Kapilárn rní elektromigrační metody Zdeněk Glatz
Historický přehled 1880 - první elektroforetické separace Smirnow,Hardy 1897 - regulační frunkce Kohlrausch 1930 - volná elektroforéza Tiselius (1948 Nobelova cena) 1962 - izoelektrická fokusace Svensson (Rilbe) 1970 - SDS PAGE Laemmli 1975-2D-elektroforéza O Farrell 1976 - isotachoforéza Everaerts, Mikkers
Historický přehled CE 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten
1967 - Hjerten
Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen
Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers
Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs
1981 - Jorgenson Lukacsová
Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs 1984 Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe
Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs 1984 Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe 1985 Kapilární izoelektrická fokusace Hjerten
Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs 1984 Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe 1985 Kapilární izoelektrická fokusace Hjerten 1989 První komerční zařízení pro CZE Beckman
1989 - Beckman
Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs 1984 Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe 1985 Kapilární izoelektrická fokusace Hjerten 1989 První komerční zařízení pro CZE Beckmann 2003 - Projekt lidského genomu
2003 - Projekt lidského genomu
Proč CE?
Výhody CE Aplikační diverzita nabité i neutrální látky nízkomolekulární i vysokomolekulární látky chirální i achirální látky bakterie i viry
Výhody CE Aplikační diverzita Jednoduchá instrumentace
Aplikační diverzita Výhody CE Jednoduchá instrumentace CZE, MEKC, CIEF, CITP NACE, MEEKC, CGE, ChCE CEC
Aplikační diverzita Výhody CE Jednoduchá instrumentace Vysoké rozlišení a účinnost separací Malá spotřeba vzorku Rychlost analýzy Malá spotřeba chemikálií a malé množství odpadů
Koncentrační citlivost Nevýhody CE
Koncentrační citlivost Robustnost Nevýhody CE
Koncentrační citlivost Robustnost Nevýhody CE CE je komplementární k HPLC
CZE zdroje plynová chromatografie Křemenné kapiláry kapilární chromatografie Detekční systémy zónová elektroforéza Chemie pufrů
Aplikovatelnost CE Impurities 24% Small ions 11% Chiral 22% Assay 26% Identity 17% Altria KD and Kersey M, LG-CG Int., 8, April., 1995, 201-208
Teoretické aspekty CE
Mobilita - E F e F f + +
Elektrická síla F e F = E Q e E = intenzita elektrického pole [V/m] Q = náboj částice = z i e [] Frikční síla F f F = v f f v=rychlost částice f(frikční koeficient) = 6π.η.r
Ustálený stav E Q = v f v E Q = f v mobilita µ = [m E -2 V -1 s -1 ]
Iontová mobilita (limitní zředění, teplota 298 K) KATIONTY µ 0.10 9 ANIONTY µ 0.10 9 H 3 O + Li + Na + K + Tris + β alanin ethanolamin imidazol 362.5 40.1 51.9 76.2 29.5 36.7 44.3 52.0 OH - F - Cl - NO 3 - SO 4 - k.mléčná k.octová MES 205.5 57.4 79.1 74.1 82.9 36.5 42.4 28.0
Odhad iontové pohyblivosti - Joklova rovnice µ o = a z M r b a,b = empirické konstanty M r = relativní molekulová hmotnost
Vliv iontové síly - Onsagerova rovnice µ µ µ 9 = (. 023 zz + 313. 10 z ) o o c 1 + I I z = náboj iontu z c = náboj protiiontu
