Imunomodulační vliv mesenchymálních kmenových buněk na nespecificky indukovanou proliferaci lymfocytů Immunomodulative effect of mesenchymal stem cells on nonspecifically induced lymphocyte proliferation TOMÁŠ VLAS 1, LINDA MERGLOVÁ 2, PETR PANZNER 1, JANA HANZLÍKOVÁ 1, VLADIMÍR KOZA 2, DANIEL LYSÁK 2 1 Ústav imunologie a alergologie, Fakultní nemocnice Plzeň 2 Hematologicko-onkologické oddělení, Fakultní nemocnice Plzeň SOUHRN Mesenchymální kmenové buňky (MSC) se staly předmětem zájmu mnoha medicínských oborů. Naše studie se zaměřila na sledování imunomodulačních vlastností MSC. Testovali jsme vliv přítomnosti těchto buněk na nespecifickou aktivaci lymfocytů phytohemagglutininem (PHA) v rámci lymfocytárního transformačního testu. Přidání MSC do kultivačního testu výrazně snižovalo míru aktivace lymfocytů, která byla měřena pomocí analýzy buněčného cyklu průtokovou cytometrií. Počet aktivovaných buněk v G2/M fázi se snížil o cca 17 % (medián, p < 0,01). Při kultivaci nestimulovaných lymfocytů byla zjištěna nevýznamná proliferace vyvolaná samotnými MSC 0,8 % nárůst proliferujících lymfocytů (ns). Při sledování změn probíhajících v kultivovaných vzorcích jsme pozorovali vyšší viabilitu u kultur s přídavkem MSC. Obsah fragmentované DNA byl v těchto vzorcích o 2,3 % (p = 0,029) nižší v porovnání se vzorky bez kokultivace s MSC. Výsledky potvrzují nízkou imunogenicitu MSC, jejich schopnost snižovat aktivaci lymfocytů a podporovat navozování imunotolerance. MSC se mohou stát východiskem nových léčebných přístupů některých imunitně podmíněných patologických stavů (autoimunitní onemocnění, GVHD atd.). Klíčová slova: mesenchymální kmenové buňky, lymfocyty, proliferace, imunomodulace, GVHD, buněčný cyklus SUMMARY Mesenchymal stem cells stand in the focus of interest of a lot of medicine branches. Our study is focused on their immunomodulatory properties. We tested the influence of their presence on nonspecific activation of lymphocytes with phytohemagglutinin (PHA) during the lymphocyte transformation test. Adding of MSC into the cultivation medium significantly decreased the level of lymphocyte activation, which was measured by the cell-cycle analysis by flow cytometry. The number of activated cells in the G2/M phase was decreased by 19 % (median, p < 0,01). Insignificant proliferation caused by MSC alone was detected in the culture of non-stimulated lymphocytes increase of proliferating lymphocytes by 0,8 % (ns). Monitoring changes in cultures we watched increased viability in cultures with added MSC. The level of fragmented DNA in these samples was by 2,3 % lower (p = 0,029) than in the samples without MSC. The results confirm low immunogenicity of MSC, their ability to decrease lymphocyte activation and support inducing of immunotolerance. MSC may become a basis for new medical approaches to the treatment of some immunopathological states (autoimmune disorders, GVHD etc.). Key words: mesenchymal stem cells, lymphocytes, proliferation, immunomodulation, GVHD, cell cycle Úvod Mesenchymální kmenové buňky (MSC) jsou multipotentní nehemopoetické progenitorové buňky stromálního původu, které lze izolovat z kostní dřeně i řady dalších tkání (tuková tkáň, pupečníková krev). MSC mohou pod vlivem definovaných in vitro nebo in vivo podmínek diferencovat do řady buněk mezodermálního původu (adipocytů, chondrocytů a osteoblastů) a pravděpodobně i do stromálních fibroblastů, buněk endoteliálních, neurálních a jiných (1,2). MSC nejsou charakterizovány specifickým markerem. Pro jejich imunofenotyp je typická absence hemopoetických Alergie 4/2011 257
