VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHOMATOGAFIE ZADÁNÍ ÚLOHY Metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie separujte směs s-triazinových herbicidů, sledujte vliv složení mobilní fáze na separaci. Proveďte kvalitativní analýzu neznámého vzorku. TEOETICKÝ ÚVOD Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC High Performance Liquid Chromatography) se řadí mezi nejčastěji používané separační metody. Vyniká vysokou účinností, dobrou opakovatelností a robustností. Tato metoda je vhodná pro dělení netěkavých a polárních látek, jejichž analýza příbuznou plynovou chromatografií bývá často obtížná. HPLC je založena na separaci analytů na základě jejich distribuce mezi stacionární a mobilní fázi. Během separace dochází k mnoha typům interakcí. Uplatňují se interakce analytů s mobilní fází, interakce mobilní fáze se stacionární fází a sorpce analytů na stacionární fázi. Za předpokladu, že při přechodech analytu (A) z mobilní fáze do fáze stacionární se chromatografický systém přiblíží rovnovážnému stavu, lze tuto distribuci mezi obě fáze popsat distribuční konstantou K D. K = D [ A] [ A] s m, kde [A] s je rovnovážná koncentrace analytu ve stacionární fázi, [A] m rovnovážná koncentrace analytu v mobilní fázi. Na základě rozdílné velikosti této distribuční konstanty jsou některé analyty na koloně zadržovány méně a některé více. To se projeví rozdílem v jejich retenci, která je většinou porovnávána pomocí retenčních faktorů k. ( t tm ), k = tm kde t je retenční čas analytu (tj. doba od nadávkování vzorku po čas, kdy detektor zaznamená maximum píku), t M je mrtvý čas (tj. retenční čas látky neinteragující se stacionární fází. 1
Parametry popisující separaci Separace látek může být posuzována pomocí několika základních parametrů, mezi něž patří účinnost, rozlišení a separační faktor (pro dvojici látek), které jsou určeny selektivitou separace. ozlišení 1,2 dvou píků je dáno vztahem 1,2 = ( t2 t 1) ( w ), 2 + w 2 1 kde w 1, w 2 jsou šířky píků při základně. ozlišení dvou píků je ve vztahu k parametrům kolony vyjádřeno následující rovnicí: 1,2 = ( α 1) n 2,1 k2 k2, 4 α 2,1 1+ k2 k 2 kde n je účinnost kolony (vyjádřená jako počet teoretických pater), α 2,1 = je separační k1 faktor, který je měřítkem selektivity, k 2 je retenční faktor složky eluující později. ozlišení 1,2 = 1 odpovídá 95% separaci látek, která je při optimalizaci metody považována za dostatečnou. ozlišení téměř na základní linii, odpovídající 99,7% separaci látek, nabývá hodnoty 1,5. Pro výpočet účinnosti kolony/separačního systému platí následující vztah: t n = 16 w 2 t = 5,545 w 1/ 2 2, kde t je retenční čas, w je šířka píku při základně a w 1/2 je šířka píku v polovině výšky. Ze vztahu (matematického vyjádření) je patrné, že pro různé píky v chromatogramu bude tato hodnota různá. Dalším parametrem, který se často používá pro posouzení kvality kolony (separačního systému) je výškový ekvivalent teoretického patra H: 2
L H =, n kde L je délka kolony. Parametr sloužící k posouzení tvaru píku se nazývá symetrie píku, resp. asymetrický faktor A s : A s = B/A, kde A, B jsou šířky píku v 10% jeho výšky ke kolmici na základnu spuštěné z vrcholu píku-z náběžné strany (A) a z druhé (často chvostující) (B). Systémové píky V chromatografických systémech je často obtížné najít vhodný marker mrtvého času, neboť se na retenci podílí mnoho typů interakcí. Zajistit, aby zvolený marker skutečně se stacionární fází neinteragoval žádným typem interakce, je téměř nemožné. Proto je snahou využívat k určení mrtvého času rozpouštědlového (systémového) píku. V chromatogramech často pozorujeme jeden či více pozitivních nebo negativních píků příp. kombinaci obou typů, které někdy používáme k určení mrtvého času potřebného pro výpočet retenčního faktoru, a tedy k charakterizaci analytu v daném systému. Systémové píky mohou vznikat v kapalinové chromatografii pokud mobilní fáze obsahuje více než jednu složku. Po nadávkování vzorku do vícesložkové mobilní fáze se na výsledném chromatogramu objeví více píků, než kolik analytů je ve vzorku. Systémové píky bývají někdy chybně zaměňovány s píky měřených analytů. V chromatografickém systému se ustavuje rovnováha (mezi stacionární a mobilní fází) při průtoku mobilní fáze systémem. Tato rovnováha se poruší náhlou změnou mobilní fáze, např. po nadávkování vzorku (neboť i když je vzorek dávkován v mobilní fázi, složení (koncentrace) jednotlivých složek mobilní fáze je poněkud změněna (porušena) a tato porucha se objeví v podobě systémových píků v chromatogramu). Po narušení rovnováhy začne chromatografický systém ihned směřovat k novému rovnovážnému stavu. Výsledkem tohoto jevu je chromatogram obsahující píky analytů a píky složek mobilní fáze, tj. systémové píky. Hydrofobicita Hydrofobicita se řadí mezi významné toxikologické parametry. ozdělovací koeficient látky (A) mezi n-oktanol (představuje hydrofóbní prostředí) a vodu (představuje hydrofilní, 3
