Kapilárn. rní elektromigrační metody. Zdeněk Glatz

Podobné dokumenty
APLIKOVANÉ ELEKTROMIGRAČNÍ METODY

Katedra analytické chemie PřF UP Olomouc

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY

PREKONCENTRAČNÍ TECHNIKY V KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZE

Identifikace a stanovení chininu v toniku pomocí CE-MS

Stanovení paracetamolu, kofeinu a propyfenazonu v tabletách Valetol

Hewlett-Packard - David N. Heiger High Performance Capillary Electrophoresis,1992, Publication Number E

Stanovení organofosforových pesticidů ve vodě a půdě micelární elektrokinetickou chromatografií

Analýza aniontových tenzidů v čisticích prostředcích kapilární elektroforézou

Elektromigrační metody

Vizualizace DNA ETHIDIUM BROMID. fluorescenční barva interkalační činidlo. do gelu do pufru barvení po elfu SYBR GREEN

Stanovení biochemicky významných flavinů pomocí kapilární elektroforézy s fluorescenční detekcí

Obr. 1. Stuktura glukózy, fruktózy a sacharózy.

Chirální separace v CE

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

Chromatofokusace. separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení. není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost

Stanovení cholesterolu ve vaječném žloutku a mléce kapilární elektroforézou

laktoferin BSA α S2 -CN α S1 -CN Popis: BSA bovinní sérový albumin, CN kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin

4. Elektromigrační separační metody

Afinitní kapilární elektroforéza

Aplikace elektromigračních technik

Látky obsahují aminoskupinu

Elektromigrační metody

Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ / /0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR

IONOSEP v analýze vody. Využití analyzátorů IONOSEP pro analýzu vod. Doc. Ing. František KVASNIČKA, CSc.

Přístupy k analýze opticky aktivních látek metodou HPLC

Aplikace elektromigračních technik Laboratorní úlohy

Analytické nástroje pro analýzu iontů v prostředí. Analytical tools for environmental metal ions determination

KAPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA

THE USING OF CARRIER AMPHOLYTE-FREE ISOELECTRIC FOCUSING (CAF-IEF) FOR ANALYSIS OF STRESS PROTEINS

Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra analytické chemie

KAPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA: SIMULACE A EXPERIMENT

Elektromigrační metody

Klinická a farmaceutická analýza. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

2. Stanovení 5-hydroxymethylfurfuralu v medu pomocí kapilární elektroforézy

1/10/2014. Kapilární elektroforéza s hmotnostní detekcí. Historie

STUDIUM ENZYMOVÝCH REAKCÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZOU V ON-LINE USPOŘÁDÁNÍ

IMUNOANALÝZA elektroforetické separační metody. 3. ročník Klinická biologie a chemie

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE

Aplikační rozsah chromatografie

Univerzita Karlova v Praze

Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ / /0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR

Ionexová chromatografie

Jiří Pazourek MODERNÍ ELEKTROFORETICKÉ ANALYTICKÉ METODY. (přednášky pro magisterské studium) Skripta : Elektroforetické analytické metody 2.6.

Průtokové metody (Kontinuální měření v proudu kapaliny)

Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů


Separační metody v analytické chemii. Plynová chromatografie (GC) - princip

Metody separace. přírodních látek

Stanovení kreatininu v mase pomocí kapilární izotachoforézy

Chromatografie polymerů III.: IC+LC CC+LC LC. FFF-Field flow fractionation (Frakcionace tokem v silovém poli)

Obr. 1. Struktura glukosaminu.

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE DIPLOMOVÁ PRÁCE

PEPTIDY A BÍLKOVINY. Kapalinová chromatografie peptidů a bílkovin

Mobilní fáze. HPLC mobilní fáze 1

Elektroforéza - II (v klasickém provedení) Příprava předmětu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Trendy v moderní HPLC

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ. Katedra analytické chemie

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Separační metody používané v proteomice

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

kapalinové chromatografie selhalo na problému stanovení silně polárních látek pomocí HPLC, coţ 6-sulfatoxymelatonin beze sporu je.

