Velikost a tvar částic Veronika Grünwaldová Veronika.grunwaldova@zentiva.cz Zentiva k. s.
Proč je velikost částic důležitá? Chemické reakce Co velikost částic ovlivňuje? rychlost Transport léčiva Zpracovatelnost tekutost filtrovatelnost míchání a segregace distribuce léčiva v tabletě Výrobu lékových forem Syntézu Formulaci léčiva Velikost částic, které se uloží v plicích: 4 10 μm Fyziochemické vlastnosti rychlejší disoluce rychlejší absorpce tělem Chování lékových forem Zpracování léčiva v těle
Co velikost částic ovlivňuje? Chování lékových forem Fyziochemické vlastnosti Disoluční profily tablet s API o různé velikosti částic Průběh plazmatické koncentrace amlodipinu v přípravku Agen (plné body; generikum firmy Zentiva) a Norvasc (prázdné body, originál firmy Pfizer)
Co je velikost částic? Částice je definována jako objekt, který je malý ve srovnání s okolím.
Metodika měření Snaha popsat velikost částice jedním číslem Použití aproximací: Koule o stejné.. maximální délce minimální délce Hmotnosti sedimentační rychlosti objemu projde stejnou velikostí oka síta povrchu Jedna částice různé druhy velikosti Výsledná velikost částic se zjišťuje měřením velikostně závislé vlastnosti, tzn. je závislá na použitých předpokladech a aproximacích.
Jedna částice různá velikost Existuje spojitost mezi VELIKOSTÍ a TVAREM částic? Pouze jednoduchá geometrická tělesa koule, krychle lze popsat jediným číslem! 2 D r 3 D 2 D 2 D Tvar částic je důležitý ovlivňuje velikost! V případě nesférických objektů nelze oddělit velikost částice od jejího tvaru a orientace.
Tvar částic ovlivňuje vlastnosti prášků jako je: tekutost, segregace, interakce s dalšími látkami, vodivost, permeability, disoluce Výrobu léčiva Chování léčiva Přesto je tvaru částic věnována daleko menší pozornost než jejich velikosti.
Shrnutí Velikost částic je pouze relativní číslo Rozdílné částice mohou mít stejnou ekvivalentní velikost Při porovnávání velikosti částic je nutné srovnávat pouze výsledky stejných metod Na opakovatelnost metody je kladen daleko větší důraz než na její přesnost (jek je velikost reálná) Kterou metodu měření velikosti použít? předpokládaná velikost částic fyzikálně-chemické vlastnosti měřené látky - tvar částic, morfologie jejich povrchu, rozpustnost a smáčivost přesnost měření rychlost měření cena zařízení a jeho dostupnost
Kterou metodu měření velikosti použít? Přehled vybraných metod charakterizace tvaru a velikosti částic Metoda Obor použití 1. Sítová analýza 5 μm až mm 2. Metody založené na ohybu a rozptylu světla 3. Mikroskopické metody a obrazová analýza nm 3000 μm a) světelná mikroskopie 0,5 250 μm b) elektronová mikroskopie 0,001 100 μm
Sítová analýza Jedna z nestarších technik Princip metody: Analyzovaný prášek je umístěn na horní síto (s největšími oky) celý systém je podroben standardní době třepání. Materiál zachycený na jednotlivých sítech přesně zvážen. Výsledkem analýzy jsou podíly prášku (v hmotnostních procentech) odpovídající jednotlivým velikostním rozmezím mezi dvěma sousedními síty. Dvourozměrný odhad velikosti částic Velikostním parametrem prosévání je délka strany nejmenšího čtvercového otvoru síta, kterým částice projde.