Obr. 1: Mikroskopický snímek kultury MSC. Mesenchymální kmenové buňky adherované na povrchu kultivační láhve; fotografie ve fázovém kontrastu (Olympus IX51, zvětšení 100 ). antigenů CD45, CD34, CD14, CD19 atd. Naopak v různé míře jsou přítomné znaky CD105, CD90, CD73 a další v závislosti na zdroji buněk a kultivačních podmínkách. MSC jsou považovány za hypo-imunogenní. Vykazují nízkou expresi HLA antigenů I. třídy a neexprimují kostimulatorní molekuly jako CD80, CD86 nebo CD40 (3,4). MSC proto nevyvolávají téměř žádnou proliferační odpověď alogenních lymfocytů a lze je využívat resp. transplantovat i bez respektování obvyklé transplantační bariéry dané shodou hlavního histokompatibilního systému. MSC jsou schopny reagovat s buňkami vrozené i získané imunity a navozovat tak modulaci některých funkcí imunitního systému. Při kultivaci jednotlivých buněčných subpopulací imunitního systému s MSC dochází ke změně cytokinového profilu dendritických buněk, naivních a aktivovaných T-lymfocytů i NK buněk k více protizánětlivému nebo tolerantnímu fenotypu. MSC snižují sekreci IFN-γ v T h1 buňkách, zvyšují expresi IL-4 v T h2 buňkách. Nezralé dendritické buňky a T REG zvyšují v přítomnosti MSC expresi IL-10, zatímco zralé DC1 snižují produkci TNF-α a IL-12 (5, 6). Mesenchymální buňky mohou inhibovat proliferaci T-lymfocytů také prostřednictvím produkce indoleamine 2,3-dioxygenázy (IDO), která katalyzuje konverzi tryptofanu na kynurenin a snižuje odpověď T-buněk prostřednictvím deplece tryptofanu a kumulace jeho toxických metabolických produktů. MSC také exprimují enzym cyklooxygenázu (COX) a zasahují do T-lymfocytární imunity produkcí prostaglandinu E2, který indukuje regulační T-lymfocyty (5,7). Antigen specifická nebo mitogenem indukovaná nespecifická proliferace lymfocytů je v přítomnosti MSC významně redukovaná. Dochází nejen ke snížení proliferace a cytotoxicity, ale také ke stimulaci T REG. Snížená reaktivita T-lymfocytů není selektivní a týká se podobně naivních a paměťových T-buněk stejně jako CD4+ a CD8+ subpopulací (1). Suprese není závislá na hlavním histokompatibilním systému (MHC), může být zprostředkována alogenními i autologními MSC a její míra souvisí s dávkou MSC (8). Inhibice proliferace T-lymfocytů je dána jejich zadržením v G0/G1 fázi buněčného cyklu (2,9). MSC mohou zasahovat do imunitní odpovědi a měnit zánětlivé prostředí na imunitně tolerantní či dokonce protizánětlivé. Imunomodulační vlastnosti MSC je předurčují k použití při ovlivnění imunitní odpovědi u řady onemocnění, jejichž podstatou je aloreaktivní imunita nebo autoimunita. Množství studií se věnuje zejména problematice chronické reakce štěpu proti hostiteli (GVHD) po alogenní transplantaci hemopoetických kmenových buněk. V našem souboru jsme pomocí analýzy nespecifické aktivace lymfocytů ověřovali imunomodulační schopnosti MSC, které jsou připravovány v rámci preklinické studie léčby steroidně refrakterní GVHD. Cílem bylo stanovit, jakým způsobem ovlivňují MSC nespecifickou proliferaci lymfocytů, a doplnit metody charakterizace MSC o funkční test. Metody Vyšetření jsme provedli na 20 vzorcích lymfocytů získaných od zdravých dárců krve. Každý vzorek byl vyšetřován čtyřikrát: dva PHA stimulované testy bez přítomnosti a s přidáním mesenchymálních kmenových buněk a dva nestimulované kontrolní testy opět bez/s MSC. Celkem bylo provedeno 80 lymfocytárních transformačních testů. Výběr dárců byl náhodný, shoda HLA znaků s dárci MSC nebyla vyžadována. Testy byly prováděny z plné krve, zpracování materiálu probíhalo ihned po odběru. Kultivace mesenchymálních buněk Mesenchymální kmenové buňky byly získány z kostní dřeně zdravých dárců. Mononukleární frakce leukocytů byla izolována centrifugací v hustotním gradientu (LMS 1077, PAA, Rakousko) a kultivována po dobu 48 hodin při 37 C a 5 % CO 2 v kultivačním médiu (alpha-mem, PAA, Rakousko; poolovaný destičkový lyzát). Po této době byly neadherující buňky odmyty a mesenchymální 258 Alergie 4/2011