Separace chirálních látek. Zuzana Bosáková

Gelová permeační chromatografie

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

3 Acidobazické reakce

3 Acidobazické reakce

Stručný úvod ke cvičnému programu purifikace proteinů:

Separační metody Historie: Rozvoj separačních metod od minulého století Postavení separačních metod v rámci analytické chemie Význam chromatografie a

STANOVENÍ MYORELAXANCIÍ ROKURONIA,

Luminiscenční analýza Použití luminiscenční spektroskopie v analytické chemii

HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE


[ ] d[ Y] rychlost REAKČNÍ KINETIKA X Y

PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE (GC)

Izolace nukleových kyselin

UNIVERZITA PARDUBICE FAKULTA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Aneta Kyralová

Zajištění správnosti výsledků analýzy kotininu a kreatininu

Stanovení kyseliny pantotenové v lupíncích Corn flakes pomocí kapilární izotachoforézy

Sekunda (2 hodiny týdně) Chemické látky a jejich vlastnosti Směsi a jejich dělení Voda, vzduch

VÝUKOVÝ MODUL MEMBRÁNOVÝCH PROCESŮ TÉMATA PŘEDNÁŠEK

NÁPLŇOVÉ KOLONY PRO GC

ZÁKLADNÍ CHEMICKÉ POJMY A ZÁKONY

TYPY KOLON A STACIONÁRNÍCH FÁZÍ V PLYNOVÉ CHROMATOGRAFII

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..

Stanovení kyseliny mravenčí a citronové v kávě pomocí kapilární izotachoforézy

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Petr Kozlík Katedra analytické chemie

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti CHROMATOGRAFIE

Roztoky - elektrolyty

ŘEŠENÍ. PÍSEMNÁ ČÁST PŘIJÍMACÍ ZKOUŠKY Z CHEMIE Bakalářský studijní obor Bioorganická chemie a chemická biologie 2016

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Farmaceutická fakulta v Hradci Králové

První testový úkol aminokyseliny a jejich vlastnosti

12. Elektrochemie základní pojmy

IZOTACHOFORÉZA. Teoretická část

PÍSEMNÁ ČÁST PŘIJÍMACÍ ZKOUŠKY Z CHEMIE Bakalářský studijní obor Bioorganická chemie a chemická biologie 2016

Transkript:

Kapilárn rní elektromigrační metody Zdeněk Glatz

Historický přehled 1880 - první elektroforetické separace Smirnow,Hardy 1897 - regulační frunkce Kohlrausch 1930 - volná elektroforéza Tiselius (1948 Nobelova cena) 1962 - izoelektrická fokusace Svensson (Rilbe) 1970 - SDS PAGE Laemmli 1975-2D-elektroforéza O Farrell 1976 - isotachoforéza Everaerts, Mikkers

Historický přehled CE 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten

1967 - Hjerten

Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen

Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers

Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs

1981 - Jorgenson Lukacsová

Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs 1984 Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe

Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs 1984 Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe 1985 Kapilární izoelektrická fokusace Hjerten

Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs 1984 Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe 1985 Kapilární izoelektrická fokusace Hjerten 1989 První komerční zařízení pro CZE Beckman

1989 - Beckman

Historický přehled 1967 Kapilární elektroforéza v rotující kapiláře Hjerten 1974 Kapilární elektroforéza ve 200 µm skleněné kapiláře Virtanen 1979 Kapilární elektroforéza ve 200 µm teflonové kapiláře Mikkers 1981 Kapilární elektroforéza ve 75 µm křemenné kapiláře Jorgenson, Lukacs 1984 Micelární elektrokinetická chromatografie Terabe 1985 Kapilární izoelektrická fokusace Hjerten 1989 První komerční zařízení pro CZE Beckmann 2003 - Projekt lidského genomu

2003 - Projekt lidského genomu

Proč CE?

Výhody CE Aplikační diverzita nabité i neutrální látky nízkomolekulární i vysokomolekulární látky chirální i achirální látky bakterie i viry

Výhody CE Aplikační diverzita Jednoduchá instrumentace

Aplikační diverzita Výhody CE Jednoduchá instrumentace CZE, MEKC, CIEF, CITP NACE, MEEKC, CGE, ChCE CEC

Aplikační diverzita Výhody CE Jednoduchá instrumentace Vysoké rozlišení a účinnost separací Malá spotřeba vzorku Rychlost analýzy Malá spotřeba chemikálií a malé množství odpadů

Koncentrační citlivost Nevýhody CE

Koncentrační citlivost Robustnost Nevýhody CE

Koncentrační citlivost Robustnost Nevýhody CE CE je komplementární k HPLC

CZE zdroje plynová chromatografie Křemenné kapiláry kapilární chromatografie Detekční systémy zónová elektroforéza Chemie pufrů