Sítová analýza Typy sít Tkaná Leptaná Perforovaná Velikost ok: 125 mm 38 µm (+/- vliv jemnosti a materiálu) Leptané 20 µm Tkané 20 µm Velikost ok: 500 5 µm (+/- 2 µm) Tvary ok: kulatá, hranatá a j. Nízká odolnost Velikost ok: 125 1 mm (+/- 2 µm) Tvary ok: kulatá, hranatá a j. Vysoká odolnost Označení velikosti ok síta: Počet vláken síta na 1 palec. Materiály sít: Bronz, mosaz, nereznoucí ocel, nylon, hedvábí...
Sítová analýza Suchá cesta Ruční sítování: Strojové sítování: částice menší než cca 50 µm neprocházejí snadno přes stejně veliká oka, gravitační síla je malá vzhledem k třecí síle o stěny ok mimo to se malé částce lepí na velké air jet sieve Sítování v proudu vzduchu Air- jet rozšiřuje použití suchého sítování cca do 25 µm průmyslový vysavač generuje proud vzduchu, který rozpráší částice na analytickém sítu. částice menší než je velikost ok na sítu jsou odsány do použitého vysavače, nebo do cyklónového odlučovače, pro zachování kompletního vzorku. proud vzduchu konstantně pročisťuje oka síta.
Sítová analýza Mokrá cesta Mokré sítování: materiály v suspenzi nebo prášky, které mají za suchého sítování snahu agregovat, částice jsou menší než 50 µm, silně elektricky nabité množství vzorku: 1 g suché váhy použití elektroformovaných sít často spojeno s proplachováním, sáním nebo vibracemi, aby se zlepšil tok kapaliny přes síta vibrace mechanické (velké částice) nebo ultrazvukové (jemné částice) ultrazvukové sítování nejčastěji se používá voda samotná nebo s dispergačním činidlem, ale lze použít i jiné kapaliny konec sítování nastává, když je procházející kapalina prakticky čirá nevýhoda. pomalé cca 1-2 hod, jednotlivé frakce musí být před vážením usušeny
Sítová analýza Suchá cesta většina částic větších než 50 μm Mokrá cesta až do velikosti částic kolem 10 µm. Srovnání výsledků suchého a mokrého sítování Suché sítování : 63 75 μm Mokré sítování : 63 75 μm 44 75 μm 44 75 μm Mokrá cesta: Nebyly problémy s agregací malých částic Dosaženo pouze úzké distribuce velikosti částic na jednotlivcích sítech, tzn. na sítě byly částice stejné velikosti
Sítová analýza - příklad
Shrnutí Sítová analýza
Laserová difrakce Princip metody Rozptyl světla na velké částici Rozptyl světla na malé částici
Laserová difrakce Laserový difraktometr Zdroj světelného záření Detektory Analýza dat
Laserová difrakce Světelný zdroj: laser, wolfram-halogenová lampa... Typ laseru Výkon (mw) Vlnová délka (nm) Charakteristika Ar ionty 30 2000 488; 514,5 Kolimovaný, potřeba vodního chlazení pro vysoký výkon He-Ne 1 50 Diodový 0,1 200 543,5; 594,1 612,0; 632,8 405; 450 635; 650 670; 685 750; 780 Kolimovaný, životnost 20 000 hod Interface s vláknovou optikou, divergentní paprsek Výhody laseru: dlouhá životnost vysoká stabilita monochromatického záření, jeho značná koherence vzhledem k času a prostoru.
