TheraScreen : souprava k detekci mutací K-RAS Pro detekci 7 typů mutací genu K-RAS

TheraScreen : souprava k detekci mutací K-RAS Pro detekci 7 typů mutací genu K-RAS K použití se systémem Roche LightCycler 480 Real-Time PCR (Přístroj II) (katalogové číslo: 05015278001) a se systémem Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR (číslo části: 4351105) Včetně uživatelské příručky pro LightCycler Adapt Software v1.1 společnosti Roche Diagnostics (katalogové číslo 05474914001) pro TheraScreen : soupravu CE-IVD k detekci mutací K-RAS. Návod k použití Kódy produktů Velikost soupravy Kódy produktů DxS Objednací číslo Roche Diagnostics 20 reakcí KR-21 05366216190 80 reakcí KR-22 05366224190 Aktuální verze návodu k použití: DU001g Datum poslední revize: květen 2009 Uchovávejte při teplotě -18 C až -25 C. Strana 1 ze 38

Obsah 1. Doporučené použití / indikace k použití...3 2. Souhrn a princip testu...3 3. Technologické principy...4 4. Činidla...6 5. VAROVÁNÍ A PREVENTIVNÍ OPATŘENÍ...7 6. Skladování, stabilita a přepravní podmínky...9 7. Přístroj...9 8. Vzorky...9 9. Protokol detekce mutací genu K-RAS... 14 10. Omezení testu... 25 11. Charakteristika vlastností testu... 26 12. Technická podpora... 34 13. Údaje o výrobci a distributorech... 35 14. Datum vydání poslední revize... 35 15. Literatura... 36 Upozornění pro odběratele:... 38 Strana 2 ze 38

DŮLEŽITÉ: Pečlivě si pročtěte tyto pokyny a před použitím se dobře seznamte se všemi komponentami soupravy K-RAS. 1. Doporučené použití / indikace k použití Předpokládané použití Souprava pro analýzu mutací DxS TheraScreen K-RAS (souprava K-RAS) je testovací souprava pro diagnostiku in vitro určená k detekci sedmi somatických mutací onkogenu K-RAS a poskytuje kvalitativní hodnocení stavu mutace. Souprava K-RAS je určena k použití kvalifikovanými laboratorními odborníky v biochemické laboratoři využívající vzorky DNA izolované z formalinem fixované kolorektální tkáně zalité v parafinu. Indikace k použití Výsledky testu K-RAS slouží v klinické praxi k identifikaci pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem, u kterých není předpoklad úspěchu biologické terapie protilátkami proti epidermálnímu růstovému faktoru (EGFR), jako jsou panitumumab nebo cetuximab. Souprava K-RAS není určena k diagnostice kolorektálního karcinomu. Je určena jako pomocný test doplňující ostatní příslušné prognostické faktory používané k výběru pacientů vhodných k aplikaci biologické terapie anti- EGFR na základě analýzy typu mutace přítomné u nádorových buněk daného pacienta. Typ mutace je posouzen klinickým specialistou spolu s dalšími rysy onemocnění a je vytvořen léčebný plán. Léčebný plán u pacientů s karcinomem se nesmí opírat pouze o výsledek samotného testu mutace onkogenu K-RAS. 2. Souhrn a princip testu Souprava K-RAS je diagnostický prostředek se značkou CE v souladu se směrnicí Evropské unie o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro č. 98/79/ES. Mutace onkogenu K-RAS jsou často nalézány v lidských karcinomech (1-4). Přítomnost těchto mutací souvisí s nedostatečnou terapeutickou odpovědí na léčebné využití inhibitorů EGFR u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem (5-10) (14-21). Detekce sedmi mutací v genu K-RAS je prováděna s využitím divokého typu genomické DNA v PCR analýze v reálném čase založené na technologii DxS Scorpions. Tato metoda je vysoce selektivní za podmínky přítomnosti dostatečného počtu kopií DNA v testu a může detekovat přibližně již 1 % mutací na pozadí divokého typu genomické DNA. Souprava K-RAS stanoví sedm mutací kodonů 12 a 13 onkogenu K-RAS viz tabulka 1. Strana 3 ze 38

Tabulka 1: Mutace K-RAS detekované soupravou DxS COSMIC ID pochází z Katalogu somatických mutací v karcinomech (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) http://www.sanger.ac.uk/genetics/cgp/cosmic/ Mutace Změna bazí Cosmic ID Gly12Ala (GGT>GCT) 522 Gly12Asp (GGT>GAT) 521 Gly12Arg (GGT>CGT) 518 Gly12Cys (GGT>TGT) 516 Gly12Ser (GGT>AGT) 517 Gly12Val (GGT>GTT) 520 Gly13Asp (GGC>GAC) 532 3. Technologické principy Souprava K-RAS využívá k detekci mutací v reakcích PCR v reálném čase kombinaci dvou technologií, ARMS a Scorpions (11, 12, 13). ARMS Specifické amplifikace alely nebo mutace je dosaženo pomocí metody ARMS. Taq DNA polymeráza je mimořádně účinná při rozlišování mezi shodou a neshodou u 3 - konce PCR primeru. Specifické mutované sekvence lze selektivně amplifikovat, dokonce i v případech, kde většina sekvencí není nositelem mutací: Pokud se primer zcela shoduje, amplifikace pokračuje s plnou účinností. Pokud se 3 - báze neshoduje, probíhá pouze nízkoúrovňová nespecifická amplifikace v pozadí reakce. Scorpion Detekce amplifikace se vykonává použitím detekčních sond Scorpion. Sondy Scorpion jsou bifunkční molekuly obsahující PCR primer kovalentně vázaný na sondu. Fluorofor na sondě interaguje se zhášecí přísadou, rovněž připojenou k sondě, která redukuje fluorescenci. Během PCR reakce, kdy se sonda váže na amplikon, se fluorofor a zhášecí přísada oddělí. To vede ke zvýšení intenzity fluorescence v reakční zkumavce. Analýza dat: Metoda Ct Analýza v reálném čase se sondami Scorpion je založena na počtu cyklů PCR potřebných k detekci fluorescenčního signálu nad úrovní signálu pozadí, jako míra cílových molekul přítomných na začátku reakce. Bod, při kterém je detekován signál nad úrovní fluorescence pozadí, se nazývá práh cyklu (Ct). Strana 4 ze 38

