-Beerův zákon Výhody metod vyvinutých podle Lambert-Beerova zákona - jejich matematická podstata je snadno pochopitelná - nevyžadují velké množství standardů Nevýhody metod vyvinutých podle Lambert-Beerova zákona - nepoužitelné, pokud se pásy, nebo oblasti komponent významně překrývají - přesné pouze pro koncentrační rozpětí, pro které je kalibrační závislost lineární
Multivariační analýza dat použití mnoha proměnných zároveň základem tabulka - matice dat řádky - vzorky sloupce - proměnné proměnné - závislé - např. koncentrace proměnné - nezávislé - spektrální data proměnné - klasifikační( category ) - třídění vzorků do skupin
Označení metod multivariační analýzy CLS - classical least squares ILS - inverse least squares MLR - multiple linear regression PCA - principal component analysis PCR - principal component regression PLS1 - partial least squares 1 PLS2 - partial least squares 2
Regrese CLS klasická metoda nejmenších čtverců - K-matrix předpoklad platnosti Lambertova-Beerova zákona při všech frekvencích - absorbance je funkcí koncentrace chyby modelu jsou přiřazeny chybám v určení absorbancí použitelná i pro celá spektra všechny komponenty musí být známy a zahrnuty do kalibrace
Regrese CLS Kalibrační model může být založen na výšce nebo ploše spektrálního pásu může však také použít soubor mnoha bodů ve spektrálním rozsahu širším než je izolovaný pás Metoda může používat data s překrývajícími se pásy komponent Úspěch kalibrace je závislý na splnění těchto podmínek : každá kalibrovaná komponenta má alespoň jednu měřenou oblast (pro komponentu je možno použít současně více oblastí, přičemž každá oblast může být současně použita pro několik komponent) každá složka přispívající k absorbanci v dané oblasti je zahrnuta jako komponenta do metody počet kalibračních standardů je minimálně roven počtu komponent koncentrace komponent v kalibračních standardech se musí měnit nezávisle (nevhodné je generování kalibračních standardů ředěním základního roztoku)
Výhody CLS metody: Regrese CLS - možnost využití pásů komponent, které se významně překrývají - potřeba menšího množství standardů než PLS nebo PCR metoda - přesnější výsledky než při použití Beerova zákona, protože jsou využity všechny datové body v analytickém regionu použitém pro výpočet Nevýhody CLS metody: - nemůže řešit výskyt neočekávaných nečistot ve vzorku - interference pro jednu komponentu mohou ovlivňovat ostatní komponenty
Výhody PLS metodiky Regrese PLS - umožňuje kalibrace za použití pásů nebo regionů komponent, které se silně překrývají - řeší interference neznámých komponent (nečistot) - k výpočtům jsou použity všechny datové body v analyzovaném regionu - uživatel nepotřebuje specifikovat zvláštní oblast pro každou komponentu Nevýhody PLS metodiky - vyžaduje velké množství standardů - pochopení jejího matematického principu je obtížné
Analýza hlavních komponent analýza samotných spektrálních dat hledání struktury dat určení hlavních komponent PC s - transformace spekter do jiného systému souřadnic uspořádání dat podél PC s - SCORES hledání spektrálních intervalů významně přispívajících k distribuci dat - ZÁTĚŽE - loadings
Analýza hlavních komponent transformace souřadnicového systému
Principal Component (PC)
Regrese PCR regrese hlavních komponent PCA + regresní krok ILS modely pro více sledovaných analytů zároveň - multikomponentní separátní modely pro jednotlivé komponenty (počítány zároveň) nemusí být známy všechny komponenty modely pro celá spektra či široké spektrální intervaly
Hledání optimálního počtu hlavních komponent VYHODNOCENÍ PRESS prediction error sum of squares počítáno pro všechny zvažované počty hlavních komponent nalezení minima na křivce závislosti PRESS na počtu hlavních komponent
PCA: příklad interpretace výstupů analýzy
PCA: příklad interpretace výstupů analýzy Graf skóre (ve své podstatě je to rozptylový diagram) ukazuje umístění vzorku podél každé modelované komponenty a může být využit k detekci zákonitostí vzájemného rozmístění vzorků, jejich struktury, seskupování, podobností a odlišností. Obvykle je zobrazována závislost PC1 na PC2, obecně dvou po sobě jdoucích komponent
PCA: příklad interpretace výstupů analýzy Graf zátěží ukazuje, jak se od sebe liší hodnoty dat, když se posouváme podél modelované komponenty Pro spektroskopická data graf x-zátěží (x-loadings) popisuje příspěvek měřené intenzity signálu podél spektrální proměnné (vlnočtu) ke struktuře dat ve směru dané hlavní komponenty Grafy zátěží mohou být využity ke sledování příspěvku jednotlivých proměnných k významným odchylkám v datech a k interpretaci příbuznosti (vzájemného vztahu) proměnných