Laserová difrakce Detekční systém se skládá řady diskrétních senzorů s velmi malou odrazivostí počet těchto senzorů velmi významně ovlivňuje přesnost měření ve středu detektoru je umístěn otvor nebo zrcadlo (beam trap), které slouží k odstranění nerozptýlené části světla Typy detektorů: Křemíkové detektory široký dynamický rozsahem (107) vysokou citlivostí dlouhou životností. Současný design detektorů požadavkem dobré citlivosti pro slabé intenzity rozptýleného světla ve velkých úhlech, což souvisí s plochou jednotlivých elementů a mezi požadavkem dobrého úhlového rozlišení, což je spojeno s prostorem mezi těmito elementy. CCD detektory jsou vhodné pro měření tvaru mají ale menší dynamický rozsah a citlivost, což způsobuje možnost měření menšího velikostního rozpětí nejčastější rozmístění je lineární, polokruhové nebo do X
Laserová difrakce Analýza naměřených dat - Mieho,teorie je založena na předpokladu kulového tvaru částic, což znamená, že vypočtená velikost není absolutní velikostí částic, ale odpovídá velikosti teoretické koule - koule o stejném objemu jako analyzovaná částice. = Použití Mieho teorie vyžaduje znalost relativního indexu lomu měřených částic vzhledem k měrnému mediu. Index lomu a tvar má vliv na distribuci velikosti částic i na opakovatelnost / reprodukovatelnost metody
Laserová difrakce Laserový difraktometr Měřicí cela Laserová lavice Jednotka pro přípravu mokrého vzorku - suspenze Jednotka pro přípravu suchého vzorku prášku disperzant: disperzant: vzduch míchání, ultrazvuk stlačený vzduch
Laserová difrakce Výstup měření grafické vyjádření distribuce velikosti částic (frekvenční či kumulativní křivka, histogram). Frekvenční křivka Distribuční křivka Frekvenční křivka charakterizuje distribuci velikosti částic vztaženou na objem částic Kumulativní, distribuční křivka udává procentické zastoupení částic ve vzorku o velikosti menší než je velikost zvolená.
Laserová difrakce K charakteristickým parametrům patří: D (0,5) udává velikost při které je 50% částic menších a 50 % větších. Jde vlastně o medián dělící plochu frekvenční křivky na dvě stejné části. D(0,1); D(0,9) udává velikost pod níž se nachází 10 resp. 90 % částic a charakterizuje tak okraje distribuce
Laserová difrakce - příklad Vývoj metody Mokrá cesta Pevné parametry Kapalné médium Zvolení smáčedla Index lomu kapalného média Index lomu API Hledané parametry Rychlost míchání Intenzita sonifikace Doba sonifikace Opakovatelnost Suchá cesta Pevné parametry Index lomu API Hledané parametry Vibrace podavače Tlak vzduchu Opakovatelnost
Laserová difrakce Vliv metody na výslednou distribuci velikosti
Laserová difrakce Vliv metody na výslednou distribuci velikosti Suchá cesta Mokrá cesta
Laserová difrakce Vliv disperzantu na výslednou distribuci velikosti
Laserová difrakce Vliv disperzantu na výslednou distribuci velikosti Slunečnicový olej Minerální olej
Laserová difrakce Vliv tvaru částic na jejich výslednou distribuci velikosti
Laserová difrakce Vliv tvaru částic na jejich výslednou distribuci velikosti
Laserová difrakce Vliv indexu lomu na výslednou distribuci velikosti částic Vliv přítomnosti bublin na výslednou distribuci velikosti částic
Shrnutí Laserová difrakce
Dynamický světelný rozptyl (DLS) analýza podmikronových částic Princip metody: Brownovnův pohyb - částice difundují - závisí na viskozitě okolní kapaliny, teplotě a velikosti částic DLS zkoumá Brownův pohyb opticky. částice osvícené koherentním světelným zdrojem laserem- tvoří difrakční obrazec termální pohyb molekul media způsobuje změnu pozic sledovaných částic, což způsobuje změny difrakčního obrazce. Díky tomu dochází k fluktuaci intenzity sledovaného bodu difrakčního obrazce v čase. Fluktuaci intenzity v závislosti na čase sleduje korelační funkce. DLS použitelná pro širokou škálu koncentrací od zředěných roztoků až po velmi koncentrované, ale pouze pro jednonásobný rozptyl světla.