Aplikovatelnost CE Impurities 24% Small ions 11% Chiral 22% Assay 26% Identity 17% Altria KD and Kersey M, LG-CG Int., 8, April., 1995, 201-208

Teoretické aspekty CE

Mobilita - E F e F f + +

Elektrická síla F e F = E Q e E = intenzita elektrického pole [V/m] Q = náboj částice = z i e [] Frikční síla F f F = v f f v=rychlost částice f(frikční koeficient) = 6π.η.r

Ustálený stav E Q = v f v E Q = f v mobilita µ = [m E -2 V -1 s -1 ]

Iontová mobilita (limitní zředění, teplota 298 K) KATIONTY µ 0.10 9 ANIONTY µ 0.10 9 H 3 O + Li + Na + K + Tris + β alanin ethanolamin imidazol 362.5 40.1 51.9 76.2 29.5 36.7 44.3 52.0 OH - F - Cl - NO 3 - SO 4 - k.mléčná k.octová MES 205.5 57.4 79.1 74.1 82.9 36.5 42.4 28.0

Odhad iontové pohyblivosti - Joklova rovnice µ o = a z M r b a,b = empirické konstanty M r = relativní molekulová hmotnost

Vliv iontové síly - Onsagerova rovnice µ µ µ 9 = (. 023 zz + 313. 10 z ) o o c 1 + I I z = náboj iontu z c = náboj protiiontu

Vliv teploty µ T = µ [ 1+ 0.02 ( T T o)] To T o = standardní teplota T = pracovní teplota

Efektivní mobilita A 0, A 1, A 2,...A k µ 0, µ 1, µ 2,...µ k = = = = k i i i k i i i A A x c c 0 0 1 µ µ µ c A = celková analytická koncentrace látky A x i = molární zlomek iontu i

Závislost efektivní mobility na ph pro slabou monovalentní kyselinu pro slabou monovalentní zásadu [ + ] H [ + ] A H µ = µ A K HA + [ + ] H [ + ] BH H µ = µ B K BH +

Sekundární jevy při CE Jouleovo teplo Elektroosmóza Difuze

Jouleovo teplo P E i 2 i = = S S κ 2 P = výkon [W.m -3 ] S = průřez [m 2 ] κ = vodivost [Ω -1.m -1 ] i = elektrický proud [A]

Jouleovo teplo

Elektroosmotický tok

Elektroosmotický tok ξ πηµ = 4 eo ε ξ = potenciál Helmholtzovy dvojvrstvy η = viskozita ε = dielektrická konstanta µ eo = elektroosmotická mobilita v eo = ε 4πη E ξ

Původ elektroosmotického toku Anode EOF Cathode

Původ elektroosmotického toku

Elektroosmotický tok Laminární tok

Elektroosmotický tok v různých kapilárách

Difuze c = c 0 e ( x 2 σ 2 ) σ = 2Dt σ 2 = rozptyl D = difuzní koeficient

Mody kapilární elektroforézy

Módy CE

Kapilární zónová elektroforéza ve volné kapiláře

Výsledná mobilita částic při CZE

Metody ovlivňování EOF v CZE

Běžně používané elektrolyty Elektrolyt pka s Fosfát 2.12 pka1 7.21 pka2 12.32 pka3 Citrát 3.06 pka1 5.40 pka2 Acetát 4.75 MES 6.15 PIPES 6.80 ACES 6.90 MOPSO 6.90 MOPS 7.20 HEPES 7.55 TRIS 8.30 Borát 9.24 CHES 9.50 CAPS 10.40

Separace při nízkém ph Detector response + + + + + + Time

Separace při nízkém ph Separační podmínky : 30 C, dávkování 5 sec. při 0.5psi, +13kV, 25mM NaH 2 PO 4, upraven na ph 2.5 koncentrovanou H 3 PO 4, 200nm, 37cm x 75µm kapilára

Sodium phosphate ph 2.5, normalní kapilára +30kV Sodium phosphate ph 2.5, pokrytá kapilára +30kV

Separace anorganický anionů s přímou UV detekcí

Separace při vysokém ph 2 4 UV response 1 + 3-5 + Neutrals - 400 500 600 750 900 sec

Separace při vysokém ph Separace kyselých léčiv separovaných v 15mM boratu s UV detekcí při 200 nm