polární rozpouštědlo) K ow (P) resp. jeho logaritmická forma log K ow (log P) je jeden z parametrů popisující hydrofobicitu. Tato vlastnost sloučenin se používá např. v ekotoxikologických studiích k predikci distribuce dané sloučeniny (např. pesticidů) v odlišných přírodních kompartmentech. Veličina K ow resp log P se objevuje v rovnicích pro odhad bioakumulace sloučenin v rostlinách a živočiších. Log K ow je také významným parametrem v QSA (Quantitative Structure Activity elationships, tj. kvantitativními vztahy mezi strukturou a působením (účinností)) modelech. Model QSA je využíván ve farmakologii a farmacii k optimalizaci struktur účinné látky; v predikční toxikologii slouží tento model k odhadu toxicity dané látky. Analogické modely např. QS (Quantitative Structure etention elationships) se používají např. v kapalinové chromatografii ke korelaci retence analytu měřené za určitých podmínek s jeho fyzikálně-chemickými, topologickými nebo geometrickými vlastnostmi (tyto vlastnosti jsou popsány pomocí deskriptorů, P i ). Pro retenční faktor dané látky platí následující funkce: k = f (P i ), mezi P i deskriptory se řadí fyzikálně-chemické deskriptory (log P, hydrofobní substituční konstanty π apod.); geometrické deskriptory (van der Waalsův objem, van der Waalsův specifický povrch, parametr tvaru atd.); topologické deskriptory (elektronové deskriptory, Hammetovy konstanty, parametry odrážející proton-donorovou a proton-akceptorovou schopnost molekul atd.). Během chromatografického procesu dochází k mnoha typům interakcí, jejichž výsledkem je doba zadržení analytu v separační koloně tedy jeho retence. Herbicidy Herbicidy jsou významnou podskupinou pesticidů, tj. sloučenin určených pro likvidaci škůdců všeho druhu. Používání pesticidních přípravků má často negativní efekt na životní prostředí, především vede ke znečistění hydrosféry a také dochází ke kumulaci těchto látek v potravním řetězci. Působení herbicidů je směřováno k ničení rostlinných škůdců. Významnou skupinou herbicidů, které se aplikují do půdy, jsou sloučeniny odvozené od s-triazinové základní kostry. Prometon (log P = 2,99), prometryn (log P = 3,51), propazin (log P = 2,93) a atrazin (log P = 2,61) jsou použity jako modelové sloučeniny v této úloze. Prometryn, propazin a prometon jsou analogy lišící se substitucí v poloze 1, tj. -SCH 3, -Cl resp. -OCH 3. Atrazin a propazin jsou naopak oba Cl-deriváty lišící se substitucí (jednou methylovou skupinou) 4
v poloze 3. Výběr takto strukturně podobných sloučenin umožní vysledovat obecné trendy vlivu složení mobilní fáze na separaci. EXPEIMENTÁLNÍ ČÁST K separaci směsi čtyř s-triazinových pesticidů bude použit vysokoúčinný kapalinový chromatograf Alliance (Waters 2695 Separation Module) od firmy Waters. Tato aparatura se skládá ze čtyř vysokotlakých pump (A, B, C a D); PDA detektoru (Photodiode Array Detector Waters 2996); autosampleru; pěti karuselů (A, B, C, D, a E; každý z karuselů má kapacitu 24 viálek), které jsou temperovány na zadanou teplotu; kolonového termostatu a počítače. Pro řízení aparatury, sběr a následné zpracování dat bude využit software Empower (návod na ovládání tohoto softwaru je k dispozici u přístroje). K měření bude použita kovová kolona Symmetry C18 od firmy Waters o rozměrech 75 mm x 4,6mm (vnitřní průměr) naplněná endkapovanou oktadecylsilikagelovou stacionární fází, zrnění 3,5 µm. Mobilní fáze bude v izokratickém módu dvousložková, tvořená směsí acetonitrilu (ACN) a vody - ACN/voda 35/65 (v/v), průtoková rychlost bude 1 ml/min. Při gradientové analýze bude mít mobilní fáze prvních 6 minut konstantní složení (ACN/voda 35/65 (v/v)), od 6. do 7. minuty se bude složení mobilní fáze lineárně měnit do jednosložkové mobilní fáze tvořené 100% ACN, průtoková rychlost bude po celou dobu analýzy 1 ml/min. Detekční vlnová délka bude určena po proměření spekter v rozmezí 200-400 nm. Teplota v kolonovém termostatu a teplota v karuselu budou nastaveny na 25 C. Úkoly: 1. Navrhněte retenční pořadí herbicidů na základě jejich struktury a známých hodnot log P. 2. V izokratickém módu proměřte spektra (v rozmezí 200-400 nm) herbicidů. Dobu analýzy zvolte 20 minut. Vyberte optimální vlnovou délku pro další měření. 3. Experimentálně ověřte navržené retenční pořadí při izokratickém eluci. 4. Proveďte separaci stejné směsi za podmínek gradientové eluce. Dobu analýzy zvolte 10 minut. 5. Mrtvý čas kolony zjistěte nadávkováním acetonitrilu za podmínek izokratické eluce. 6. Zjistěte/spočítejte a porovnejte jednotlivé chromatografické parametry - retenční faktory, separační účinnost, symetrii píků, rozlišení mezi sousedními píky a separační faktory - získané při separaci v izokratické a gradientové eluci. 7. Proveďte kvalitativní analýzu herbicidů v neznámém vzorku. 5
Struktury vybraných herbicidů: POMETYN = 2,4-bis-(isopropylamino)-6-methylthio-1,3,5-triazin POPAZIN = 2,4-bis-(isopropylamino)-6-chloro-1,3,5-triazin POMETON = 2,4-bis-(isopropylamino)-6-methoxy-1,3,5-triazin ATAZIN = 2-chloro-4-ethylamino-6-isopropylamino-1,3,5-triazin 6