Dynamický světelný rozptyl (DLS) Jak přístroj pracuje? monochromatické, vertikálně polarizované koherentní světlo Fokusační čočky, štěrbiny a clony Intenzita rozptýleného světla je konvertována do el. signálu
Dynamický světelný rozptyl (DLS) Aspekty ovlivňující měření Velikost částic: částice měřitelné v rozsahu 0,005 1 μm velmi malé částice: měření je limitováno, tím, že špatně rozptylují světlo částice větší než 0,5 μm - mohou se během měření usadit - jejich Brownův pohyb je velmi pomalý, specielně v suspenzích s velkou viskozitou nutné dlouhé měřicí časy suspenze je nestabilní Koncentrace částic: 10-2 10-3 % (v/v), zakalení suspenze je viditelné pouhým okem nízké koncentrace mohou vést k rozptylu světla s menší intenzitou, specielně u velmi malých částic nebo k fluktuaci počtu částic v měřicí zóně pro malé částice je tedy nutno použít vyšších koncentrací nebo silnějšího laseru vysoké koncentrace mohou vést k násobnému rozptylu nebo k interakcím částice částice, násobný rozptyl je velmi pravděpodobný u částic nad 0,5 μm Vzrůst viskozity měřicího media vede ke snížení difůze částic, což omezuje max. měřitelnou velikost částice
Dynamický světelný rozptyl (DLS) Photon Cross Correlation Spectroscopy (PCCS) nová technika využívající 3 D cross corelace, která zcela potlačuje násobný rozptyl lze analyzovat velmi koncentrované suspenze díky vysokým koncentracím částic není citlivá na nečistoty, lze měřit ve standardních podmínkách Princip: dva lasery ozařují stejný objem a vznikají tak dva obrazce fluktuaci intensity sledují dva detektory je použita korelační fce dvou signálů
Dynamický světelný rozptyl (DLS) - Příklad Photon Cross Correlation Spectroscopy (PCCS) Velikost částic - vyjadřována hydrodynamickým průměrem částice.
Dynamický světelný rozptyl (DLS) - Příklad Photon Cross Correlation Spectroscopy (PCCS) Vliv přítomnosti shluků na výsledné vlastnosti látky
Shrnutí Dynamický světelný rozptyl (DLS)
Mikroskopie Mikroskop - složitá optická soustava, jejímž účelem je pozorování drobných předmětů a jejich detailů při velkém zvětšení. Na vlastnostech použité optické soustavy a použitého záření závisí jakých zvětšení a rozlišení bude možno dosáhnout. Rozlišovací schopnost lidského oka cca 0,25 mm Optický mikroskop skleněné čočky a viditelné záření => rozlišovací schopnost cca. 0,2 µm 1000 x víc než oko Elektronový mikroskop elektromagnetické čočky a urychlené elektrony => rozlišovací schopnost 0,0025 nm (60kV) 100 000 000 x víc než oko Prakticky 350 000 500 000 x víc než oko Špičkové přístroje až 800 000 1 000 000 x
Optická (světelná) mikroskopie k zobrazení využívá viditelného záření, λ= 420 760 nm. zvětšení je omezeno touto vlnovou délkou a detaily, které jsou svojí velikostí s ní srovnatelné, nelze vzájemně rozlišit. receptorem signálu z mikroskopu elektronický čip, např. čidlo digitální kamery, nikoli lidské oko, je možné rozsah citlivosti rozšířit směrem do oblasti ultrafialové i pod 380 nm nebo směrem do oblasti infračervené, tedy nad 760 nm. Základními optickými prvky mikroskopu jsou objektiv a okulár- - spojné čočky
Optická (světelná) mikroskopie Okuláry Objektivy Objektivy Stolek Křížový posun Křížový posun Hlavní vypínač Regulace osvětlení Makro a mikrošroub Zdroj světla
Optická (světelná) mikroskopie Objektiv Skutečný, převrácený a zvětšený obraz
Optická (světelná) mikroskopie Skutečný, převrácený a zvětšený obraz
