Ionexová chromatografie

Transkript

1 Ionexová chromatografie

2 Určena pro separaci látek nesoucích kladný nebo záporný náboj Afinita iontů k ionexu závisí na velikosti náboje V případě proteinů hraje zásadní roli ph!

3 Princip ionexové chromatografie

4

5 Ionexy Katexy záporný náboj vazba kationtů Anexy kladný náboj vazba aniontů

6 silný anex Q Sepharosa 0,1 M NaOH

7 Nosiče polystyren Amberlit, Dowex celulosa X-Sephacel dextran X-Sephadex prokřížená agarosa X-Sepharosa syntetické polymery MonoBeads, MiniBeads (Q, S)

8 DEAE-Sephacel velikost částic µm X-Sephadex prokřížený dextran Sephadex G25 nebo G 50

9 X-Sepharosa Sepharose High Performance (34 µm), Sepharose Fast Flow (90 µm), Sepharose Big Beads ( µm), Sepharose CL-6B (90 µm, lepší chemická a fyzikální stabilita) Vzorek: 0,8 mg cytochrom C (pi 10,3) 0,8 mg lysozym (pi>11) 3 mg ribonukleasa A (pi 9,3) Startovací pufr: 20mM fosfátový pufr ph 6,8 Eluční pufr: 20mM fosfátový pufr ph 6,8+0,5 M NaCl Průtok: 1 ml/min Kolona: 1ml Průběh separace: ekvilibrace 20 ml startovacího pufru aplikace vzorku 2 ml promytí - 5 ml startovacího pufru eluce 40 ml, lineární gradient, % elučního pufru

10 Vzorek: 0,8 mg α-laktoglobulin (pi 5,8) 0,4 mg conalbumin (pi 6,3) 1,2 mg trypsin inhibitor (pi 4,5) Startovací pufr: 20mM Tris/HCl ph 7,4 Eluční pufr: 20mM Tris/HCl ph 7,4 + 0,5 M NaCl Průtok: 1 ml/min (150cm/h) Kolona: 1ml Průběh separace: ekvilibrace 20 ml startovacího pufru aplikace vzorku 2 ml promytí - 5 ml startovacího pufru eluce 40 ml, lineární gradient, 0-80 % elučního pufru

11 Údaje od výrobce

12 MonoBeads, MiniBeads (Q, S) vysoké rozlišení MiniBeads mikropurifikace, analysa vyšší pracovní tlak FPLC/HPLC MonoBeads -FPLC

13 Vzorek: pankreatin Eluce: gradient iontové síly Rozlišení

14 Výběr vhodného ph pro ionexovou chromatografii

15 ph gradient Eluční gradient

16 gradient iontové síly lineární x skokový

17 Vliv strmosti gradientu

18 Vliv elučního objemu

19 Koncentrační efekt

20 Purifikace celulasy

21

22 stacionární fáze vysoké rozlišení (gradientová eluce) silné ionexy velikost částic µm pro purifikaci 3-5 µm pro analytiku Experiment skupinová separace (kroková eluce) silné ionexy velikost částic 30 µm nebo větší vyšší průtok kolona dékla 1-10 cm nezáleží, krátká, silná lepší pro vyšší průtok mobilní fáze objem vzorku množství vzorku ph pufru aspoň o 0,5 než pi Koncetrace pufru mm na objemu nezáleží 5-10 % celkové kapacity kolony (dobré rozlišení) ph pufru aspoň o 0,5 než pi na objemu nezáleží 40 % celkové kapacity kolony

23 Alfa-amylasová aktivita byla měřena s využitím rozpustného škrobu jako substrátu a produkty reakce byly detekovány reakcí s dinitrosalicylovou kyselinou. Reakční směs obsahovala 0,2 ml enzymu, 0,3 ml 1% škrobu a 0,5 ml 50 mm Tris pufru ph 8,2. Reakce probíhala 1 minutu při 37 C a byla ukon čena přídavkem 4ml dinitrosalicylové kyseliny. Směs byla povařena 5 minut. Absorbance výsledných produktů při 530 nm byla 1,235 v 1cm kyvetě (molární absorpční koeficient 100 dm 3.cm -1.mol -1 ). Vypočítejte aktivitu amylasy.

24 Vypočítejte aktivitu malátdehydrogenasy. Reakční směs obsahovala 0,5 ml NAD+ (100mM), 0,5 ml malátu (200 mm), 1 ml enzymového preparátu (konc. bílkovin 1,5 mg/ml) a 2 ml pufru (100 mm Tris, ph 7,5). Reakce probíhala při teplotě 37 C a byl sledován p řírůstek absorbance při 340 nm. Po 5 minutách vzrostla absorbance z 0,2 na 1,45. Vypočítejte celkovou a specifickou aktivitu malátdehydrogenasy v enzymovém preparátu. (ε=6220 l/mol/ cm). Měření absorbance probíhalo v jednocentimetrové kyvetě a všechny substráty byly v reakční směsi v nadbytku.