Hodnoty Ct vzorku se počítají jako rozdíl mezi Ct analýzy mutací a Ct analýzy kontroly u stejného vzorku. Vzorky jsou hodnoceny jako pozitivní pro mutaci, pokud dávají hodnoty Ct menší než 1 % hodnoty Ct pro tento test. Nad tuto hodnotu může tento vzorek obsahovat méně než 1 % mutace (mimo limit analýzy), nebo je vzorek negativní pro danou mutaci. Při použití primerů ARMS může nastat neúčelný priming, který se projeví pozdním Ct pozadí u DNA neobsahující mutaci. Všechny hodnoty Ct vypočtené z amplifikace pozadí budou větší než 1 % Ct. Takový vzorek je hodnocen jako negativní pro danou mutaci. Souprava K-RAS je diagnostický prostředek se značkou CE pro diagnostické použití in vitro buď se systémem Roche Diagnostics LightCycler 480 Real-Time PCR (Přístroj II) (přístroj LightCycler 480) s 96 jamkami, katalogové číslo součásti Roche: 05015278001 nebo se systémem Applied BioSystems 7500 Real-Time PCR, katalogové číslo součásti 4351105 (ABI7500). V případě použití přístroje LightCycler 480 je nutné soupravu K-RAS používat se softwarem LightCycler Adapt v1.1 pro TheraScreen soupravu CE-IVD k detekci mutací K-RAS (TheraScreen K-RAS Mutation Kit CE-IVD, LightCycler Adapt Software). Tento software byl vyvinut pro automatické vykreslení pozitivního nebo negativního amplifikačního diagramu a dokáže vypočítat příslušnou prahovou hodnotu, která slouží k získání hodnot Ct. Ty se používají k výpočtu hodnot Ct vzorku, které se porovnávají s 1 % hraničními hodnotami. Software vykáže pozitivní nebo negativní výsledek pro mutaci a z analýzy vyloučí jakoukoli subjektivní interpretaci dat testovaných soupravou K-RAS. Formát soupravy K-RAS Souprava K-RAS je dodávána ve formátu osmi analýz. Jedna kontrolní analýza. Sedm analýz mutace. Všechny reakční směsi obsahují přidanou kontrolu testu (vnitřní kontrola) označenou HEX (monitorovanou detektorem barviva JOE v přístroji ABI7500). Slouží ke kontrole přítomnosti inhibitorů, které mohou způsobit falešně negativní reakci. Kontrolní analýza Kontrolní analýza, značená FAM, je použita k vyhodnocení celkového množství DNA ve vzorku. Tato kontrolní analýza amplifikuje oblast exonu 4 genu K-RAS. Primery a sonda byly navrženy tak, aby bylo možné eliminovat všechny známé polymorfismy genu K-RAS. Strana 5 ze 38

Analýzy mutace Každá analýza mutace značená FAM obsahuje jeden primer Scorpion plus jeden primer ARMS pro rozlišení mezi přirozenou DNA divokého typu a mutantní DNA detekovanou analýzou PCR v reálném čase. 4. Činidla Tato souprava K-RAS obsahuje dostatečné množství činidel k provedení kvalitního vyhodnocení vzorků a k provedení testů K-RAS pro až 20 nebo 80 reakcí v závislosti na velikosti soupravy. Velikost soupravy Kódy produktů DxS Objednací číslo Roche Diagnostics 20 reakcí KR-21 05366216190 80 reakcí KR-22 05366224190 Počet vzorků, který lze testovat, závisí na velikosti dávky vzorků. Tabulka 2: Obsah soupravy K-RAS Dodávaná činidla 20 reakcí 80 reakcí Objem Objem Zkumavka Směs kontrolní reakce 1300 µl 5200 µl 1 Reakční směs 12ALA 650 µl 2600 µl 2 Reakční směs 12ASP 650 µl 2600 µl 3 Reakční směs 12ARG 650 µl 2600 µl 4 Reakční směs 12CYS 650 µl 2600 µl 5 Reakční směs 12SER 650 µl 2600 µl 6 Reakční směs 12VAL 650 µl 2600 µl 7 Reakční směs 13ASP 650 µl 2600 µl 8 Směs standardu 300 µl 1000 µl 9 Taq DNA polymeráza 60 µl 240 µl 10 Zařízení a činidla nedodávaná se soupravou K-RAS Uživatel testovací sady bude potřebovat následující zařízení a spotřební materiál: Přístroj LightCycler 480 nebo přístroj ABI7500 Real-time PCR, který dokáže provádět cykly podle specifikací uvedených v části 9 Protokol detekce mutací genu K-RAS. Software LightCycler Adapt v1.1 společnosti Roche Diagnostics (katalogové číslo 05474914001). 0,2 ml destičky PCR bez DNA-ázy (LightCycler 480 Instrument Multiwell Plate 96, katalogové číslo 04729692 001 nebo reakční destička ABI MicroAmp Optical s 96 jamkami, katalogové číslo 4306737, s adhezivním filmem MicroAmp Optical, katalogové číslo 4311971). Sterilní zkumavky pro přípravu základních směsí. Jednorázové pipety pro přípravu PCR směsi. Strana 6 ze 38

Jednorázové pipety pro přidání vzorku DNA. Sterilní H 2 O (nesmí obsahovat nukleázu). 5. VAROVÁNÍ A PREVENTIVNÍ OPATŘENÍ Pouze pro diagnostické účely in vitro. Souprava K-RAS Kit není určena ke skríninku nebo k diagnostice jakéhokoliv typu karcinomu nebo kolorektálního karcinomu. Je určena k použití jako pomocná metoda ostatních prognostických faktorů aktuálně používaných k výběru těch pacientů, kteří by neměli prospěch z protinádorové léčby protilátkami anti-egfr. Léčba pacientů se zhoubným nádorem by se neměla opírat pouze o samotný výsledek analýzy stavu mutace genu K-RAS. Klinický specialista musí posoudit charakter mutace u pacienta společně s ostatními faktory onemocnění. Obsah soupravy K-RAS může být opakovaně zmražen/rozmražen až 8krát bez negativního dopadu na kvalitu provedení analýzy. NEROZMRAZUJTE činidla soupravy K-RAS více než 8krát. Obecně platí, že vzorky nádorů jsou nehomogenní a naměřené údaje ze vzorku nádoru nemusí být shodné s ostatními částmi stejného nádoru. Vzorky nádoru mohou také obsahovat nenádorové tkáně. DNA z těchto nenádorových tkání nebude obsahovat mutace K-RAS detekované touto soupravou. Všechny analýzy v této soupravě K-RAS vytvářejí krátké produkty PCR. Ovšem souprava K-RAS nebude fungovat se vzorky silně fragmentované DNA. Analýza DNA by měla být provedena metodou PCR kvantifikace a může se lišit od kvantifikace založené na odečtených hodnotách optické hustoty. V soupravě se dodává navíc kontrolní reakční směs, která umožní posouzení kvality a kvantity DNA u vzorků před zpracováním testy mutace soupravy K-RAS. Činidla v soupravě K-RAS jsou optimálně naředěna. Další ředění činidel se nedoporučuje a může mít za následek zhoršení kvalitativních vlastností testu. Použití menšího reakčního množství než 25 µl se nedoporučuje pro nárůst rizika získání falešně negativních výsledků. Všechna činidla v soupravě K-RAS jsou zvlášť připravena pro použití v uvedených reakcích. K soupravě K-RAS, nebo k činidlům obsaženým v této soupravě, by se neměly přidávat žádné náhradní reagencie nebo pomůcky, pokud se mají zachovat optimální vlastnosti testu. K zajištění optimální kvality a účinnosti primerů by primery Scorpions (jako je tomu u všech fluorescenčně označených molekul) měly být chráněny před světlem, aby se zabránilo optickému vyblednutí molekul. Strana 7 ze 38