Optická (světelná) mikroskopie Okulár Zdánlivý a zvětšený obraz
Optická (světelná) mikroskopie Pozorovatel/ka uvidí v mikroskopu: zdánlivý, zvětšený a převrácený obraz zdánlivý a zvětšený obraz skutečný, převrácený a zvětšený obraz
Optická (světelná) mikroskopie Maximální užitečné zvětšení objektivu Zvětšení Závisí na rozlišovací schopnosti objektivu - vzdálenost dvou bodů (a), které mikroskop zobrazí jako dva samostatné body - je dána jeho numerickou aperturou - schopnost objektivu zachytit co nejširší kužel paprsků, které procházejí objektem Numerická apertura l - vlnová délka a = 0,61 l/ n x sina n index lomu prostředí před objektivem a - polovina otvorového úhlu kužele paprsků, které mohou vstoupit do objektivu Rozlišovací schopnost lze zvýšit: snížením λ použití modrého světla (modrý filtr) zvyšováním n použití imerzního oleje numerická apertura
Elektronová mikroskopie Dle způsobu ozařování vzorku TEM - na průchod SEM (LVSEM, AQUASEM) - na odraz
Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) Jak TEM pracuje? V podstatě analogie optického mikroskopu, ale místo světelného paprsku se používá paprsek elektronový, a místo skleněných čoček, čočky magnetické. Proud elektronů prochází tzv. elektronovou čočkou, kterou tvoří elektrické pole zvláštního kondenzátoru nebo magnetické pole cívky. Tato elektronová čočka soustřeďuje elektrony na pozorovaný předmět (preparát). Proud elektronů pak prochází další elektronovou čočkou objektivem a vytvoří první elektronový obraz. Část tohoto obrazu se elektronovou čočkou projektivem znovu zvětší a vzniká výsledný obrazec. Vrstva preparátu musí být velmi tenká, cca do 100 nm, aby nepohlcovala elektrony.
Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) Srovnání fotografie téhož vzorku z TEMu a SEMu TEM 100 000 x kv TEM - na průchod SEM - na odraz
Elektronová tryska generuje elektrony 1. Wolframové vlákno, 2. Katoda LaB 6 3. the field emission gun (FEG) Emise Termoemisní W LaB6 FE Field Emission Velikost (nm) 1 x 10 5 2 x 10 4 0.2 Brightness (A/cm2.steradian) 10 4-10 5 105-10 6 10 7-10 9 Energie (ev) 1-5 0.5 3.0 0.2 0.3 Živortnost (hrs) >20 >100 >300 Vakuum (torr) 10-4 10-5 10-6 10-7 10-9 10
Elektronová tryska generuje elektrony Termoemisní zdroj FEG
Skanovací elektronová mikroskopie (SEM) Interakce elektronového paprsku s preparátem
Skanovací elektronová mikroskopie (SEM) Interakce elektronového paprsku s preparátem Vzrůst urychlovacího napětí Vzrůst atomového čísla vzorku
Skanovací elektronová mikroskopie (SEM) aparatura obvykle pracuje ve vysokém vakuu (minimálně 10-2 Pa, běžně 10-3 až 10-4 Pa) pro práci ve vysokovakuovém módu je potřeba, aby povrch vzorku byl rovný a vodivý, vodivost vzorku se zabezpečuje jeho napařením uhlíkem nebo kovy např. zlatem. nízkovakuové mikroskopy (3 500 Pa) vhodné pro práci s nevodivými vzorky.
Výhody skanovací elektronová mikroskopie (SEM) vzhledem k optické mikroskopii (LM) Vysoké rozlišení při velkém zvětšení Rozlišení vzdálenost mezi dvěma body, které lze od sebe odlišit Nejlepší rozlišení LM je kolem 200 nm zatímco typický SEM má rozlišení lepší než10 nm (běžně 5 nm). Hloubka ostrosti SEM má cca 300 x větší hloubku ostrosti než LM, díky čemuž je možné ze SEMu získat detailní informaci o topografii vzorku. Mikroanalýza např. analýza chemického složení, krystalografického složení, magnetické a elektrická charakterizace vzorku..