25 Chromatofokusace separace proteinů na základě jejich pi vysoké rozlišení není potřeba připravovat ph gradient zaostřovací efekt jednoduchost

26 Polypufry - amfolyty Stacionární fáze Polybuffer 96 - ph 9-6 Polybuffer 74 - ph 7-4 PBE94 Pharmalyte - ph 8-10,5 PBE118

27

28 Princip fokusace

29 MonoP Beads směs kvartérních a terciálních aminů

30 Dvoudimensionální chromatografie Beckman Coulter PF 2D

31 Dvoudimensionální chromatografie ph hydrofobicita frakce

32

33 Disulfidový můstek -oxidací SH skupin Cys -silná kovalentní vazba

34 Vodíková vazba příklady postranních aminokyselinových řetězců, které spolu mohou tvořit vodíkové vazby: dva alkoholy: ser, thr a tyr alkohol a kyselina: asp a tyr dvě kyseliny: asp a glu alkohol a amin: ser a lys alkohol a amid: ser a asn

35 Solný můstek - interakce mezi pozitivně nabitou amino- a záporně nabitou karboxy- skupinou

36 Hydrofobní interakce

37 Hydrofobicita proteinu insulin malwmrllpl lallalwgpd paaafvnqhl cgshlvealy lvcgergffy tpktrreaed lqvgqvelgg gpgagslqpl alegslqkrg iveqcctsic slyqlenycn

38 Hydrofobní chromatografie

39 vliv soli na protein Stacionární fáze vazba hydrofobních oblastí na povrchu proteinu v H 2 O slabé interakce přídavek soli méně hydrofobní než RPC Mobilní fáze H 2 O/sůl (~1 M) nejčastěji (NH 4 ) 2 SO 4

40 Eluce klesajícím gradientem soli (1 M 0 M) stacionární fáze nejméně hydrofobní látka středně hydrofobní látka velmi velmi hydrofobní hydrofobní látka kontaminace

41 Přehled typů stacionární fáze Phenyl, Butyl nebo Octyl Sepharose Fast Flow (FF), FPLC kolony Phenyl Superose fy Pharmacia Biotech na polysacharidové (agarosové) bázi Macro-Prep t-butyl HIC Support fy Bio-Rad na methakrylátové bázi Spheron 100 (300, 1000) fy Lachema založené na bázi kopolymeru hydroxyethylmethakrylátu a ethylendimethakrylátu Separon HEMA-S 1000, Separon HEMA-Bio 1000 Phenyl fy TESSEK jsou vyráběny na bázi hydroxyethylmethakrylátu

42 výběr ligandu Ether < Isopropyl < Butyl < Octyl < Phenyl

43 efekt ligandu na purifikaci efekt mobilní fáze A B C

44 typy gradientů

45

46

47 stacionární fáze kolona vysoké rozlišení (gradientová eluce) Experiment skupinová separace (kroková eluce) velikost částic µm velikost částic 30 µm nebo větší vyšší průtok délka 1-10 cm (krátká kolona nevhodná pro pozvolný gradient) mobilní fáze mm pufry v rozmezí ph 4-8 (ph má malý vliv na selektivitu) gradient soli (nejčastěji (NH 4 ) 2 SO 4 ) nezáleží, krátká, silná lepší pro vyšší průtok mm pufry v rozmezí ph 4-8 (ph má malý vliv na selektivitu) gradient soli (nejčastěji (NH 4 ) 2 SO 4 ) objem vzorku na objemu nezáleží na objemu nezáleží množství vzorku 5-10 % celkové vazebné kapacity (bez ztráty rozlišení) ~ 40 % celkové vazebné kapacity

48 vysoké rozlišení (gradientová eluce) separace proteinů na základě jejich hydrofobicity vhodná jako první nebo střední purifikační krok použití hydrofobní chromatografie skupinová separace (kroková eluce) koncentrace naředěného vzorku vhodná jako purifikační krok po precipitaci síranem amonným

49 Jako první krok purifikace alkoholdehydrogenasy z Pseudomonas sp. jste zvolili srážení síranem amonným (Mr 132,14 g/mol) a to do 50 %. Alkoholdehydrogenasu jste po srážení detekovali v supernatantu (objem supernatantu je 20 ml). Jako další krok purifikace chcete zvolit hydrofobní chromatografii na koloně Butyl- Sepharose. Jak byste postupovali?