Vliv teploty µ T = µ [ 1+ 0.02 ( T T o)] To T o = standardní teplota T = pracovní teplota
Efektivní mobilita A 0, A 1, A 2,...A k µ 0, µ 1, µ 2,...µ k = = = = k i i i k i i i A A x c c 0 0 1 µ µ µ c A = celková analytická koncentrace látky A x i = molární zlomek iontu i
Závislost efektivní mobility na ph pro slabou monovalentní kyselinu pro slabou monovalentní zásadu [ + ] H [ + ] A H µ = µ A K HA + [ + ] H [ + ] BH H µ = µ B K BH +
Sekundární jevy při CE Jouleovo teplo Elektroosmóza Difuze
Jouleovo teplo P E i 2 i = = S S κ 2 P = výkon [W.m -3 ] S = průřez [m 2 ] κ = vodivost [Ω -1.m -1 ] i = elektrický proud [A]
Jouleovo teplo
Elektroosmotický tok
Elektroosmotický tok ξ πηµ = 4 eo ε ξ = potenciál Helmholtzovy dvojvrstvy η = viskozita ε = dielektrická konstanta µ eo = elektroosmotická mobilita v eo = ε 4πη E ξ
Původ elektroosmotického toku Anode EOF Cathode
Původ elektroosmotického toku
Elektroosmotický tok Laminární tok
Elektroosmotický tok v různých kapilárách
Difuze c = c 0 e ( x 2 σ 2 ) σ = 2Dt σ 2 = rozptyl D = difuzní koeficient
Mody kapilární elektroforézy
Módy CE
Kapilární zónová elektroforéza ve volné kapiláře
Výsledná mobilita částic při CZE
Metody ovlivňování EOF v CZE
Běžně používané elektrolyty Elektrolyt pka s Fosfát 2.12 pka1 7.21 pka2 12.32 pka3 Citrát 3.06 pka1 5.40 pka2 Acetát 4.75 MES 6.15 PIPES 6.80 ACES 6.90 MOPSO 6.90 MOPS 7.20 HEPES 7.55 TRIS 8.30 Borát 9.24 CHES 9.50 CAPS 10.40
Separace při nízkém ph Detector response + + + + + + Time
Separace při nízkém ph Separační podmínky : 30 C, dávkování 5 sec. při 0.5psi, +13kV, 25mM NaH 2 PO 4, upraven na ph 2.5 koncentrovanou H 3 PO 4, 200nm, 37cm x 75µm kapilára
Sodium phosphate ph 2.5, normalní kapilára +30kV Sodium phosphate ph 2.5, pokrytá kapilára +30kV
Separace anorganický anionů s přímou UV detekcí
Separace při vysokém ph 2 4 UV response 1 + 3-5 + Neutrals - 400 500 600 750 900 sec
Separace při vysokém ph Separace kyselých léčiv separovaných v 15mM boratu s UV detekcí při 200 nm
Změna EOF přídavkem kationtového detergentu
Separace anorganických aniontů
Separace anorganických aniontů 2.25 pyromellitic acid, 6.5 mm NaOH, 0.75 mm hexamethonium hydroxide, 1.6 mm triethanol- amine, ph 7Negative polarity 465 V/cm, 9 µa 56/64.5 cm id=50 µm inj: 200 mbars Temp=25 C Indirect Detection Sig: 350,60 nm Ref: 245,10 nm
Separace aniontů pomocí CZE
Borátová komplexace
CZE v nevodném prostředí µ eo = εξ wall / η Nejlepšé rozpouštědla mají vysoké hodnoy ε/η SOLVENT η ε ε/η UV Cut Off voda 0.89 80 89.9 191 NMF 1.65 182 110.3 ~ 260 DMF 0.80 36.7 45.9 ~ 260 DMSO 2.00 46.7 23.4 ~ 260 Acetonitril 0.34 37.5 110.3 195 Methanol 0.54 32.7 60.6 205 Ethanol 1.07 24.6 23.0 205
Selectivita - Solvatace -ph* - Rozpouštědla v různých poměrech Účinnost - nízký proud díky nízkým dielectrickým konstantám - Rychlé separace - >350,000 Vhodné pro soluty nerozpustné ve vodě (náhražka MEKC) CE-MS kompatibilní
A = Vodná CE B = Nevodná CE S.Hansen et al trends in analytical chem.,15, 175, 1996
1mM Acetate @ ph* 9.3 in 50/50 MeOH/MeCN UV@ 200nm Altria KD and Bryant SM, Chromatographia, 46 1997 122-130