Buďte zvláště opatrní a zabraňte kontaminaci PCR reakcí se syntetickým kontrolním materiálem. Při přípravě reakčních směsí a přidávání vzorku DNA se doporučuje používat zvláštní jednorázové pipety. Příprava a rozdělení reakčních směsí by se měly provádět v prostoru odděleném od místa přidávání vzorku. Zkumavky by se po PCR reakcích nikdy neměly otevírat. Každý test, zahrnutý do soupravy K-RAS, má své vlastní charakteristiky. Výpočet výsledku se musí uskutečnit se zřetelem na správné parametry testu (viz oddíl Interpretace přehledů/dat) Ct pro vzorky mutace s hodnotou 38 nebo vyšší se vyhodnotí jako negativní nebo pod limity detekce soupravy. Testy obsahují navíc přidanou kontrolní reakci (vnitřní kontrola) (viz oddíl Technologické principy). Pokud oba testy selhaly, naměřené údaje se musí vyřadit, neboť mohou být v PCR reakci přítomny inhibitory, což by mohlo vést k falešně negativním výsledkům. Zředění vzorku může omezit účinek inhibitorů; je však třeba poznamenat, že by také došlo ke zředění vstupního množství DNA. Je potřeba dodržovat standardní laboratorní postupy, například: a) Nepipetujte ústy. b) Nekuřte, nejezte nebo nepijte v prostorech, kde se zachází se vzorky nebo činidly soupravy. c) Po provedení testu si umyjte ruce. Používejte pouze Taq polymerázu (Taq), která se nachází v soupravě, nemíchejte a neupravujte Taq z jiných souprav stejného nebo jiného typu nebo Taq od jiného dodavatele. Rozmrazujte pouze činidla, která se aktuálně používají pro jednotlivé kroky analýzy, nerozmrazujte pokaždé celou soupravu, aby se minimalizoval počet cyklů zmražení/rozmražení. Bezpečnostní informace Upozornění: Všechny chemické látky a biologický materiál by se měly považovat za potenciálně nebezpečné. Vzorky jsou potenciálně infekční a podle toho by se s nimi mělo zacházet. Soupravu K-RAS by měly používat pouze osoby, které byly vyškoleny v příslušných laboratorních technikách. Při práci s komponenty soupravy K-RAS vždy používejte vhodný laboratorní pracovní oděv, jednorázové rukavice a ochranné brýle. Po použití by se měly komponenty soupravy K-RAS zlikvidovat jako infekční odpad. Strana 8 ze 38

6. Skladování, stabilita a přepravní podmínky Skladování Veškerý obsah soupravy K-RAS by se měl okamžitě po přijetí uložit do mrazničky s konstantní teplotou -18 C až -25 C, v temnu. Vyvarujte se zbytečného zmrazování a rozmrazování obsahu soupravy K-RAS. Stabilita Nepoužívejte soupravu K-RAS po uvedené době expirace. Obsah soupravy K-RAS je stabilní až do data expirace, pokud se skladuje za doporučených podmínek a v původním balení. Obsah soupravy K-RAS může být opakovaně zmražen/rozmražen až 8krát bez negativního dopadu na kvalitu provedení analýzy. NEROZMRAZUJTE činidla soupravy K-RAS více než 8krát. Přepravní podmínky Obsah soupravy K-RAS se dodává na suchém ledu a při dodání by měl být stále ještě zmrzlý. Pokud není souprava K-RAS po dodání zmrzlá, během přepravy došlo k otevření vnějšího obalu, zásilka neobsahuje balicí list, návod k použití nebo činidla, kontaktujte pobočku Vašeho distributora výrobků společnosti Roche Diagnostics; kontaktní informace najdete v oddíle 12 Technická podpora. 7. Přístroj Kompletní pokyny pro instalaci a používání přístroje pro PCR analýzu v reálném čase najdete v uživatelském manuálu přístroje. 8. Vzorky Materiál vzorků musí být lidská genomická DNA izolovaná z formalinem fixovaných vzorků tkáně kolorektálního karcinomu zalitých v parafinu. Odběr a příprava vzorku 1. Přeprava vzorku: Standardní patologická metodologie zajistí kvalitu vzorku. 2. Doporučený postup extrakce vzorku: Extrakce DNA pomocí soupravy pro extrakci DNA z tkáně Qiagen QIAamp DNA FFPE (katalogové číslo 56404). Je nutné použít následující doplňky protokolu Qiagen: Vzorky FFPE (formalinem fixované kolorektální tkáně zalité v parafinu) je nutné odebrat na skleněná sklíčka. Nadbytečný parafín je nutné seškrábat z okolí tkáně pomocí nepoužitého sterilního skalpelu. Materiál vzorku tkáně seškrábejte do zkumavek mikrocentrifugy. Pro každý extrahovaný vzorek použijte dosud nepoužitý sterilní skalpel. Strana 9 ze 38

Rozklad vzorku pomocí proteinázy K musí pokračovat až do úplného dokončení. To může trvat až 48 hodin. Vzorky je nutné eluovat do 200 µl pufru ATE z extrakční soupravy Qiagen. Jakoukoli alternativní metodu přípravy vzorků musí koncový uživatel validovat. 3. Uchovávání izolované DNA: Před analýzou uchovávejte při teplotě 20 C. Protokol pro vyhodnocení vzorků Pro vyhodnocení celkové DNA ve vzorku je nutné použít kontrolní reakční směs navíc. Tato kontrolní analýza amplifikuje oblast exonu 4 genu K-RAS. Vzorky je nutné testovat pouze pomocí této kontrolní analýzy a použít smíšený standard jako pozitivní kontrolu a vodu jako kontrolu bez vzorku. Je třeba poznamenat, že aby bylo možné optimálně využít činidla soupravy K-RAS, je vhodné vzorky zpracovávat v dávce. Veškerá zpracování musí obsahovat kontroly. Jestliže se vzorky testují jednotlivě, spotřebuje se více činidel a tak se sníží množství vzorků, které lze testovat pomocí soupravy K-RAS. Protokol pro vyhodnocení vzorků - uspořádání destičky 1. Při pokojové teplotě rozmrazte kontrolní reakční směs a smíšený standard ze soupravy K-RAS. Promíchejte každý roztok otočením každé zkumavky 10krát ihned po rozmražení, aby nedošlo k místním rozdílům v koncentraci solí. Připravte si dostatečné množství směsí pro vzorky DNA, jednu reakci smíšeného standardu a jednu reakci kontroly bez vzorku, plus navíc 2 reakce. 2. Pro přípravu základní směsi použijte takové množství činidel na každou reakci, jak je uvedeno v tabulce 3. Tabulka 3: Množství základní směsi kontrolního testu Analýza Základní směs Reakční směs Taq (µl)x1 (µl)x1 Kontrolní test 19,8 0,2 3. NEPROMÍCHÁVEJTE Taq nebo jakékoliv reakční směsi obsahující Taq, může to způsobit inaktivaci enzymů. 4. Před použitím ponechte Taq temperovat při pokojové teplotě. Ampulku Taq krátce odstřeďujte, aby se veškerá Taq shromáždila na dně ampulky. Pak pipetujte umístěním špičky pipety těsně pod hladinu Taq, aby nedošlo k pokrytí vnější strany špičky pipety nadměrným množstvím Taq. 5. Opakovaným nasátím pipetou opatrně smíchejte základní směs. Strana 10 ze 38

6. Okamžitě přidejte 20 µl kontrolní základní směsi do každé z reakčních jamek. 7. Okamžitě přidejte 5 µl testovaného vzorku, smíšeného standardu nebo vody (pro kontroly bez vzorku) do reakčních jamek. 8. Destička musí mít smíšený standard v jamce A1 a kontrolu bez vzorku (vodu) v jamce A2. Všechny ostatní jamky musí obsahovat vzorky. 9. Uzavřenou PCR destičku krátce odstřeďujte, aby se činidla usadila na dno jamek. 10. Postupujte podle nastavení přístroje pro příslušnou platformu. Protokol pro vyhodnocení vzorků nastavení přístroje LightCycler 480 1. Okamžitě vložte destičku do přístroje LightCycler 480. 2. Na ploše pracovní stanice připojené k přístroji zvolte ikonu softwaru LightCycler 480. Přihlaste se do aplikace a na obrazovce Overview zvolte New Experiment from Template. Z uvedených templátů pro běh testů zvolte K-RAS LC480II Run Template. Tento templát bude mít následující parametry: 1. Formát detekce je DxS IVD Assays. 2. Reakční objem je 25. 3. Iniciální krok analýzy (hold step) při 95 C 4 minuty. 4. Amplifikace ve dvou krocích pro 45 cyklů s denaturací při 95 C po dobu 30 sekund a teplota temperování při 60 C po dobu 1 minuty. Fluorescenční signál je jediná akvizice při 60 C. 3. Zvolte záložku Sample Editor a v Step 1: Select Workflow zvolte zaškrtávací políčko Abs Quant. V části Select Filter Combinations se ujistěte, že jsou zvoleny oba filtry (465-510 nm a 533-580 nm). V krocích 2 a 3 zvolte názvy vzorků. Pole Quantification Sample Type by mělo mít hodnotu unknown. Sloupec replikátů by měl zůstat prázdný. 4. Zvolte tlačítko Experiment a klepněte na tlačítko Start Run, kterým uložíte test a spustíte cyklus. 5. Po dokončení běhu testu zvolte záložku Analysis a v okně Create New Analysis zvolte Abs Quant/2nd Derivative Max. Na obrazovce Create New Analysis potvrďte výchozí hodnoty. Ujistěte se, že tlačítko Filter Comb má hodnotu 465-510 a zvolte tlačítko Calculate. Hodnoty Ct jsou zobrazeny v tabulce Samples. Strana 11 ze 38