Změna EOF přídavkem kationtového detergentu

Separace anorganických aniontů

Separace anorganických aniontů 2.25 pyromellitic acid, 6.5 mm NaOH, 0.75 mm hexamethonium hydroxide, 1.6 mm triethanol- amine, ph 7Negative polarity 465 V/cm, 9 µa 56/64.5 cm id=50 µm inj: 200 mbars Temp=25 C Indirect Detection Sig: 350,60 nm Ref: 245,10 nm

Separace aniontů pomocí CZE

Borátová komplexace

CZE v nevodném prostředí µ eo = εξ wall / η Nejlepšé rozpouštědla mají vysoké hodnoy ε/η SOLVENT η ε ε/η UV Cut Off voda 0.89 80 89.9 191 NMF 1.65 182 110.3 ~ 260 DMF 0.80 36.7 45.9 ~ 260 DMSO 2.00 46.7 23.4 ~ 260 Acetonitril 0.34 37.5 110.3 195 Methanol 0.54 32.7 60.6 205 Ethanol 1.07 24.6 23.0 205

Selectivita - Solvatace -ph* - Rozpouštědla v různých poměrech Účinnost - nízký proud díky nízkým dielectrickým konstantám - Rychlé separace - >350,000 Vhodné pro soluty nerozpustné ve vodě (náhražka MEKC) CE-MS kompatibilní

A = Vodná CE B = Nevodná CE S.Hansen et al trends in analytical chem.,15, 175, 1996

1mM Acetate @ ph* 9.3 in 50/50 MeOH/MeCN UV@ 200nm Altria KD and Bryant SM, Chromatographia, 46 1997 122-130

Non aqueous CE of inorganic anions 10mM KH Phthalate, 1mM TMAH methanol:dmf 7:3 Indirect 254nm Cl content in Azelastine HCL 8.59% theory 8.47 CE Suzuki et al J.Chromatogr.A 829 (1998( 411-415

Princip MEKC Micela a střed rozpustná v obou b silně hydrofilní nerozpustná v micele c silně hydrofóbní nerozpustná ve vodné fázi

Micelární elektrokinetická chromatografie

Kapacitní faktor a rozlišní v MEKC + + α α = 1 mc 0 mc 0 2 2 1 2 s k t t 1 t t 1 1 k k 1 4 N R 0 r 0 r t t 1 1 t t k = α = selektivita

Separační okno v MEKC pro neutrální látky

Factory ovlivňující selektivitu Typ detergenu Různé čelní skupiny mají silný vliv (iontové interakce) Žlučové kyseliny Kationtové (otočení EOF) ph Ovlivňování ionizace Pufr Efekt aditiv je větší než u CZE Organické modifikátory Teplota Ovlivňuje chování micel 2ºC může značně ovlivnit separaci

Používané detergenty Typ Detergent CMC (mm) Agregační číslo aniontový SDS 8.2 62 kationtový CTAB DTAB 14 1.3 50 78 neiontový Oktylglukosid Dodecylmaltosid Triton X 100-0.16 0.24 - - 140 zwitterionty CHAPS CHAPSO 8 8 10 11 žlučové kyseliny cholová k. deoxycholová taurocholová 14 5 10-15 2-4 4-10 4

OH COONa Na cholát OH OH Zvyšuje rozpustnost solutů více než SDS K dispozici různé deriváty Možno použít spolu s methanolem, propan-2-olem 20-100mM koncentrace

Separace fenolů a alkoholů pomocí MEKC

Analysis of organic acids using low ph MECC, SDS concentration = 60mM Key to figure: AP = 4-Acetamido-phenol, NA = β-naphthoxyacetic acid (sodium salt), S = Saccharin (sodium salt hydrate), BA = Benzoic acid (sodium salt), B = Barbital (sodium salt), SA = Salicylic acid.

MEKC derivativátů anilínu (a) SDS nebo (b) sodium laurylsulfoacetate surfactanty. Buffer: 0.02-M borate phosphate buffer (ph 7.0). Detection wavelength: 240 nm. Applied voltage: 20 kv. 1, aniline; 2, o-aniline; 3, m-aniline; 4, p-aniline; 5, o-toluidine; 6, m-toluidine; 7, p-toluidine; 8, o-nitroaniline; 9, m-nitroaniline; 10, p-nitroaniline; 11, o-chloroaniline; 12, m-chloro aniline; 13, p-chloroaniline; 14, acridine orange-10-dodecylbromide.