Non aqueous CE of inorganic anions 10mM KH Phthalate, 1mM TMAH methanol:dmf 7:3 Indirect 254nm Cl content in Azelastine HCL 8.59% theory 8.47 CE Suzuki et al J.Chromatogr.A 829 (1998( 411-415
Princip MEKC Micela a střed rozpustná v obou b silně hydrofilní nerozpustná v micele c silně hydrofóbní nerozpustná ve vodné fázi
Micelární elektrokinetická chromatografie
Kapacitní faktor a rozlišní v MEKC + + α α = 1 mc 0 mc 0 2 2 1 2 s k t t 1 t t 1 1 k k 1 4 N R 0 r 0 r t t 1 1 t t k = α = selektivita
Separační okno v MEKC pro neutrální látky
Factory ovlivňující selektivitu Typ detergenu Různé čelní skupiny mají silný vliv (iontové interakce) Žlučové kyseliny Kationtové (otočení EOF) ph Ovlivňování ionizace Pufr Efekt aditiv je větší než u CZE Organické modifikátory Teplota Ovlivňuje chování micel 2ºC může značně ovlivnit separaci
Používané detergenty Typ Detergent CMC (mm) Agregační číslo aniontový SDS 8.2 62 kationtový CTAB DTAB 14 1.3 50 78 neiontový Oktylglukosid Dodecylmaltosid Triton X 100-0.16 0.24 - - 140 zwitterionty CHAPS CHAPSO 8 8 10 11 žlučové kyseliny cholová k. deoxycholová taurocholová 14 5 10-15 2-4 4-10 4
OH COONa Na cholát OH OH Zvyšuje rozpustnost solutů více než SDS K dispozici různé deriváty Možno použít spolu s methanolem, propan-2-olem 20-100mM koncentrace
Separace fenolů a alkoholů pomocí MEKC
Analysis of organic acids using low ph MECC, SDS concentration = 60mM Key to figure: AP = 4-Acetamido-phenol, NA = β-naphthoxyacetic acid (sodium salt), S = Saccharin (sodium salt hydrate), BA = Benzoic acid (sodium salt), B = Barbital (sodium salt), SA = Salicylic acid.
MEKC derivativátů anilínu (a) SDS nebo (b) sodium laurylsulfoacetate surfactanty. Buffer: 0.02-M borate phosphate buffer (ph 7.0). Detection wavelength: 240 nm. Applied voltage: 20 kv. 1, aniline; 2, o-aniline; 3, m-aniline; 4, p-aniline; 5, o-toluidine; 6, m-toluidine; 7, p-toluidine; 8, o-nitroaniline; 9, m-nitroaniline; 10, p-nitroaniline; 11, o-chloroaniline; 12, m-chloro aniline; 13, p-chloroaniline; 14, acridine orange-10-dodecylbromide.
Optimalizace SDS MEKC Starting conditions - 15mM borate with 50mM SDS Small k Large k INCREASE SDS DECREASE SDS Insufficient resolution? Insufficient resolution? Lower ph, Lower voltage, Ion-pair reagent Organic solvents, Temperature, Electrolyte Organic solvents, Temperature, Electrolyte Ion-pair reagent, Lower ph, Lower voltage ALTERNATIVES Cationic surfactants Bile salts MIxed micelles Low ph
Mikroemulsní elektrokinetická chromatografie
Valko 5 (7,1) 120 100 80 60 40 20 MEEKC retentce vs LogP logp vs migration time 5 4.5 4 3.5 4 5 6 7 8 9 Retention time Phenacetine Response 9.83 Butyrophenone Valerophenone Hexanophenone Heptanophenone Acetophenone Acetanilide 3 Propiophenone 2.5 logp 2 1.5 1 0.5 0 0 2 4 6 8 10 migration time Altria KD, J.Chromatogr.A 892 (2000) 171-186
Separace testovací směsi MEEKC Paracetamol Methyl paraben 4-hydroxyacetophenone Ethyl paraben Propyl paraben Naphthalene
Separace směsi vitaminů Vutamíny rozpustné ve vodě a tucích - nikotinamid - riboflavin - askorbová kyselina - thiamin - vitamin A - vitamin D
Chiralita chirální separace?