Obr. 2: Analýza růstových fází buněčného cyklu průtokovou cytometrií 2a. Test bez stimulace PHA s přídavkem MSC: 1,1 % aktivovaných lymfocytů (S + G2/M fáze); 2b. test bez stimulace PHA a bez přidání MSC: 1,1 % aktivovaných buněk; 2c. test se vzorkem stimulovaným PHA s přídavkem MSC: 18,7 % aktivovaných lymfocytů; 2d. aktivace PHA bez přidání MSC: 46,0 % aktivovaných buněk; z porovnání testů 2c. a 2d. vyplývá redukce aktivace lymfocytů v přítomnosti MSC o 27,3 %. kmenové buňky byly dále kultivovány jako populace buněk adherujících na povrch kultivační nádoby (Cell Culture Flask, Corning, USA). Kultivace pokračovala za pravidelné výměny kultivačního média do dosažení 80 90 % konfluence. Při pasáži byly MSC uvolněny od podkladu pomocí trypsinu (TrypLESelect, Invitrogen, USA). Foto mesenchymálních buněk viz obrázek 1. Při každé pasáži a testování imunomodulačních vlastností MSC byla provedena charakterizace mesenchymálních kmenových buněk pomocí průtokové cytometrie. Buňky byly negativní pro znaky CD45, CD34, CD14, CD19, HLA-DR, a pozitivní pro znaky CD13, CD73, CD90, CD105, CD271. Analýza byla prováděna na průtokovém cytometru FACS Canto II pomocí software Diva 6.0 (Becton Dickinson, USA). Test aktivace lymfocytů Byl použit test založený na nespecifické aktivaci leukocytů pomocí PHA (Sigma, USA). Vzorky periferní krve o objemu 100 μl byly inkubovány v kultivačním médiu X-VIVO 10 (Lonza, USA) s přídavkem nebo bez přidání PHA po dobu 72 hodin při 37 C a 5% CO 2. Do jednoho stimulovaného a kontrolního testu byly přidány mesenchymální buňky v množství 4 10 5, dva testy zůstaly bez doplnění MSC. Po uplynutí kultivační doby bylo stanoveno procento aktivovaných buněk v jednotlivých testech. Stanovení procenta aktivovaných lymfocytů Pro stanovení procenta aktivovaných lymfocytů byla využita analýza fází buněčného cyklu pomocí průtokové cytometrie. Byla stanovována intenzita fluorescence jaderné DNA značené propidium jodidem po předchozí permeabilizaci buněčné membrány a odstranění interferující RNA (CycleTEST PLUS, Becton Dickinson, USA). Analýza byla provedena na průtokovém cytometru FC500 (Beckman Coulter, USA) pomocí software MultiCycle AV DNA analysis (Beckman Coulter, USA). Procenta aktivovaných lymfocytů v jednotlivých vzorcích byla kalkulována jako součet procent aktivovaných buněk v růstové fázi G2 a M fázi (viz obr. 2). Stanovení fragmentované DNA Data získaná při analýze buněčného cyklu byla použita ke stanovení fragmentů DNA. Při zvyšující se fragmentaci klesá intenzita fluorescence propidium iodidu vázaného na tyto fragmenty, které se nacházejí v oblasti před G1 peakem (sub G1 peak). Tato hypodiploidní populace se Alergie 4/2011 259
Graf 1: Vliv přítomnosti MSC na nespecifickou aktivaci lymfocytů. Porovnání výsledků nespecifické aktivace lymfocytů bez přítomnosti a po přidání MSC (n = 20); A. negativní kontroly bez stimulace PHA, aktivované lymfocyty 0,4 % vs. 1,2 % lymfocytů (ns); B. testy po stimulaci PHA, aktivované lymfocyty 35,4 % vs. 18,5 % (p < 0,01); NK negativní kontrola, PHA phytohemagglutinin, MSC mesenchymální kmenové buňky; box plot (medián, 25 % a 75 % kvantil, minimum a maximum). sníženým obsahem DNA ukazuje nepřímo míru buněčné apoptózy (10). Statistické metody Pro statistické zhodnocení byl