Optimalizace SDS MEKC Starting conditions - 15mM borate with 50mM SDS Small k Large k INCREASE SDS DECREASE SDS Insufficient resolution? Insufficient resolution? Lower ph, Lower voltage, Ion-pair reagent Organic solvents, Temperature, Electrolyte Organic solvents, Temperature, Electrolyte Ion-pair reagent, Lower ph, Lower voltage ALTERNATIVES Cationic surfactants Bile salts MIxed micelles Low ph

Mikroemulsní elektrokinetická chromatografie

Valko 5 (7,1) 120 100 80 60 40 20 MEEKC retentce vs LogP logp vs migration time 5 4.5 4 3.5 4 5 6 7 8 9 Retention time Phenacetine Response 9.83 Butyrophenone Valerophenone Hexanophenone Heptanophenone Acetophenone Acetanilide 3 Propiophenone 2.5 logp 2 1.5 1 0.5 0 0 2 4 6 8 10 migration time Altria KD, J.Chromatogr.A 892 (2000) 171-186

Separace testovací směsi MEEKC Paracetamol Methyl paraben 4-hydroxyacetophenone Ethyl paraben Propyl paraben Naphthalene

Separace směsi vitaminů Vutamíny rozpustné ve vodě a tucích - nikotinamid - riboflavin - askorbová kyselina - thiamin - vitamin A - vitamin D

Chiralita chirální separace?

Thalidomid

Thalidomid

Chirální separace

Srovnání chirálních separací pomocí CZE a HPLC u hexabarbitalu CZE Rychlý vývoj metody Vysoké rozlišení Nízká cena reagencií Rychlost analýzy Analytické provedení HPLC Zdlouhavý vývoj metody Dlouhé doby analýzy Vysoká cena kolon Preparativní provedení

Cyklodextriny α CD - 6 glukosových zbytků β CD - 7 glukosových zbytků γ CD - 8 glukosových zbytků

Cyklodextriny Neaturalní α β γ Chemicky derivatispvané formy jako např. methyl, hydroxypropyl Nabité cyclodextriny, amino-, sulfo-, karboxy-

Sulfatovaný cyklodextrin

Cyklodextriny Aplikace : nabité CD neutrální enantiomery neutrální CD nabité enantiomery

Separace terbutaline s různými cyclodextriny

Crown ethery O O H O H N + H O O R Vhodné pro primarní aminy jako např. aminokyseliny O

Dextranové polymery

Vancomycin Použití v chiralních CE separacích Vysoká UV absorbance

Chiralní CZE při nízkém ph A d + A d + A d + A l + A d + A d + A l + A l + A l + A l + A d + A d + A l + A d + A l +

Triethanolamine-fosfát BGE (ph 2.5) s α-cyclodextrinem. Detekce při 200nm

Optimalizace chiralní separace při nízkém ph Chiral Separation? Increase or decrease CD Optimize conditions 15mM CD ph 2.5 No resolution? Try different CD No resolution? Try crown ether Primary amine? SDS MECC + CD or bile salt

Chirální CZE při vysokém ph A l - A l - A d - A d - A d - A d - A l - A d - A l - A l - A l - A d - EOF FLOW

Optimalizace chiralní separace při vysokém ph Chiral Separation? Increase or decrease CD Optimize conditions 15mM CD borax No resolution? Try different CD No resolution? Try oligosaccharide SDS MECC + CD or bile salt

MEKC pro chiralní separaci A l - - - - - - A - l - - - - - - A l - - - - - A d EOF A d - - - A d - A d - - - - - - A l -

Optimalizaci MEKC pro chiralní separaci Chiral Separation? Increase or decrease CD Optimize conditions 15mM CD, 50mM SDS, borax No resolution? Try different CD No resolution? Try bile salts Try mixed micelles

30 mm SDS, 100mM borate, 10mM HP-β-CD LOD of <0.06% (detection at 200nm) Noroski et al, J.Pharm.Biomed.Anal., 13, 1995, 45-52

Kapilární gelová elektroforéza

Polymerní matrice pro CGE

CGE fragmentů dsdna

CGE oligonukleotidů

Projekt lidského genomu sekvenace DNA

CGE bílkovin v přítomnosti SDS

Kapilární izoelektrická fokusace A + A + A A - A - A + A - A + A A - Low ph pi value High ph