Thalidomid
Thalidomid
Chirální separace
Srovnání chirálních separací pomocí CZE a HPLC u hexabarbitalu CZE Rychlý vývoj metody Vysoké rozlišení Nízká cena reagencií Rychlost analýzy Analytické provedení HPLC Zdlouhavý vývoj metody Dlouhé doby analýzy Vysoká cena kolon Preparativní provedení
Cyklodextriny α CD - 6 glukosových zbytků β CD - 7 glukosových zbytků γ CD - 8 glukosových zbytků
Cyklodextriny Neaturalní α β γ Chemicky derivatispvané formy jako např. methyl, hydroxypropyl Nabité cyclodextriny, amino-, sulfo-, karboxy-
Sulfatovaný cyklodextrin
Cyklodextriny Aplikace : nabité CD neutrální enantiomery neutrální CD nabité enantiomery
Separace terbutaline s různými cyclodextriny
Crown ethery O O H O H N + H O O R Vhodné pro primarní aminy jako např. aminokyseliny O
Dextranové polymery
Vancomycin Použití v chiralních CE separacích Vysoká UV absorbance
Chiralní CZE při nízkém ph A d + A d + A d + A l + A d + A d + A l + A l + A l + A l + A d + A d + A l + A d + A l +
Triethanolamine-fosfát BGE (ph 2.5) s α-cyclodextrinem. Detekce při 200nm
Optimalizace chiralní separace při nízkém ph Chiral Separation? Increase or decrease CD Optimize conditions 15mM CD ph 2.5 No resolution? Try different CD No resolution? Try crown ether Primary amine? SDS MECC + CD or bile salt
Chirální CZE při vysokém ph A l - A l - A d - A d - A d - A d - A l - A d - A l - A l - A l - A d - EOF FLOW
Optimalizace chiralní separace při vysokém ph Chiral Separation? Increase or decrease CD Optimize conditions 15mM CD borax No resolution? Try different CD No resolution? Try oligosaccharide SDS MECC + CD or bile salt
MEKC pro chiralní separaci A l - - - - - - A - l - - - - - - A l - - - - - A d EOF A d - - - A d - A d - - - - - - A l -
Optimalizaci MEKC pro chiralní separaci Chiral Separation? Increase or decrease CD Optimize conditions 15mM CD, 50mM SDS, borax No resolution? Try different CD No resolution? Try bile salts Try mixed micelles
30 mm SDS, 100mM borate, 10mM HP-β-CD LOD of <0.06% (detection at 200nm) Noroski et al, J.Pharm.Biomed.Anal., 13, 1995, 45-52
Kapilární gelová elektroforéza
Polymerní matrice pro CGE
CGE fragmentů dsdna
CGE oligonukleotidů
Projekt lidského genomu sekvenace DNA
CGE bílkovin v přítomnosti SDS
Kapilární izoelektrická fokusace A + A + A A - A - A + A - A + A A - Low ph pi value High ph
Kapilární izoelektrická fokusace
CIEF EOF = 0 pokryté kapiláry Postup : 1. Vlastní fokusace - vzorek nanesen v celé kapiláře 2. Mobilizace - analyty musí projít detekční celou moblilizace elektroforetická hydrodynamická bez mobilizace EOF 0 nepokrytá kapilára, vzorek nanášen pouze v úzké zóně na začátku kapiláry
CIEF bílkovin pomocí tlakové mobilizace
Kalibrační křivka IEF
Kapilární izotachoforéza
ITP nukleotidů
Kapilární elektrochromatografie
Srovnání toku u LC a CEC LC CEC
CEC separace neutrálních látek
Instrumentace CE
Výrobci Agilent and Beckman 1 500 000 Kč
Beckman MDQ
Agilent HPCE 3D
Bioanalyser Agilent 2100
Schéma zařízení pro CZE
Napájecí zdroj stabilizovaný ± 30 kv 300 µa konstantní napětí nebo proud obojí polarita ochrana obsluhy