6. Zvolte tlačítko Filter Comb a změňte filtry na hodnotu 533-580 nm. Zvolte tlačítko Calculate a získáte hodnoty Ct exogenních kontrol v tabulce Samples. Protokol pro vyhodnocení vzorků nastavení přístroje ABI7500 1. Okamžitě vložte destičku do přístroje ABI7500. 2. Na ploše pracovní stanice připojené k přístroji zvolte ikonu softwaru systému 7500. V softwaru 7500 Sequence Detection, verze 1.4 otevřete v nabídce nový soubor běhu testu. 3. V Assay zvolte Standard Curve (Absolute Quantification). V Run Mode zvolte Standard 7500. 4. Pomocí tlačítka Next se přesuňte do okna nastavení detektoru. K seznamu detektorů přidejte detektory FAM a JOE, jako zhášecí přísady zvolte none. Jestliže tyto detektory ještě nejsou definovány, zvolte tlačítko New Detectors a u detektorů FAM a JOE nastavte zhášecí přísady na none. 5. Nastavte Passive Reference na None a zvolte tlačítko Next. 6. Zvolte celou destičku a zaškrtněte políčka detektorů FAM a JOE, aby tak byly monitorovány obě barviva ve všech jamkách. Zvolte tlačítko Finish. 7. Na záložce Instrument nastavte cyklování podle tabulky 4. Tabulka 4: Parametry cyklů ABI7500 Teplota Čas Cykly Sběr dat Fáze 1 95 o C 4 min 1 Fáze 2 95 o C 30 sek 60 o C 1 min 40 FAM, JOE 8. Zvolte tlačítko Start, kterým uložíte test a spustíte cyklus. 9. Po dokončení běhu testu zajistěte, aby na zobrazovacím panelu jamek byla nastavena pasivní reference na none. Na záložce Amplification Plot vyberte všechny používané jamky a z rozbalovací nabídky detektoru vyberte JOE dye (barvivo JOE). 10. Zkontrolujte signál JOE každého vzorku a porovnejte ho se signálem JOE jamky NTC (kontroly bez vzorku). Všímejte si vzorků, které mají pozdní amplifikační křivku nebo neúspěšnou amplifikaci u exogenní kontroly ve srovnání s kontrolou bez vzorku. Strana 12 ze 38

11. Na záložce Amplification Plot vyberte všechny používané jamky a z rozbalovací nabídky detektoru vyberte FAM dye (barvivo FAM). Použijte automatické nastavení základní úrovně a manuální Ct a pak pomocí logaritmické stupnice pro osu Y ručně nastavte práh uprostřed exponenciální fáze, jak je popsáno v uživatelské příručce k přístroji ABI7500. 12. Tlačítkem Analyse získáte hodnoty Ct. Interpretace vyhodnocení vzorků Vyhodnoťte hodnoty Ct u kontrol bez vzorků a ujistěte se, že nedošlo ke kontaminaci, která by vykazovala amplifikaci na kanálu FAM (Ct méně než 40) nebo že nedošlo k neúspěšné reakci exogenní kontroly na kanálu HEX (žádná hodnota Ct), což by znamenalo problém v nastavení. Smíšený standard by měl v přístroji ABI7500 vykazovat hodnotu Ct u kontrolního testu (kanál FAM) 26-29 a v přístroji LightCycler 480 by tato hodnota měla být 29. Údaje se nesmí používat, jestliže alespoň jedna z těchto dvou kontrol byla neúspěšná. Kontrolní test dává hodnotu Ct 29-35: Interpretujte opatrně, protože mutace s nízkou citlivostí nemusí být možné detekovat. Kontrolní test dává hodnotu Ct 35-38: Ve vzorku je přítomno jen málo amplifikovatelných exemplářů DNA a mutace jsou detekovatelné pouze tehdy, pokud je většina exemplářů mutovaná. Kontrolní test dává hodnotu Ct 38: Vzorek odmítněte, protože je ve vzorku minimální množství DNA a souprava K-RAS nebude schopna detekovat mutace. Pamatujte na to, že jestliže bude vzorek vykazovat pozdní hodnotu Ct u kontrolního testu, hodnoty Ct exogenní kontroly u testování vzorku je nutné porovnat s exogenní kontrolou bez vzorku. Jestliže exogenní kontrola u testování vzorku je zpožděná nebo negativní (ve srovnání s kontrolou bez vzorku, může být přítomen inhibitor. Ředěním vzorku je možné snížit účinek inhibitoru, i když tímto zároveň dojde k ředění DNA. Ředění vzorku: Hodnota Ct u kontroly < 24 povede k inhibici reakce z důvodu vysokého vstupního množství DNA v testu mutace. Vzorky s hodnotou Ct u kontroly < 24 se musí ředit. Je nutné zmínit, že u přístroje LightCycler 480 mohou být hodnoty Ct získané 2. derivativní metodou mírně odlišné, než hodnoty získané ze softwaru LightCycler Adapt. Je doporučeno, aby koncentrované vzorky byly naředěny, aby byly v rozmezí >24 a < 29 (hodnoty Ct založené na softwaru 7500 Sequence Detection nebo softwaru přístroje LightCycler 480). Vycházejte z předpokladu, že naředění ½ zvýší hodnotu Ct o 1. Strana 13 ze 38

9. Protokol detekce mutací genu K-RAS Pečlivě si pročtěte tyto pokyny a před použitím se dobře seznamte se všemi komponentami soupravy K-RAS. Abyste mohli efektivně využít soupravu K-RAS, vzorky je nutné uspořádat do sad po 10 (a vyplnit tak destičku s 96 jamkami). Jestliže by byly sady menší, znamenalo by to, že pomocí soupravy K-RAS zpracujete menší množství vzorků. Nastavení přístroje LightCycler 480 Pro každý vzorek DNA je třeba provést kontrolní test a test na přítomnost mutace ve stejném běhu PCR reakce, aby byly vyloučeny rozdíly jednotlivých provedení testu. 1. Při pokojové teplotě rozmrazte reakční směsi a smíšený standard ze soupravy K-RAS. Promíchejte každý roztok otočením každé zkumavky 10krát ihned po rozmražení, aby nedošlo k místním rozdílům v koncentraci solí. Připravte si dostatečné množství směsí pro vzorky DNA, smíšený standard a kontroly bez vzorku, plus navíc 2 reakce na každou sestavu jako rezervu, jak je uvedeno v tabulce 5. Tabulka 5: Množství základní směsi soupravy K-RAS Analýza Kontrolní analýza Analýzy mutace Reakční směs (µl)x1 Základní směsi Reakční směs (µl) Taq (µl)x1 na destičce (x14) Taq (µl) na destičce (x14) 19,8 0,2 277,2 2,8 19,8 0,2 277,2 2,8 2. NEPROMÍCHÁVEJTE Taq nebo jakékoliv reakční směsi obsahující Taq, může to způsobit inaktivaci enzymů. 3. Před použitím ponechte Taq temperovat při pokojové teplotě. Ampulku Taq krátce odstřeďujte, aby se veškerá Taq shromáždila na dně ampulky. Pak pipetujte umístěním špičky pipety těsně pod hladinu Taq, aby nedošlo k pokrytí vnější strany špičky pipety nadměrným množstvím Taq. 4. Opakovaným nasátím pipetou opatrně smíchejte základní směsi. 5. Okamžitě přidejte 20 µl základní směsi do každé z reakčních jamek. 6. Okamžitě přidejte 5 µl testovaného vzorku, smíšeného standardu nebo vody (pro kontroly bez vzorku) do reakčních jamek. Každý vzorek DNA musí být testován pomocí obou analýz - kontrolní i mutační. Uspořádání destičky je v tabulce 6. Strana 14 ze 38