zvolen Wilcoxonův párový test. Analýza byla provedena ve statistickém software R project (The R Foundation for Statistical Computing). Výsledky Provedli jsme celkem 20 vyšetření lymfocytární aktivace po nespecifické stimulaci a analyzovali vliv přítomností mesenchymálních kmenových buněk v kultuře na míru proliferace lymfocytů. Pokles aktivace byl zaznamenán u všech vyšetřovaných vzorků. Detaily viz Graf 2: Analýzy fragmentované DNA. Porovnání procentuálního zastoupení fragmentované DNA u testů inkubovaných společně s MSC a testů inkubovaných bez přítomnosti MSC (n = 40, p = 0,029); box plot (medián, 25 % a 75 % kvantil, minimum a maximum). 260 Alergie 4/2011
Tab. 1: Nespecifická aktivace lymfocytů v závislosti na přítomnosti MSC negativní kontrola negativní kontrola s MSC test s PHA test s PHA a MSC počet měření 20 20 20 20 průměr 0,5 1,4 33,4 18,4 minimum 0,2 0,6 12,4 3,4 maximum 2,4 2,8 48,6 37,3 medián 0,4 1,2 35,4 18,5 SD 0,5 0,6 10,9 9,1 MSC mesenchymální kmenové buňky, PHA phytohemagglutinin SC tabulku 1. Po přidání PHA bylo množství aktivovaných lymfocytů ve skupině testů bez přítomnosti mesenchymálních kmenových buněk 35,4 % a ve skupině s přidanými MSC pouze 18,5 % (mediány). Přítomnost MSC snížila množství aktivovaných lymfocytů o 16,9 % (medián, 18,3 36,8, p < 0,01). Viz graf 1. Při měření kontrolních testů bez ovlivnění pomocí PHA se projevila mírná stimulace lymfocytů samotnými mesenchymálními buňkami. Došlo ke statisticky nevýznamnému zvýšení počtu aktivovaných buněk o 0,8 % ve srovnání s testy bez přidaných MSC (ns). Dále byl sledován obsah fragmentované DNA v kultuře v závislosti na přidání MSC. Kontrolní vzorky bez MSC vykazovaly vyšší obsah fragmentované DNA ve srovnání s testy kokultivovanými s MSC: 20,0 % vs. 17,7 % (mediány). Pokles obsahu fragmentované DNA v kulturách s přidanými MSC byl pozorován ve všech měření (p = 0,029). Blíže viz graf 2. Diskuse Mesenchymální kmenové buňky jsou schopny interakce s imunitním systémem a vykazují efektivní imunomodulační vlastnosti. MSC ovlivňují výsledek imunitní odpovědi inhibicí dvou nejdůležitějších prozánětlivých cytokinů (TNF-α a IFN-γ) a zvýšením exprese supresivních cytokinů především IL-10 (5). Řada studií potvrdila, že MSC mohou při kultivaci snižovat proliferaci T-lymfocytů. Naše data potvrzují, že MSC mají možnost výrazně ovlivnit nespecifickou aktivaci lymfocytů. Po přidání MSC došlo ke snížení počtu proliferujících lymfocytů o 16,9 % ve srovnání s kontrolní skupinou. Potvrdili jsme také minimální imunogenicitu mesenchymálních kmenových buněk. Jejich kokultivace s lymfocyty v kontrolních testech vedla pouze k zanedbatelnému zvýšení lymfocytární proliferační aktivity (0,8 %, ns). MSC poskytují imunomodulační efekt bez ohledu na HLA-inkompatibilitu s testovanou lymfocytární populací a nezpůsobují nežádoucí aktivaci imunitního systému. Pro klinickou aplikaci lze zvažovat nejen autologní, ale i alogenní MSC bez striktních požadavků na HLA-kompatibilitu. Mesenchymální kmenové buňky se prosazují v rámci studií do řady klinických aplikací. V oblasti transplantací hemopoetických kmenových buněk usnadňují engraftment a jsou slibným způsobem léčby chronické formy reakce štěpu proti hostiteli refrakterní na kortikosteroidy (11,12,13). Mohou odvrátit alogenní rejekci po transplantaci solidních orgánů (14). Potenciální využití se nabízí také při léčbě autoimunitních onemocnění jako revmatoidní artritida či lupus erythematodes a stranou nezůstávají ani vrozená onemocnění kostí jako osteogenesis imperfecta (7). MSC produkují řadu růstových faktorů a cytokinů a mohou poskytovat důležitou