Kapilára křemenná - 25-100 µm i.d - 350 µm o.d. délka až 100 cm délka polyimidové vnější pokrytí
Kapilára Id efektivní délka L celková délka Is short end injection Detector position l d L l s
Délka kapiláry
Modifikace kapiláry kovalentní Si - O - Si - R ph 4-7 Si -C-R ph 2-10 adsorbované dynamické celulosa, PEG, PVA, PEI detergenty hydrofilní polymery kvarterní aminy extrémy ph vysoká I
Dávkování
Hydrodynamické
Elektrokinetické
Elektromigrační disperze
Analýza kationů nepřímou detekcí
Detekce
Spektrofotometrická detekce
DAD detekční systém
Lineární detekční rozsah
Zvýšení citlivosti detekce
Zvýšení citlivosti detekce Agilent Flow cell
Rozlišení zón
Multireflekční cela
Fluorescenční detekce
Nepřímá detekce FS 1. Empty capillary 2. Filled capillary FS 0 0 FS 3. Separation 0
Nepřímá detekce
Separace anorganických aniontů
Separace organických aniontů Indirect UV detection at 254nm 0 mins 5 mins 27cm x 75micron, 3.0 sec injection, 0.5mM TTAB/5.0mM phthalate/50mm MES ph5.2, 30C, -3kV
CZE-MS
Schéma CZE-ESI-MS
CZE-ESI-MS analýza peptidů
Zvýšení citlivosti detekce
Efekt složení vzorku na separaci
Stacking
Transient ITP
Transient ITP
Transient ITP
Zakoncentrování pomocí IEF
Speciální aplikace
Multiplex CE instrument
1997 µce
Příprava mikrochipů UV Light Mask PDMS PDMS Photoresist Channel Silicon Mold wafer
Požívané materiály Sklo První použitý materiál Dobře známé vlastnosti Složitá konstrukce Polymery levnější Méněkřehké Více možností chemismu Nepříliš dobře charakterizované
Klasická CZE Absorbance (mau) Absorbance (mau) 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0-0.5-1.0 35 30 25 20 15 10 5 A 2 4 6 8 10 12 B Cr Cr Cn Cn EDTA UA Time (min) UA 0 0 5 10 15 20 25 Time (min)?
Microchip CZE 1.2 uric acid 1.0 Current (na) 0.8 0.6 0.4 0.2 unknown 0.0 0 10 20 30 40 50 Time (s)
Bioanalyser Agilent 2100
LIF - imunostanovení
LIF - imunostanovení
Využití CE pro analýzu biologicky aktivních látek v léčivých rostlinách a tělních tekutinách Hořčiny zeměžluč, hořec MEKC Glatz, Z. et al. J.Liquid Chromatogr. Rel. Technol., 2000, 23, 1831. Lignany schizandra činská CEC,MEKC Kvasničková, L. et al. J. Chromatogr. A, 2001, 916, s. 265. Štěrbová, H. et al. Electrophoresis, 2002, 23, 253. Flavonoidy artyčok MEKC Ševčíková, P. et al. Electrophoresis, 2002, 23, 249.
Využití CE v klinické diagnostice Thiokyanát sliny, moč CZE Glatz, Z. et al. J. Chromatogr. A, 2001, 916, s. 273. Cystein moč MEKC Ševčíková, P. et al. J. Sep. Sci., 2003, 26, s. 734. Homocystein plasma MEKC Ševčíková, P. et al. J. Chromatogr. A, 2003, 990, s. 197. GSH erythrocyty MEKC Mašlaňová H., et. al. J. Chromatogr. A, 2000, 990, s. 197.
Využití CE pro separaci microcystinů CEC separace extraktu sinic Zeisbergerová, M. et al. J. Chromatogr. B 2006, 841, 140.
Využití CE pro separaci bakterií Dávkovaná kultura 700 mau 800 600 DAD1 A, Sig=214,10 Ref=off (BACTERIA\05XII004.D) CZE separace bakterie Lactobacillus acidophilus SEMIPREPARACE 500 400 300 200 Separovaná frakce 100 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min Šnajdrová, L. et al. Chemické Listy, 2002, 96, 6s. 432.