50 Chromatografie na reversní fázi

51 Chromatografie na normální fázi stacionární fáze - hydrofilní (polární) mobilní fáze - hydrofobnější nebo méně polární než stacionární fáze Chromatografie na reversní fázi stacionární fáze - hydrofobní (nepolární) mobilní fáze - polárnější než stacionární fáze

52 separace látek na základě jejich hydrofobicity hydrofobní chromatografie x chromatografie na reversní fázi hydrofobní interakce musí být podpořena solí eluce snižující se koncentrací soli lysozym stacionární fáze je vysoce substituovaná CH řetězci vysoká hydrofobicita proteiny, peptidy a oligonukleotidy se adsorbují i v čisté H 2 O desorbce organická rozpouštědla (např. acetonitril v H 2 O) vysoká hydrofobicita nižší hydrofobicita vysoce hydrofilní méně hydrofilní

53 Mechanismus adsorbce malé organické molekuly +/- rozpustné ve stacionární fázi Peptidy i proteiny mohou interagovat s hydrofobním nosičem Větší velikost nemohou být kompletně pohlceny hydrofobní stacionární fází Velká pravděpodobnost interakce více míst molekuly

54 Pokles polarity mobilní fáze oslabuje hydrofobní interakce Eluční křivka odpovídá distribuci mezi stacionární a mobilní fázi.

55 Isokratická eluce vliv koncentrace organického rozpouštědla Gradientová eluce

56 nejméně hydrofobní látka středně hydrofobní látka velmi velmi hydrofobní hydrofobní látka kontaminace stacionární fáze Ekvilibrace Aplikace vzorku a promytí Gradientová eluce Regenerace

57 Vliv typu mobilní fáze Mobilní fáze Vliv koncentrace rozpouštědla

58 Mobilní fáze Organické rozpouště dlo Vhodné pro: Viskosita Poznámka Methanol Org. molekuly Střednínízká možná destabilis ace struktury Ethanol Org. molekuly Střednínízká možná destabilis ace struktury Isopropan ol Proteiny Peptidy Vysoká nejmenší efekt na strukturu Acetonitril (ACN) Org. molekuly Proteiny Peptidy Nízká nízký efekt na strukturu

59 Retenční čas x ph mobilní fáze při chromatografii na reversní fázi kyselina nebo zásada je ionizovaná menší hydrofobicita

60 Spektrofotometrické vlastnosti rozpouštědel

61 Stacionární fáze Silikagel poresní silika gel zvýšení efektivního povrchu inertní materiál stabilní v ph 2-7,5 Polymerní nosič poresní polymer zvýšení efektivního povrchu nepolární stabilní v ph 2-11

62 Stacionární fáze - funkční skupiny

63 Vliv funkční skupiny na rozlišení

64 rozpouštědlový pík gradient Pufr A: 0,1 % TFA + H 2 O Pufr B: 0,1 % TFA + acetonitryl A214nm retenční čas / min Čas % A % B Sekvence RGGGGVGLGK RGGGGVGVGK RGGGGLGLGK R T 15,0 10,5 20,5

65 stacionární fáze Experiment vysoké rozlišení (gradientová eluce) velikost částic µm - pro purifikace 5-12 µm - pro analytiku polymerní lepší pro separaci proteinů (lze čistit pomocí NaOH) skupinová separace (kroková eluce) velikost částic 30 µm nebo větší vyšší průtok kolona délka 1-10 cm nezáleží, krátká, silná lepší pro vyšší průtok mobilní fáze objem vzorku množství vzorku Oligonukleotidy alkalické podmínky Peptidy ACN, TFA ~ ph 2 0,5-5% objemu kolony při isokratické eluci bez omezení při gradientové eluci 5-10 % celkové kapacity kolony (dobré rozlišení) nemá významný vliv (50 %ACN) na objemu nezáleží 40 % celkové kapacity kolony

66 vysoké rozlišení (gradientová eluce) separece peptidů, proteinů a oligonukleotidů podle jejich hydrofobicity Vhodná jako střední purifikační krok nebo závěrečný purifikační krok Purifikace syntetických peptidů Technika pro analysu peptidů a peptidové mapování použití RPC skupinová separace (kroková eluce) Zakoncentrování oligonukleotidů a peptidů Vhodná pro odsolování peptidů a oligonukleotidů Tipy pro přípravu pufru Upravte ph před přidáním organického rozpouštědla Upravte ph pufru při teplotě experimentu Ověřte stabilitu proteinu Pro analytické experimenty použijte HPLC grade chemikálie Tipy pro přípravu vzorku Zfitrujte nebo stočte vzorek před aplikací na kolonu ph a iontová síla (!velký objem vzorku!) stejná jako ve startovacím pufru (PD10) Teplota vzorku stejná jako startovacího pufru (!velký objem vzorku!)