PCA: příklad interpretace výstupů analýzy graf průměrných hodnot skóre každý bod odpovídá sadě spekter pro specifický SERS substrát souřadnice jsou vztaženy k průměrným hodnotám skóre podél první (PC1) a druhé (PC2) hlavní komponenty standardní odchylky hodnot skóre pro jednotlivé (odpovídající stejnému substrátu) spektrální podskupiny (podmnožiny) jsou znázorněny chybovými úsečkami. Postup přípravy B Graf skóre Postup přípravy A
PCA: příklad interpretace výstupů analýzy Jednodimenzionální grafy zátěží pro spektrální data zobrazují příspěvek měřené intenzity signálu podél spektrální proměnné (Ramanův posuv, vlnočet) k variabilitě spektrálních dat podél zvolené hlavní komponenty 1-D graf pro první hlavní komponentu má hodně společných rysů se SERS spektry 4- ABT na povrchu substrátů umístění jednotlivé spektrální podskupiny (SERS-aktivního substrátu) podél PC1 je předurčeno porovnáním kompletní spektrální informace (např. vzhled všech zaznamenaných Ramanových pásů, jejich intenzity, tvar spektrálního pozadí, poměr signálu k šumu) v rámci celkového datového souboru. PC2: rozdíly v intenzitách vybraných pásů 1D grafy zátěží PC1: celková spektrální informace
Strategie při chemometrické analýze spektroskopických dat
Kalibrační standardy
Nejběžnější zdroje chyb
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Stanovení obsahu jodobenzenu, 2,4-lutidinu a dibutyloxalátu v třísložkové směsi I N CH3 jodbenzen CH3 2,4-lutidin CH3 CH2 CH2 CH2 O C O CH3 CH2 CH2 CH2 O C O dibutyloxalát
Příklad kvantitativního stanovení v MIR MIR spektra měřena na MCT/A detektoru v rozsahu 400 4000 cm -1 při rozlišení 1 cm -1 pro kalibraci použito 6 kalibračních a 2 validační standardy výpočet podle Beerova zákona z plochy vybraných pásů měření prováděno v kyvetě z KBr
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Kalibrační tabulka Vzorek č. jodbenzen (%) 2,4-lutidin (%) dibutyloxalát (%) 1 15,2 32,6 52,2 2 23,1 41,0 35,9 3 32,7 26,2 41,1 4 6,1 34,1 59,8 5 19,3 29,1 51,6 6 27,8 38,7 33,5 7 9,9 37,0 53,1 8 11,1 27,5 61,4
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Spektra jednotlivých složek směsi 1,0 i odobenzene 0,8 Abs 0,6 0,4 0,2 2,4 -lutidin e 1,0 Abs 0,5 1,0 dib uty l ox alate 0,8 Abs 0,6 0,4 0,2 4 000 3 000 2 000 1 000 W ave num be rs (c m-1 )
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Výběr vhodného pásu pro stanovení jodbenzenu jodbenzen - substituovaná aromatická sloučenina 2,4-lutidin - substituovaná heterocyklická sloučenina rozdílné umístění mimorovinných deformačních C-H vazeb šestičlenného kruhu v oblasti 850 700 cm -1 pro stanovení jodbenzenu výběr pásu 654 cm -1 1,0 i odo ben zen e 0,8 654,2 cm-1 Abs 0,6 0,4 0,2 2,4 -lutidin e 1,0 Abs 0,5 1,0 dib uty l ox alate 0,8 Abs 0,6 0,4 0,2 8 50 8 00 7 50 7 00 W avenumbers (c m-1 ) 6 50 6 00 5 50
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Výběr vhodného pásu pro stanovení 2,4-lutidin charakteristický ostrý pás v (C-C) vibrací pyridinového kruhu při 1607 cm-1 obdobné vibrace aromatického kruhu jodbenzenu posunuty na 1571 cm -1 pro stanovení 2,4-lutidinu výběr pásu 1607 cm -1 i odobenzene 1,0 1571,7 cm-1 Abs 0,5 2,0 1,5 2,4 -lutidin e 1607,4 cm-1 Abs 1,0 0,5 dib uty l ox alate 1,0 Abs 0,5 1 680 1 660 1 640 1 620 1 600 1 580 1 560 1 540 1 520 1 500 1 480 W ave num be rs (c m-1 )
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Výběr vhodného pásu pro stanovení spektrum dibutyloxalátu má dva karbonylové pásy při 1770 a 1744 cm -1 spektrum jodbenzenu má v této oblasti overtonové pásy substituovaného benzenového kruhu, ty jsou však velmi malé a stanovení dibutyloxalátu významně neovlivní pro stanovení dibutyloxalátu výběr pásů 1770 a 1744 cm -1 0,5 i odobenzene 0,4 Abs 0,3 0,2 0,1 2,4 -lutidin e 1,0 Abs 0,5 dib uty l ox alate 1770,3 cm-1 1744,7 cm-1 1,0 Abs 0,5 1 900 1 850 1 800 1 750 1 700 1 650 W ave num be rs (c m-1 )
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Stanovení jodbenzenu výběr regionu
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Stanovení jodbenzenu kalibrační graf
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Stanovení 2,4-lutidinu výběr regionu
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Stanovení 2,4-lutidinu kalibrační graf
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Stanovení dibutyloxalátu výběr regionu
Příklad kvantitativního stanovení v MIR Stanovení dibutyloxalátu kalibrační graf
Příklad PCA analýzy NIR spekter
Příklad PCA analýzy NIR spekter
Příklad PCA analýzy Ramanových spekter biologických vzorků Vzorek: rakovinné buňky epitelové tkáně plic
Příklad PCA analýzy Ramanových spekter biologických vzorků