Tabulka 6: Uspořádání destičky soupravy K-RAS Uspořádání s 96 jamkami Analýza 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Kontrola Smíšený standard B Smíšený 12ALA standard C Smíšený 12ASP standard D Smíšený 12ARG standard E Smíšený 12CYS standard F Smíšený 12SER standard G Smíšený 12VAL standard H Smíšený 13ASP standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) 7. Uzavřenou PCR destičku krátce odstřeďujte, aby se činidla usadila na dno jamek. 8. Okamžitě vložte destičku do přístroje LightCycler 480. Nastavení přístroje LightCycler 480 1. Na ploše pracovní stanice připojené k přístroji zvolte ikonu softwaru přístroje LightCycler 480. Přihlaste se do aplikace a na stránce s celkovým přehledem zvolte New Experiment from Template. 2. Ze seznamu Run Templates vyberte K-RAS LC480II Run Template (podrobnosti viz oddíl vyhodnocení vzorků v přístroji LightCycler 480). 3. Zvolte záložku Sample Editor a v Step 1: Select Workflow zvolte zaškrtávací políčko Abs Quant. V části Select Filter Combinations se ujistěte, že jsou zvoleny oba filtry (465-510 nm a 533-580 nm). V krocích 2 a 3 zvolte názvy vzorků. Ve sloupci 1 musí být název vzorku smíšený standard. Ve sloupci 2 musí být název vzorku NTC. Do sloupců 3-12 napište názvy vzorků. Názvy musí být stejné pro všechny jamky v 1. sloupci. Pole Quantification Sample Type by mělo mít hodnotu unknown. Sloupec s replikáty by měl zůstat prázdný, protože replikáty nebere software LightCycler Adapt v úvahu. 4. Zvolte tlačítko Experiment a klepněte na tlačítko Start Run, kterým uložíte test a spustíte cyklus. Strana 15 ze 38

Analýza vzorků v přístroji LightCycler 480 1. Po dokončení běhu testu přístroje LightCycler 480 pomocí okna pro navigaci exportujte testy (soubor.ixo) na vhodné místo, kam může přistoupit software LightCycler Adapt. 2. DŮLEŽITÉ: Software LightCycler Adapt je validován pro použití na jednom počítačovém systému, jenž je definován jako jedna kontrolní jednotka (pracovní stanice), kterou dodává společnost Roche Diagnostics a která slouží k práci s jedním přístrojem LightCycler 480 II. Tato validace softwaru LightCycler Adapt v současné době platí pouze pro kontrolní jednotku, která je jako samostatný počítač (tj. není součástí sítě). Použití jakéhokoli jiného počítače je zakázáno, protože software v takovém případě nemusí správně fungovat. 3. Spusťte software LightCycler Adapt klepnutím na ikonu softwaru LightCycler Adapt na ploše pracovní stanice a do políčka zadejte přihlašovací jméno. Toto jméno bude sloužit jako jméno autora přehledu výsledků testů. 4. V hlavním okně zvolte pomocí tlačítka prohlížeče jeden soubor běhu testu pro přístroj LightCycler 480 (Budete-li chtít tento výběr zrušit, budete muset software ukončit a znovu spustit). 5. Zvolte formát přehledu (pdf nebo csv). Zvolíte-li csv, formát pdf se zvolí automaticky navíc také. 6. Volbou Analyse vytvoříte přehled výsledků. Přehled se automaticky uloží do složky se souborem běhu testu a bude mít stejný název jako on. 7. Přehled se automaticky zobrazí. 8. Publikovatelný výsledek se zobrazí ve sloupci Mutation Status v tabulce Sample Result. Interpretace přehledu ze softwaru LightCycler Adapt 1. Přehled ze softwaru LightCycler Adapt obsahuje všeobecné informace o analýze. 1.1. Autor přehledu výsledků je osoba, která spustila software a vytvořila přehled. 1.2. Datum a čas analýzy jsou dány. 2. Přehled výsledků poskytuje souhrn analýzy a uvádí název souboru běhu testu, soubor definice algoritmu a sekvenci algoritmu. Detaily algoritmu jsou dány a nelze je měnit. 3. Část s výsledky uvádí celý název a cestu souboru běhu testu přístroje LightCycler 480 a následující podrobnosti: 3.1. Výrobní číslo přístroje LightCycler 480. 3.2. Název přístroje identifikátor přidělený přístroji LightCycler 480 softwarem LightCycler 480. Strana 16 ze 38

3.3. Datum běhu testu datum a čas běhu testu přístroje LightCycler 480. 3.4. Laborant zpracovávající test jméno osoby, která byla přihlášena v softwaru přístroje LightCycler 480 v době běhu testu. 3.5. Název testu název souboru běhu testu. 3.6. Verze softwaru verze softwaru, kterou přístroj LightCycler 480 používá. 3.7. Číslo šarže používá se číslo z pole Lot No v okně nastavení testu v softwaru LightCycler 480. 4. V uspořádání destiček se používají názvy vzorků, které pocházejí z okna editoru vzorků softwaru přístroje LightCycler 480. 5. Pod Run Summary Result je uvedeno, zda je běh testu platný nebo neplatný. To závisí na kontrolách běhu testu ve sloupcích 1 a 2. 6. Kontroly běhu testu 6.1. Software LightCycler Adapt automaticky vypočítá hodnotu Ct smíšeného standardu pomocí vzorce: Ct analýzy vzorku s mutací Ct analýzy kontroly = Ct 6.2. Software LightCycler Adapt srovná tyto hodnoty s očekávanými hodnotami podle tabulky 7. Tabulka 7: Očekávané hodnoty Ct v softwaru LightCycler Adapt Analýza Ct smíšeného standardu 12ALA -0,61 12ASP -0,61 12ARG 0,34 12CYS -0,79 12SER -0,13 12VAL 0,1 13ASP -0,74 6.3. Jsou vykázány hodnoty Ct a Ct. 6.4. Ve sloupcích 1 a 2 se u kontrol běhu testu mohou objevit tyto značky/varování: Strana 17 ze 38