Kapilární izoelektrická fokusace

CIEF EOF = 0 pokryté kapiláry Postup : 1. Vlastní fokusace - vzorek nanesen v celé kapiláře 2. Mobilizace - analyty musí projít detekční celou moblilizace elektroforetická hydrodynamická bez mobilizace EOF 0 nepokrytá kapilára, vzorek nanášen pouze v úzké zóně na začátku kapiláry

CIEF bílkovin pomocí tlakové mobilizace

Kalibrační křivka IEF

Kapilární izotachoforéza

ITP nukleotidů

Kapilární elektrochromatografie

Srovnání toku u LC a CEC LC CEC

CEC separace neutrálních látek

Instrumentace CE

Výrobci Agilent and Beckman 1 500 000 Kč

Beckman MDQ

Agilent HPCE 3D

Bioanalyser Agilent 2100

Schéma zařízení pro CZE

Napájecí zdroj stabilizovaný ± 30 kv 300 µa konstantní napětí nebo proud obojí polarita ochrana obsluhy

Kapilára křemenná - 25-100 µm i.d - 350 µm o.d. délka až 100 cm délka polyimidové vnější pokrytí

Kapilára Id efektivní délka L celková délka Is short end injection Detector position l d L l s

Délka kapiláry

Modifikace kapiláry kovalentní Si - O - Si - R ph 4-7 Si -C-R ph 2-10 adsorbované dynamické celulosa, PEG, PVA, PEI detergenty hydrofilní polymery kvarterní aminy extrémy ph vysoká I

Dávkování

Hydrodynamické

Elektrokinetické

Elektromigrační disperze

Analýza kationů nepřímou detekcí

Detekce

Spektrofotometrická detekce

DAD detekční systém

Lineární detekční rozsah

Zvýšení citlivosti detekce

Zvýšení citlivosti detekce Agilent Flow cell

Rozlišení zón

Multireflekční cela

Fluorescenční detekce

Nepřímá detekce FS 1. Empty capillary 2. Filled capillary FS 0 0 FS 3. Separation 0

Nepřímá detekce

Separace anorganických aniontů

Separace organických aniontů Indirect UV detection at 254nm 0 mins 5 mins 27cm x 75micron, 3.0 sec injection, 0.5mM TTAB/5.0mM phthalate/50mm MES ph5.2, 30C, -3kV

CZE-MS

Schéma CZE-ESI-MS

CZE-ESI-MS analýza peptidů

Zvýšení citlivosti detekce

Efekt složení vzorku na separaci

Stacking

Transient ITP

Transient ITP

Transient ITP

Zakoncentrování pomocí IEF

Speciální aplikace

Multiplex CE instrument

1997 µce

Příprava mikrochipů UV Light Mask PDMS PDMS Photoresist Channel Silicon Mold wafer

Požívané materiály Sklo První použitý materiál Dobře známé vlastnosti Složitá konstrukce Polymery levnější Méněkřehké Více možností chemismu Nepříliš dobře charakterizované

Klasická CZE Absorbance (mau) Absorbance (mau) 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0-0.5-1.0 35 30 25 20 15 10 5 A 2 4 6 8 10 12 B Cr Cr Cn Cn EDTA UA Time (min) UA 0 0 5 10 15 20 25 Time (min)?

Microchip CZE 1.2 uric acid 1.0 Current (na) 0.8 0.6 0.4 0.2 unknown 0.0 0 10 20 30 40 50 Time (s)

Bioanalyser Agilent 2100

LIF - imunostanovení

LIF - imunostanovení

Využití CE pro analýzu biologicky aktivních látek v léčivých rostlinách a tělních tekutinách Hořčiny zeměžluč, hořec MEKC Glatz, Z. et al. J.Liquid Chromatogr. Rel. Technol., 2000, 23, 1831. Lignany schizandra činská CEC,MEKC Kvasničková, L. et al. J. Chromatogr. A, 2001, 916, s. 265. Štěrbová, H. et al. Electrophoresis, 2002, 23, 253. Flavonoidy artyčok MEKC Ševčíková, P. et al. Electrophoresis, 2002, 23, 249.

Využití CE v klinické diagnostice Thiokyanát sliny, moč CZE Glatz, Z. et al. J. Chromatogr. A, 2001, 916, s. 273. Cystein moč MEKC Ševčíková, P. et al. J. Sep. Sci., 2003, 26, s. 734. Homocystein plasma MEKC Ševčíková, P. et al. J. Chromatogr. A, 2003, 990, s. 197. GSH erythrocyty MEKC Mašlaňová H., et. al. J. Chromatogr. A, 2000, 990, s. 197.