podporu pro přežití buněk v poškozených tkáních. Po in vivo podání mohou MSC migrovat do míst poškozených tkání, kde mohou podporovat přežití poškozených buněk. Při tom se zároveň uplatňuje jejich protizánětlivé působení (6). MSC jsou také jedním z hlavních buněčných kandidátů ve studiích zaměřených na reparaci celé řady tkání. Z tohoto pohledu byla zajímavým zjištěním naší analýzy menší míra apoptozy resp. udržení lepší viability lymfocytů kultivovaných v přítomnosti MSC. Nalezli jsme o 2,3 % snížený obsah fragmentované DNA u testů inkubovaných s MSC. Nepřímo jsme tak pozorovali protektivní účinek mesenchymálních buněk využívaný v projektech regenerativní medicíny. Potvrdili jsme, že metoda pro přípravu MSC produkuje dostatečné množství buněk, které si zachovávají své funkční vlastnosti a jsou schopné ovlivnit lymfocytární proliferaci. Ověřili jsme metodu testování imunosupresivního potenciálu MSC, která se může stát důležitou součástí jejich charakterizace při přípravě buněk ke klinickému použití především k léčbě GVHD nebo i jiných imunopatologických stavů. Tato práce byla podpořena z výzkumného záměru VZ MSM 0021620812 a grantu IGA NR/9267-3. LITERATURA 1. Trento C, Dazzi F. Mesenchymal stem cells and innate tolerance: biology and clinical applications. Swiss Med Wkly 2010; 140: w13121. 2. Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nature reviews 2008; 8: 726-736. 3. Nauta AJ, Fibbe WE. Immunomodulatory properties if mesenchymal stromal cells. Blood 2007; 110: 3499-3506. 4. Bunnell BA, Betancourt AM, Sullivan DE. New concept on the immune modulation mediated by mesenchymal stem cells. Stem Cell Research & Therapy 2010; 1:34. Alergie 4/2011 261
5. Aggarwal S, Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood 2005; 105: 1815-1822. 6. Le Blanc K, Pittenger MF. Mesenchymal stem cells: progress toward promise. Cytotherapy 2005; 7: 36-45. 7. Le Blanc K, Ringdén O. Immunomodulation by mesenchymal stem cells and clinical experience. J Int Med 2007; 262: 509-525. 8. Bocelli-Tyndall C, Bracci L, Spagnolli G, Braccini A, Bouchenaki M, Ceredig R et al. Bone marrow mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) from healthy donors and auto-immune disease patients reduce the proliferation of autologous- and allogeneic-stimulated lymphocytes in vitro. Rheumatology 2007; 46: 403-408. 9. Ghannam S, Bouffi C, Djouad F, Jorgensen C, Noël D. Immunosuppression by mesenchymal stem cells: mechanisms and clinical applications. Stem Cell Research & Therapy 2010; 1:2. 10. Kajstura M, Halicka HD, Pryjma J, Darzynkiewicz Z. Discontinuous fragmentation of nuclear DNA during apoptosis revealed by discrete sub-g1 peaks on DNA content histograms. Cytometry 2007; 71A: 125-131. 11. Messina C, Faraci M, de Fazio V, Dini G, Calò MP, Calore E. Prevention and treatment of acute GvHD. Bone Marrow Transplant 2008; 41: S65-S70. 12. Von Bonin M, Stölzel F, Goedecke A, Richter K, Wuschek N, Hölig K et al. Treatment of refractory acute GVHD with third-party MSC expanded in platelet lysate-containing medium. Bone Marrow Transplant 2009; 43: 245-251. 13. Le Blanc K, Frassoni F, Ball L, Locatelli F, Roelofs H, Lewis I et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. Lancet 2008; 371: 1579-1586. 14. Ryan JM, Barry FP, Murphy JM, Mahon BP. Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection. Journal of Inflammation 2005; 2:8.MSC expanded in platelet lysate-containing medium. Bone Marrow Transplant 2009; 43: 245-251. Bc. Tomáš Vlas Ústav imunologie a alergologie Fakultní nemocnice Plzeň Alej Svobody 80 304 60 Plzeň e-mail: vlast@fnplzen.cz 262 Alergie 4/2011