Tabulka 8: Značky/varování softwaru LightCycler Adapt u kontrol běhu testu Značky/varování CT_OUT_OF_RANGE EXO_FAIL DELTA_CT_OUT_OF_RANGE EXO_CONTROL_INVALID TARGET_CHANNEL_INVALID Strana 18 ze 38 Význam Hodnota Ct FAM u kontroly testu je mimo rozsah U smíšeného standardu je exogenní kontrolní Ct<30 nebo je negativní, když je výsledek FAM negativní Hodnoty Ct vzorku s mutací jsou mimo nastavený rozsah Došlo k neúspěšné reakci exogenní kontroly bez vzorku Reakce FAM má pozitivní hodnotu Ct u kontroly bez vzorku 6.4.1. Význam značek/varování je podrobněji popsán níže: 6.4.1.1. CT_OUT_OF_RANGE Kontrolní test smíšeného standardu musí mít hodnotu Ct 26,60 ± 2. Jestliže je test mimo tento rozsah, zobrazí se tato značka/varování u všech jamek smíšeného standardu, protože hodnoty Ct nejsou vypočítány a smíšený standard je neplatný. To znamená, že kontrolní test nefunguje správně. 6.4.1.2. EXO_FAIL Tato značka/varování se zobrazí, když test exogenní kontroly u kterékoli jamky obsahující smíšený standard má hodnotu menší než 30, což může znamenat, že u této směsi došlo k PCR kontaminaci. Jestliže je test exogenní kontroly neúspěšný, když je neúspěšná reakce FAM u kterékoli jamky obsahující smíšený standard, zobrazí se značka/varování EXO_FAIL také. To znamená, že u tohoto testu došlo k problému, což může vést k falešně negativním výsledkům. Smíšený standard je již neplatný kvůli selhání FAM. 6.4.1.3. DELTA_CT_OUT_OF_RANGE Jestliže hodnoty Ct smíšeného standardu jsou v rozmezí ±2,00 hodnot uvedených v tabulce 7, software vykáže platný stav. Jestliže je hodnota Ct mimo očekávaný rozsah, stav nebude platný a zobrazí se tato značka/varování. To znamená, že u testu došlo k problému, což může vést k falešným výsledkům. 6.4.1.4. EXO_CONTROL_INVALID V jamkách s kontrolami bez vzorku musí test exogenní kontroly dát pozitivní výsledek ve všech 8 jamkách (Ct < 41). Jestliže je výsledek negativní, zobrazí se tato značka/varování a stav testu je neplatný. To znamená, že u testu došlo k problému, což může vést k falešným výsledkům. 6.4.1.5. TARGET_CHANNEL_INVALID V 8 jamkách s kontrolami bez vzorku musí být výsledek FAM negativní (Ct > 38). Jakákoli amplifikace znamená kontaminaci. Pozitivní výsledek zobrazí značku/varování a kontrola bez vzorku bude neplatná.

6.5. V případě neplatného stavu kterékoli jamky se smíšeným standardem nebo jamky s kontrolou bez vzorku bude ve sloupci Run Summary Result hodnota Run Invalid (Běh testu neplatný). V Sample Result Table budou názvy vzorků a hodnoty Ct kontrol, ale stav mutace bude vyhodnocen jako invalid. Smíšený standard ukazuje, že všechny testy fungují správně. Jestliže tomu tak není, může docházek k falešně pozitivním nebo falešně negativním výsledkům vzorků s mutací. Kontrola bez vzorku ukazuje, že v základních směsích není žádná kontaminace a exogenní kontrola funguje tak, jak má. 6.6. V nepravděpodobném případě, kdy software LightCycler Adapt vypíše chybové hlášení, si prostudujte oddíl 12, Technická podpora. 7. Výsledky vzorků 7.1. V tabulce Sample Result Table najdete názvy vzorků, které pocházejí ze softwaru přístroje LightCycler 480 a hodnoty Ct kontrolních testů. 7.2. Software LightCycler 480 Adapt spočítá hodnoty Ct a určí, zda vzorek je pozitivní nebo negativní pro mutaci na základě 1% hraniční hodnoty. Tabulka 9: 1% hraniční hodnoty softwaru LightCycler Adapt Analýza 1% delta Ct 12ALA 6,25 12ASP 7,72 12ARG 6,83 12CYS 6,95 12SER 8,95 12VAL 6,5 13ASP 9,09 7.3. Pokud je hodnota Ct vzorku s mutací menší než odpovídající hraniční hodnota pro 1 %, vzorek je klasifikován jako pozitivní pro mutaci. Software LightCycler Adapt vyhodnotí, která mutace je přítomná, ale vyhodnotí pouze jednu mutaci. Jsou-li 2 pozitivní hodnoty Ct, bude vykázána menší hodnota. Předpokládá se, že druhá hodnota vznikla díky zkřížené reakci primeru detekujícího danou mutaci vázajícího se a vytvářejícího priming s jinou mutací. Vzácně, když jsou přítomny dvojité mutace, klinické posouzení bude stejné, jako v případě přítomnosti jedné mutace. 7.4. Jestliže hodnoty Ct vzorku jsou větší než hodnoty 1% Ct, vzorek lze vyhodnotit jako negativní pro mutaci (může sice obsahovat mutaci, ale pouze úroveň, která je pod limity detekce soupravy). 7.5. Značky/varování 7.5.1. Software LightCycler Adapt přiřadí vzorkům v tabulce Sample Result Table značky/varování, které jsou vysvětlené v tabulce 10. Strana 19 ze 38

Tabulka 10: Značky/varování přiřazené vzorkům softwarem LightCycler Adapt Značka/varování Význam REP_DILUTION Ct kontroly je menší než 24 CONF_LEVEL Ct kontroly je větší než 28,9 není vyhodnocena žádná mutace LIMITED Ct kontroly je větší než 35 EXO_FAIL Test exogenní kontroly nebyl úspěšný a reakce FAM v mutační reakci také nebyla úspěšná, nebo Ct exogenní kontroly je menší než 30. FAIL Software není schopen vykreslit křivku jako pozitivní nebo negativní 7.5.2. Význam značek/varování je podrobněji popsán níže: 7.5.2.1. REP_DILUTION Ct kontroly < 24. Testy byly validovány na úrovni koncentrace DNA, která vykazuje Ct kontroly 24 nebo vyšší. Jestliže vzorek vykazuje nižší Ct kontrolního testu, je nutné ho zředit, aby byl v platném rozsahu. 7.5.2.2. CONF_LEVEL Ct kontroly > 28,9. Značka/varování CONF_LEVEL se zobrazí u negativního vzorku s Ct kontroly > 28.9. Hodnoty Ct pro vzorky mutace s hodnotou 38 nebo vyšší se vyhodnotí jako negativní nebo mimo limity detekce soupravy. Je nutné dosáhnout hodnoty Ct kontroly 28,9 nebo nižší, aby bylo možné poskytnout dostatek DNA pro detekci 1% mutace za předpokladu 1% hraniční hodnoty a hraniční hodnoty Ct 38. Jestliže je Ct kontroly větší než 28,9 a došlo k detekci mutace, je zobrazena pozitivní mutace a tato značka/varování se nezobrazí, protože tento vzorek obsahuje jednoznačnou mutaci. Ale jestliže je Ct kontroly nad 28,9 a vzorek se zdá negativní pro mutaci, tato značka/varování se zobrazí, aby varovala, že mohlo dojít k nezachycení mutace s nízkou úrovní. Se zvyšováním Ct kontroly nad hodnotu 28,9 se snižuje senzitivita detekce mutace. 7.5.2.3. LIMITED Ct kontroly > 35. To znamená, že je k dispozici velmi málo amplifikovatelné DNA, takže je možné detekovat pouze mutace přítomné ve velkém procentu. U vzorků LIMITED, jestliže pozitivní mutace bude mít hodnotu Ct < 38, bude stále mutaci přiřazen platný stav a vzorek bude vyhodnocen. Přítomnost mutace s nízkou úrovní ve vzorku s negativním výsledkem a se značkou/varováním LIMITED nelze nebrat v úvahu. Strana 20 ze 38