Využití CE pro separaci microcystinů CEC separace extraktu sinic Zeisbergerová, M. et al. J. Chromatogr. B 2006, 841, 140.

Využití CE pro separaci bakterií Dávkovaná kultura 700 mau 800 600 DAD1 A, Sig=214,10 Ref=off (BACTERIA\05XII004.D) CZE separace bakterie Lactobacillus acidophilus SEMIPREPARACE 500 400 300 200 Separovaná frakce 100 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 min Šnajdrová, L. et al. Chemické Listy, 2002, 96, 6s. 432.

Využití CE při studiu enzymů

Studium enzymových reakcí pomocí CE Pre-capillary On-capillary

Výhody CE Kapilára jako reakční prostor

Studium enzymových reakcí pomocí CE Pre-capillary provedení : - kapilára je používána pouze pro separaci a detekci - nutná manipulace mezi enzymovou reakcí a separací

Kinetické stanovení glutathion S-transferasa Šišková, Z. et al. J. Sep. Sci., 2005, 28, 1357.

End point stanovení cytochrom P450 2C9 Konečný, J. et al. Electrophoresis, 2007. 28, 1229.

Studium enzymových reakcí pomocí CE On-capillary provedení : - kapilára je navíc využita i jako reakční prostředí - stanovení je automatizováno dávkování, smísení, inkubace, separace, detekce CE

Elektroforeticky zprostředkovaná mikroanalýza Electrophoretically Mediated MicroAnalysis EMMA J. Bao, F.E. Regnier, J. Chromatogr. 608, 217 (1992). rozdílná elektroforetická mobilita enzymu a jeho substrátu(ů) pro vyvolání reakce přímo v kapiláře

EMMA - kontinuální mód A Substrate filled capillary Detection window + - + E P -

EMMA zonální mód B Detection window + - + S E P -

EMMA zonální mód Výhody : Menší spotřeba vzorků enzym, substráty, inhibitory Vyhodnocování

EMMA vyhodnocení Glu-6P + NAD + Kontinuální mód G6PDH 6P-Glu + NADH Zonální mód B.J. Harmon et al.,j. Chromatogr. A 726, 193 (1996). E.S.Kwak et al., Anal. Chim. Acta 397, 183 (1999).

EMMA využití Enzymové systémy Aktivita enzymů Koncentrace substrátů a inhibitorů Michaelisovy a inhibiční konstanty Neenzymové systémy GSH, HCys, Cys, DTT Ca(II) Gentamycin a kanamycin Kreatin Cr(VI) a Co(II) S. NOVÁKOVÁ, S. VAN DYCK, A. VAN SCHEPDAEL, J. HOOGMARTENS & Z. GLATZ* REVIEW: Electrophoretically Mediated Microanalysis J. Chromatogr. A 1032, 173 (2004). S. VAN DYCK, E. KAALE, S. NOVÁKOVÁ, Z. GLATZ, A. VAN SCHEPDAEL* & J. HOOGMARTENS REVIEW: Advances in Capillary Electrophoretically Mediated Microanalysis. Electrophoresis 24, 3868 (2003).

Studium enzymů pomocí CE? (pre-capillary versus on-capillary)

Rhodanasa (EC 2.8.1.1) CN - + S 2 O 3 2- SCN - + SO 3 2- Homo sapiens Detoxikace kyanidu - otravy - cigaretový kouř - glykosinoláty Brassicacceae Acidithiobacillus ferrooxidans Biohydrometalurgie Životní prostředí

rhodanasa pre-capillary stanovení aktivity Volba separačních podmínek, CN - + S 2 O 3 2- SCN - + SO 3 2-100 mm β-alanin - HCl, ph 3.5 nízký EOF CN - = HCN

rhodanasa pre-capillary stanovení aktivity Stanovení aktivity 45 40 ma U PEAK AREA 35 30 25 20 S 2 O 3 2-15 200 150 100 50 0 10 5 0 0 5 10 15 20 25 30 TIME [min] 15 min 12 min 9 min 6 min 3 min 0 min SCN - 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 min

rhodanasa pre-capillary stanovení aktivity Charakterizace enzymu z A.ferrooxidans EFFECT OF ph ON RHODANESE REACTION EFFECT OF TEMPERATURE ON RHODANESE REACTION 100 A - MES BUFFER B - HEPES BUFFER C - TRIS BUFFER D - BORATE BUFFER C 100 80 80 RELATIVE ACTIVITY [%] 60 40 B D REL.ACTIVITY [%] 60 40 A 20 20 0 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 10,5 ph 0 0 10 20 30 40 50 60 TEMPERATURE [ o C] Stanovení pi 6.5 (chromatofokusace) Stanocení MW 22 000 (gelová permeační chromatografie) Bouchal, P. et al. Folia Microbiol, 2001, 46, 385.