Skanovací elektronová mikroskopie (SEM) Příklad - nežádoucí rekrystalizace API
Skanovací elektronová mikroskopie (SEM) Příklad sušení API při různých podmínkách
Skanovací elektronová mikroskopie (SEM) Příklad - API připravená za různých krystalizačních podmínek
Skanovací elektronová mikroskopie (SEM) Sledování vzhledu peletek po disolucích
Skanovací elektronová mikroskopie (SEM) Sledování vzhledu tablet 2 1 3
Skanovací elektronová mikroskopie (SEM/EDX) Identifikace obalu ACLAR blistr ACLAR folie PVC PVC Al
Skanovací elektronová mikroskopie (SEM/EDX) Identifikace obalu Blistr: ACLAR, PVC a Al. Folie: ACLAR a PVC Al Cl Cl Cl F Cl F
Obrazová analýza Jak obrazová analýza funguje? Původní obraz Binární obraz Konečný binární obraz po morfologických binárních operacích Kalibrace Segmentatace RGB/HSI Morfoloické binární operace Měření
Obrazová analýza Jak obrazová analýza funguje v praxi?
Obrazová analýza Vybrané morfologické parametry
Obrazová analýza Srovnání výsledků různých morfologických parametrů jednoho souboru částic
Obrazová analýza Příklad stanovení distribuce velikosti
number volume Obrazová analýza Početní x objemová procenta 12 6 10 5 8 4 6 3 4 2 2 1 0 1 2 3 0 1 2 3 size size Lineární x logaritmické měřítko osy
Obrazová analýza Početní x objemová procenta
Volume Obrazová analýza Početní x objemová procenta 60-65 μm :3 částice = 39 % objemu!!! 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Size (um)
Obrazová analýza Příklad stanovení morfologických parametrů tvaru Příznak DUL 32 0 02 09 06 Plocha 281,57 104,52 Kruhovitost 0,814 0,673 Protažení 1,88 2,72
Obrazová analýza Příklad analýza vzorku obsahujícího různé druhy částic
Obrazová analýza Příklad stanovení tloušťky vrstev a velikosti peletek
Tvar částic Přehled vybraných metod používaných k popisu tvaru částic Metoda Mikroskopie (optická, SEM, TEM atd.) Digitální zpracování obrazu Difrakce světla Měření jednotlivých částic Ano Ano Založena na zobrazení Ano (projekce, foto) Ano (difrakční obrazec)
Tvar částic Kvantitativní popis číselně pomocí koeficientů, faktorů či indexů (cca 100 různých). Modelování tvaru 1) Digitalizace tvaru jeho popis pomocí pixelů Obrazová analýza 2) Pomocí uspořádaného nebo neuspořádaného seskupení koulí Nevhodné pro nesférické částice 3) Pomoci polygonální sítě Vhodné k popisu nahodilých tvarů
Tvar částic Popis tvaru částic Kvalitativní popis slovně, např.: částice jsou jehličkovité, ostrohranné, dendritické, vláknité. Jeden ze způsobů kvalitativního (slovního) popisu tvaru částic.
Tvar částic Popis tvaru částic - kvantitativně Fourierova analýza Využívá fotografie částic a stanovuje jejich morfologii a texturu První úrovní Fourierova popisu částic je stanovení jejich tvaru, tedy protaženosti, triangularity a pravoúhlosti. Vyšším stupněm je stanovení textury a hrubosti. Celý proces si můžeme představit tak, že na počátku je stanoven přibližný obecný tvar částice, který se v jednotlivých krocích postupně upřesňuje. Od počátečního A do konečného F Vhodná - pro částice s hladkým povrchem a pro částice jejichž úhel orientace je stabilní vzhledem ke kontuře připodobňovaného modelu. Nevhodná - pro polygonální částice, které mají ostré úhly, jako jsou částice s fasetovým povrchem.
Laserová difrakce - příklad Vývoj nové metody na mokré cestě