7.5.2.4. EXO_FAIL Software kontroluje amplifikaci exogenní kontroly, aby bylo možné stanovit, zda může být přítomen inhibitor, což by mohlo vést k falešně negativním výsledkům. Uvažujeme takto: a. Reakce exogenní kontroly bude vyhodnocena pouze v mutačních reakčních jamkách a ne v jamce kontroly, s výjimkou sloupců se smíšeným standardem a NTC (viz bod 6) nebo v případě, kdy hodnota Ct kontroly < 30. b. Jestliže je výsledek pozitivní pro mutaci, ale test exogenní kontroly v mutačně pozitivní jamce nebyl úspěšný, značka/varování EXO_FAIL se nezobrazí, protože by zde mohlo docházet ke kompetitivní inhibici z reakce FAM. Stav mutace je platný. c. Jestliže je pozitivní výsledek pro mutaci u vzorku v jedné mutační jamce a neúspěšný test exogenní kontroly v jiné mutační jamce u stejného vzorku, mutace v první jamce bude vyhodnocena a výsledek je platný. Značka/varování EXO_FAIL ale bude zobrazena. To znamená, že je problém v jamce, kde došlo k neúspěšnému testu exogenní kontroly a v této jamce mohlo dojít k nezachycení mutace. Je možné, že daná mutace je spíše vyvolána zkříženou reakcí mezi testy, než skutečnou mutací, kterou se nepodařilo zachytit. Stav mutace v testu, který byl pozitivní pro mutaci, zůstává v platnosti, protože je jasně přítomná mutace a klinické rozhodnutí zůstává stejné bez ohledu na to, která mutace je přítomná. d. Jestliže je vzorek klasifikován jako negativní pro mutaci, ale reakce exogenní kontroly nebyla úspěšná v žádném testu na přítomnost mutace, zobrazí se značka/varování EXO_FAIL a stav bude neplatný. Je možné, že došlo k nezachycení mutace. e. Jestliže je Ct testu exogenní kontroly < 30 v jakékoli z 8 jamek, zobrazí se značka/varování EXO_FAIL a stav bude neplatný. Je možné, že v tomto testu došlo ke kontaminaci produktem PCR. f. Je možné zkontrolovat soubor běhu testu pro přístroj LightCycler 480 a zjistit možnou příčinu neúspěchu testu exogenní kontroly. Jestliže došlo k neúspěšným reakcím všech exogenních kontrol ve sloupci, je možné, že je přítomen inhibitor. Jestliže k tomu došlo jen v jedné jamce, může jít o problém s nastavením destičky. 7.5.2.5. FAIL Značka/varování FAIL se zobrazí, když software nedokáže určit, zda je amplifikační křivka pozitivní nebo negativní; např. tehdy, když je tvar křivky abnormální. Strana 21 ze 38

7.5.3. Software LightCycler Adapt kontroluje, zda název vzorku ve sloupci je identický, aby bylo možné zajistit, že hodnoty Ct mutace a kontrolního testu použité k výpočtu hodnot Ct pocházejí ze stejného vzorku. Názvy vzorků pocházejí z editoru vzorků přístroje LightCycler 480 v souboru běhu testu. Jestliže ve sloupci nedojde ke shodě, software vloží do sloupce s názvy vzorků v tabulce s výsledky vzorků hodnotu SAMPLE MISMATCH. V uspořádání destiček software vloží název vzorku a poté následuje hodnota (MISMATCH). Jestliže došlo k překlepu, název je možné opravit v souboru běhu testu přístroje LightCycler 480 a data lze znovu analyzovat v softwaru LightCycler Adapt. Nastavení ABI7500 Pro každý vzorek DNA je třeba provést kontrolní test a test na přítomnost mutace ve stejném běhu PCR reakce, aby byly vyloučeny rozdíly jednotlivých provedení testu. 1. Při pokojové teplotě rozmrazte reakční směsi a smíšený standard ze soupravy K-RAS. Promíchejte každý roztok otočením každé zkumavky 10krát ihned po rozmražení, aby nedošlo k místním rozdílům v koncentraci solí. Připravte si dostatečné množství směsí pro vzorky DNA, smíšený standard a kontroly bez vzorku, plus navíc 2 reakce na každou sestavu jako rezervu, jak je uvedeno v tabulce 11. Tabulka 11: Množství základní směsi soupravy K-RAS Analýza Kontrolní analýza Analýzy mutace Reakční směs (µl)x1 Základní směsi Reakční směs (µl) Taq (µl)x1 na destičce (x14) Taq (µl) na destičce (x14) 19,8 0,2 277,2 2,8 19,8 0,2 277,2 2,8 2. NEPROMÍCHÁVEJTE Taq nebo jakékoliv reakční směsi obsahující Taq, může to způsobit inaktivaci enzymů. 3. Před použitím ponechte Taq temperovat při pokojové teplotě. Ampulku Taq krátce odstřeďujte, aby se veškerá Taq shromáždila na dně ampulky. Pak pipetujte umístěním špičky pipety těsně pod hladinu Taq, aby nedošlo k pokrytí vnější strany špičky pipety nadměrným množstvím Taq. 4. Opakovaným nasátím pipetou opatrně smíchejte základní směsi. 5. Okamžitě přidejte 20 µl základní směsi do každé z reakčních jamek. Strana 22 ze 38

6. Okamžitě přidejte 5 µl testovaného vzorku, smíšeného standardu nebo vody (pro kontroly bez vzorku) do reakčních jamek. Každý vzorek DNA musí být testován pomocí obou analýz - kontrolní i mutační. Uspořádání destičky je v tabulce 12. Tabulka 12: Uspořádání destičky soupravy K-RAS pro ABI7500 Uspořádání s 96 jamkami Analýza 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Kontrola B 12ALA C 12ASP D 12ARG E 12CYS F 12SER G 12VAL H 13ASP Smíšený standard Smíšený standard Smíšený standard Smíšený standard Smíšený standard Smíšený standard Smíšený standard Smíšený standard Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) Kontrola bez vzorku Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 Vzorek 7 Vzorek 8 Vzorek 9 Vzorek 10 (NTC) 7. Uzavřenou PCR destičku krátce odstřeďujte, aby se činidla usadila na dno jamek. 8. Okamžitě vložte destičku do přístroje ABI7500. Nastavení přístroje ABI7500 1. Na ploše pracovní stanice připojené k přístroji zvolte ikonu softwaru systému 7500. V softwaru 7500 Sequence Detection, verze 1.4 otevřete v nabídce nový soubor běhu testu. 2. V Assay zvolte Standard Curve (Absolute Quantification). V Run Mode zvolte Standard 7500. 3. Pomocí tlačítka Next se přesuňte do okna nastavení detektoru. K seznamu detektorů přidejte detektory FAM a JOE, jako zhášecí přísady zvolte none. Jestliže tyto detektory ještě nejsou definovány, zvolte tlačítko New Detectors a u detektorů FAM a JOE nastavte zhášecí přísady na none. 4. Nastavte Passive Reference na None a zvolte tlačítko Next. 5. Zvolte celou destičku a zaškrtněte políčka detektorů FAM a JOE, aby tak byly monitorovány obě barviva ve všech jamkách. Zvolte tlačítko Finish. 6. Na záložce Instrument nastavte cyklování podle tabulky 13. Strana 23 ze 38