Využití CE při studiu enzymů
Studium enzymových reakcí pomocí CE Pre-capillary On-capillary
Výhody CE Kapilára jako reakční prostor
Studium enzymových reakcí pomocí CE Pre-capillary provedení : - kapilára je používána pouze pro separaci a detekci - nutná manipulace mezi enzymovou reakcí a separací
Kinetické stanovení glutathion S-transferasa Šišková, Z. et al. J. Sep. Sci., 2005, 28, 1357.
End point stanovení cytochrom P450 2C9 Konečný, J. et al. Electrophoresis, 2007. 28, 1229.
Studium enzymových reakcí pomocí CE On-capillary provedení : - kapilára je navíc využita i jako reakční prostředí - stanovení je automatizováno dávkování, smísení, inkubace, separace, detekce CE
Elektroforeticky zprostředkovaná mikroanalýza Electrophoretically Mediated MicroAnalysis EMMA J. Bao, F.E. Regnier, J. Chromatogr. 608, 217 (1992). rozdílná elektroforetická mobilita enzymu a jeho substrátu(ů) pro vyvolání reakce přímo v kapiláře
EMMA - kontinuální mód A Substrate filled capillary Detection window + - + E P -
EMMA zonální mód B Detection window + - + S E P -
EMMA zonální mód Výhody : Menší spotřeba vzorků enzym, substráty, inhibitory Vyhodnocování
EMMA vyhodnocení Glu-6P + NAD + Kontinuální mód G6PDH 6P-Glu + NADH Zonální mód B.J. Harmon et al.,j. Chromatogr. A 726, 193 (1996). E.S.Kwak et al., Anal. Chim. Acta 397, 183 (1999).
EMMA využití Enzymové systémy Aktivita enzymů Koncentrace substrátů a inhibitorů Michaelisovy a inhibiční konstanty Neenzymové systémy GSH, HCys, Cys, DTT Ca(II) Gentamycin a kanamycin Kreatin Cr(VI) a Co(II) S. NOVÁKOVÁ, S. VAN DYCK, A. VAN SCHEPDAEL, J. HOOGMARTENS & Z. GLATZ* REVIEW: Electrophoretically Mediated Microanalysis J. Chromatogr. A 1032, 173 (2004). S. VAN DYCK, E. KAALE, S. NOVÁKOVÁ, Z. GLATZ, A. VAN SCHEPDAEL* & J. HOOGMARTENS REVIEW: Advances in Capillary Electrophoretically Mediated Microanalysis. Electrophoresis 24, 3868 (2003).
Studium enzymů pomocí CE? (pre-capillary versus on-capillary)
Rhodanasa (EC 2.8.1.1) CN - + S 2 O 3 2- SCN - + SO 3 2- Homo sapiens Detoxikace kyanidu - otravy - cigaretový kouř - glykosinoláty Brassicacceae Acidithiobacillus ferrooxidans Biohydrometalurgie Životní prostředí
rhodanasa pre-capillary stanovení aktivity Volba separačních podmínek, CN - + S 2 O 3 2- SCN - + SO 3 2-100 mm β-alanin - HCl, ph 3.5 nízký EOF CN - = HCN
rhodanasa pre-capillary stanovení aktivity Stanovení aktivity 45 40 ma U PEAK AREA 35 30 25 20 S 2 O 3 2-15 200 150 100 50 0 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 TIME [min] 15 min 12 min 9 min 6 min 3 min 0 min SCN - 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 min
rhodanasa pre-capillary stanovení aktivity Charakterizace enzymu z A.ferrooxidans EFFECT OF ph ON RHODANESE REACTION EFFECT OF TEMPERATURE ON RHODANESE REACTION 100 A - MES BUFFER B - HEPES BUFFER C - TRIS BUFFER D - BORATE BUFFER C 100 80 80 RELATIVE ACTIVITY [%] 60 40 B D REL.ACTIVITY [%] 60 40 A 20 20 0 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5 ph 0 0 10 20 30 40 50 60 TEMPERATURE [ o C] Stanovení pi 6.5 (chromatofokusace) Stanocení MW 22 000 (gelová permeační chromatografie) Bouchal, P. et al. Folia Microbiol, 2001, 46, 385.