rhodanasa EMMA stanovení kinet. parametrů Volba separačních parametrů Separace anorganických aniontů (S 2 O 3 2-, SCN - ) probíhá nejlépe při nízkém ph základního elektrolytu eliminace EOF ph optimum rhodanasy: 8.5 Kombinace metody EMMA s "partial filling technique"

rhodanasa EMMA stanovení kinet. parametrů Dávkovací a separační parametry Parametr Základní elektrolyt 100 mm β-alanin HCl (ph 3.5) Přesnost migračních časů (n=10) Přesnost ploch píků (n=10) Hodnota 0,23 % Dávkování 3,88 % 1. 25 mm HEPES pufr (ph 8.5) : 50 mbar/4s 2. Rhodanasa ve 25 mm HEPES pufru (ph 8.5) : 50 mbar/4s 3. Substráty ve 25 mm HEPES pufru (ph 8.5) : 50 mbar/4s 4. 25 mm HEPES pufr (ph 8.5) : 50 mbar/4s - 25 mm HEPES (ph 8,5) Substráty v 25 mm HEPES (ph 8,5) Rhodanasa v 25 mm 25 mm HEPES HEPES (ph 8,5) (ph 8,5) + nástř Separační napětí Detekce

rhodanasa EMMA stanovení kinet. parametrů Stanovení Michaelisových konstant Km

rhodanasa EMMA stanovení kinet. parametrů Stanovení Michaelisových konstant Km 0,012 0,8 1/ plocha píku (mau*s) 0,01 0,008 0,006 0,004 0,002 0-1 -0,75-0,5-0,25-0,002 0 0,25 0,5 0,75 1 1,25-0,004-0,006 1/ [Na 2 S 2 O 3 ] (l/mmol) úsek na ose x 1/K M (CN - ) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 1/K M (S 2 O 3 2- ) y = 0,5839x + 0,0768 0,1 0-0,6-0,4-0,2-0,1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2-0,2 1 mm KCN 2 mm KCN 5 mm KCN 10 mm KCN 1/ [KCN] (l/mmol) K M (CN - ) = 7.60 mm K M (S 2 O 3 2- ) = 13.02 mm S 2 O 3 2- E SCN - E S 2 O 3 2- SO 3 2- ES CN -

Sulfotransferasa (EC 2.8.2.1) cytosolická - biotransformace/detoxikace xenobiotik (II fáze) membránově vázaná - sulfatace glykoproteinů

Vytisková, S. et al. J. Chromatogr. A, 2004, 1032, 319. sulfotransferasa EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Reakce O O S O O - O P O - O CH 2 O N N NH 2 N N + OH SULT1A1 HO O - P O O CH 2 O N N NH 2 N N + 274 nm O - O S O O HO P O - O O OH NO 2 HO O P - O O OH NO 2 PAPS 4-Nitrophenol PAP 4-Nitrophenyl sulfate Velmi nestabilní 80 % (20 % PAP) ~1 mg 100 Velmi silný inhibitor reakce K I = 0.4 µm

sulfotransferasa EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Krok 1. Dávkování PAPS Zóna Tlak p i (psi) Čas (s) Napětí (kv) PAPS 0.5 5 / 2. Předseparace od PAPS / / 60 15 3. Dávkování S 4. Dávkování E Dávkování a inkubace 4-NP 0.3 5 / SULT1A1 0.3 5 / 5. Smísen sení a enzymová reakce / / 60 5 6. Inkubace / / 120 0 7. Separace / / 300 10 - PAPS P + nástřik detekce

sulfotransferasa EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Stanovení Michaelisovy konstanty pro 4-nitrofenol 2.5 µm pnp 1.5 µm pnp 1 µm pnp 0.5 µm pnp 0.3 µm pnp 0.2 µm pnp 0.1 µm pnp K M = 0.8 µm