Tabulka 13: Parametry cyklů ABI7500 Teplota Čas Cykly Sběr dat Fáze 1 95 o C 4 min 1 Fáze 2 95 o C 30 sek 60 o C 1 min 40 FAM, JOE 7. Zvolte tlačítko Start, kterým uložíte test a spustíte cyklus. Analýza vzorku v přístroji ABI7500 1. Zajistěte, aby na zobrazovacím panelu jamek byla nastavena pasivní reference na žádná. 2. Zkontrolujte, zda každá jamka dává signál JOE při testu exogenní kontroly. a. Pokud test exogenní kontroly dává pozitivní výsledek, pokračujte v testování. b. Pokud test exogenní kontroly selhal, avšak reakce FAM silně amplifikovala, pokračujte v analýze, neboť reakce FAM kompetitivně potlačila reakci exogenní kontroly. c. Pokud obě reakce (FAM i kontrolní reakce) selhaly, údaje se musí vyřadit, neboť mohou být v reakci přítomny inhibitory. Tyto inhibitory mohou vést k falešně negativním výsledkům. 3. Na záložce Amplification Plot vyberte všechny používané jamky a z rozbalovací nabídky detektoru vyberte FAM dye (barvivo FAM). Použijte automatické nastavení základní úrovně a manuální Ct a pak pomocí logaritmické stupnice pro osu Y ručně nastavte práh uprostřed exponenciální fáze, jak je popsáno v uživatelské příručce k přístroji ABI7500. 4. Vyhodnoťte naměřené údaje a vypočítejte hodnotu Ct takto: [Ct analýzy vzorku s mutací] [Ct analýzy kontroly] = Ct Pro zjednodušení rozboru lze data exportovat do aplikace Microsoft Excel. Interpretace dat ABI7500 1. Hodnoty Ct u kontroly: 1.1. Hodnota Ct u kontroly musí být 24, aby nedošlo k inhibici reakce z důvodu vysokého vstupního množství DNA v testu. 1.2. Hodnota Ct u kontroly < 29: Souprava K-RAS je v těchto vzorcích schopná detekovat mutace s citlivostí záchytu 1 %. 1.3. Ve vzorcích s hodnotou Ct u kontroly 29: Souprava nebude detekovat s citlivostí záchytu 1 % mutací, bude však stále schopná detekovat vyšší procento mutací. Strana 24 ze 38

1.4. Hodnota Ct u kontroly 35: Ve vzorku je přítomno jen málo amplifikovatelné DNA a mutace jsou detekovatelné pouze tehdy, pokud je většina z DNA molekul mutovaná. 1.5. Hodnota Ct u kontroly 38: množství DNA je limitující a data se nesmí použít. 2. Hodnoty Ct smíšeného standardu 2.1. Hodnoty Ct smíšeného standardu je uvedena v tabulce 14, může se však objevit odchylka ±2 v důsledku rozdílného nastavení prahu na různých přístrojích. Tabulka 14: Hodnoty Ct smíšeného standardu a 1% hraniční hodnoty v přístroji ABI7500 Testy Ct smíšeného standardu Přijatelné rozmezí smíšeného standardu Strana 25 ze 38 Ct 1 % vzorku 12ALA -0,70-2,70 až 1,30 6,5 12ASP -1,04-3,04 až 0,96 8 12ARG -0,02-2,02 až 1,98 8 12CYS -0,98-2,98 až 1,02 7 12SER 0,02-1,98 až 2,02 9 12VAL -0,19-2,19 až 1,81 6,5 13ASP -1,12-3,12 až 0,88 9 3. Hodnoty Ct vzorku: 3.1. Pokud je hodnota Ct vzorku větší než hodnota pro 1 % (uvedená v tabulce 14), vzorek DNA je klasifikován jako negativní na přítomnost mutace K-RAS nebo pod limity detekce soupravy K-RAS. 3.2. Pokud je Ct vzorku menší než hodnota pro 1 %, vzorek DNA je klasifikován jako pozitivní pro mutaci K-RAS. 3.3. Ct pro vzorky mutace s hodnotou 38 nebo vyšší se vyhodnotí jako negativní nebo pod limity detekce soupravy. 10. Omezení testu Schopnost testu detekovat již 1 % mutaci na pozadí divokého typu genomické DNA je podmíněna hodnotou Ct testu kontroly < 29 v přístroji ABI7500 a < 28,9 v přístroji LightCycler 480. Testy nemohou detekovat 1 % mutací ve vzorcích, kde jsou hodnoty Ct kontroly vyšší. Sensitivita detekce mutace klesne, když se hodnota Ct kontroly zvýší nad tyto hodnoty. Hodnota Ct kontroly vzorku DNA je založena na stanovení koncentrace pomocí PCR. Hodnoty založené na odečtených hodnotách optické hustoty neodpovídají hodnotám Ct kontrolního testu ve vzorcích fragmentované DNA. Proto se v soupravě dodává navíc kontrolní reakční směs, která u vzorku umožní posouzení prahů cyklu Ct ještě před samotným zpracováním vzorku DNA v testu.

Pokud vzorek dává pozitivní výsledek tam, kde je Ct mutace 38, test se musí hodnotit jako negativní nebo pod limity detekce testu. Toto provádí automaticky software LightCycler Adapt. Mezi reakcemi detekce mutací může docházet k určité zkřížené reakci. Například, pokud je patrná vysoká úroveň mutace 12ALA, některé z jiných typů mutace mohou vykazovat také pozitivní výsledek. To je důsledkem jevu, kdy ARMS primery detekují jiné mutace v rámci několika bazí navzájem. Při použití syntetického kontrolního materiálu představuje zkřížená reakce definovatelný vzor v přístroji ABI7500, který dovoluje, aby z několika signálů byl určen skutečně pozitivní signál (viz tabulka 15). Tabulka 15: Vzor zkřížené reakce v přístroji ABI7500 (syntetický kontrolní materiál) Ano znamená skutečně pravý signál. Čísla udávají přibližný počet cyklů po tomto signálu, kde může být vidět signál zkřížené reakce. Více než 9 hodnot cyklů není uvedeno, protože tyto signály se již nacházejí v negativní zóně. Pozitivní vzorek 12ALA signál 12ASP signál 12ARG signál 12CYS signál 12SER signál 12VAL signál 13ASP signál 12ALA Ano 9-6 3 6-12ASP 9 Ano - - - - - 12ARG - - Ano - - - - 12CYS - 7 4 Ano - - - 12SER 9 6 9 - Ano - 8 12VAL 4 - - - - Ano - 13ASP - - - - - - Ano Poznámka: Charakteristika zkřížené reakce může být rozdílná u vzorků DNA, např. v parafinu zalitých vzorcích DNA. Souprava K-RAS je navržena k detekci jedné mutace ve vzorku DNA. Pokud druhý test detekce mutace dává pozitivní výsledek, jedná se patrně o zkříženou reakci. Vzácně však lze pozorovat i dvojité mutace. Pokud charakter výsledků testu neodpovídá vzoru zkřížené reakce, je třeba provést další testování. 11. Charakteristika vlastností testu Vlastnosti testu byly charakterizovány pro soupravu K-RAS použitou s přístrojem ABI7500 a s přístrojem LightCycler 480 (k získání hodnot Ct pomocí softwaru LightCycler Adapt). Na každém přístroji bylo provedeno velké množství testů. Výsledky tohoto testování jsou shrnuty níže. Ověření platnosti 1 % hranice: Přístroj LightCycler 480: Detekce 1 % mutace na pozadí vzorků DNA z buněčných linií negativních na přítomnost mutace K-RAS byla určena testováním tří různých koncentrací DNA z buněčných linií ke stanovení hodnoty hranice Ct pro každou mutační analýzu. Strana 26 ze 38