rhodanasa EMMA stanovení kinet. parametrů Volba separačních parametrů Separace anorganických aniontů (S 2 O 3 2-, SCN - ) probíhá nejlépe při nízkém ph základního elektrolytu eliminace EOF ph optimum rhodanasy: 8.5 Kombinace metody EMMA s "partial filling technique"
rhodanasa EMMA stanovení kinet. parametrů Dávkovací a separační parametry Parametr Základní elektrolyt 100 mm β-alanin HCl (ph 3.5) Přesnost migračních časů (n=10) Přesnost ploch píků (n=10) Hodnota 0,23 % Dávkování 3,88 % 1. 25 mm HEPES pufr (ph 8.5) : 50 mbar/4s 2. Rhodanasa ve 25 mm HEPES pufru (ph 8.5) : 50 mbar/4s 3. Substráty ve 25 mm HEPES pufru (ph 8.5) : 50 mbar/4s 4. 25 mm HEPES pufr (ph 8.5) : 50 mbar/4s - 25 mm HEPES (ph 8,5) Substráty v 25 mm HEPES (ph 8,5) Rhodanasa v 25 mm 25 mm HEPES HEPES (ph 8,5) (ph 8,5) + nástř Separační napětí Detekce
rhodanasa EMMA stanovení kinet. parametrů Stanovení Michaelisových konstant Km
rhodanasa EMMA stanovení kinet. parametrů Stanovení Michaelisových konstant Km 0,012 0,8 1/ plocha píku (mau*s) 0,01 0,008 0,006 0,004 0,002 0-1 -0,75-0,5-0,25-0,002 0 0,25 0,5 0,75 1 1,25-0,004-0,006 1/ [Na 2 S 2 O 3 ] (l/mmol) úsek na ose x 1/K M (CN - ) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 1/K M (S 2 O 3 2- ) y = 0,5839x + 0,0768 0,1 0-0,6-0,4-0,2-0,1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2-0,2 1 mm KCN 2 mm KCN 5 mm KCN 10 mm KCN 1/ [KCN] (l/mmol) K M (CN - ) = 7.60 mm K M (S 2 O 3 2- ) = 13.02 mm S 2 O 3 2- E SCN - E S 2 O 3 2- SO 3 2- ES CN -
Sulfotransferasa (EC 2.8.2.1) cytosolická - biotransformace/detoxikace xenobiotik (II fáze) membránově vázaná - sulfatace glykoproteinů
Vytisková, S. et al. J. Chromatogr. A, 2004, 1032, 319. sulfotransferasa EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Reakce O O S O O - O P O - O CH 2 O N N NH 2 N N + OH SULT1A1 HO O - P O O CH 2 O N N NH 2 N N + 274 nm O - O S O O HO P O - O O OH NO 2 HO O P - O O OH NO 2 PAPS 4-Nitrophenol PAP 4-Nitrophenyl sulfate Velmi nestabilní 80 % (20 % PAP) ~1 mg 100 Velmi silný inhibitor reakce K I = 0.4 µm
sulfotransferasa EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Krok 1. Dávkování PAPS Zóna Tlak p i (psi) Čas (s) Napětí (kv) PAPS 0.5 5 / 2. Předseparace od PAPS / / 60 15 3. Dávkování S 4. Dávkování E Dávkování a inkubace 4-NP 0.3 5 / SULT1A1 0.3 5 / 5. Smísen sení a enzymová reakce / / 60 5 6. Inkubace / / 120 0 7. Separace / / 300 10 - PAPS P + nástřik detekce
sulfotransferasa EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Stanovení Michaelisovy konstanty pro 4-nitrofenol 2.5 µm pnp 1.5 µm pnp 1 µm pnp 0.5 µm pnp 0.3 µm pnp 0.2 µm pnp 0.1 µm pnp K M = 0.8 µm