Nové p ístupy v detekci DNA a protein

Nové p ístupy v detekci DNA a protein

DNA je makromolekula ú astnící se klí ových biologických proces Její poškození má za následek: mutace a aberace rakovinu metabolické poruchy které vrozené vady neurodegenerativní onemocn ní predispozice k civiliza ním chorobám

Mohou elektrochemické metody p ispp isp t t ke studiu protein a nukleových kyselin? Prof. Jaroslav Heyrovský Originální polarograf J. Heyrovského a M. Shikaty (1924) Obrovský rozmach elektrochemických metod nejen ve studiu anorganických a organických látek, ale také v elektrochemické analýze biomakromolekul, p edevším nukleových kyselin a protein. Nobelova cena za objev polarografie (1959)

Pro elektrochemické metody? nízká cena rychlé zpracování jednoduchá obsluha malé nároky na energii edpoklady pro miniaturizaci

Pevné elektrody (uhlíkové a kovové): uhlíkové CPE (carbon paste electrode - pastová uhlíková elektroda) vyrobená ze sm si práškového grafitu (70%) a minerálního oleje (30%) + event. další p ím si GCE (glassy carbon electrode) skelný uhlík PGE (pyrolytic graphit electrode) SPE (screen printed electrode) kovové Au, Ag, Cu elektrody s modifikovaným povrchem - rtu ový film, lipidová membrána) amalgámové elektrody k m ení se využívá amalgámu kovu se rtutí; Ag, Cu Rtu ové elektrody: DME (dropping mercury electrode) polarografie výhoda: velmi jemný povrch, který je snadno definovatelný, nukleová kyselina je adsorbovaná p i velkém potenciálovém rozsahu, nevýhoda: velké nároky na objem analytu (1 2 ml) HMDE (hanging mercury drop electrode) voltametrie Celý experiment probíhá na jedné kapce, možnost akumulace na elektrod a použití transferových metod

Detekce nukleových kyselin

Strategie detekce hybridizace DNA Jednopovrchová strategie hybridiza ní a detek ní krok probíhají na stejném (elektrodovém) povrchu Dvoupovrchová strategie oba kroky odd leny možnost nezávisle optimalizovat jednotlivé kroky snadná separace analytu od složek reak ní sm si snadná adaptovatelnost pro jednotlivé analytické ely

cells specific antibody complementary NA strand biotinylated ss ODN antibody antigen (protein) biotinylated duplex ODN streptavidin protein G protein A specific antibody DNA- binding protein oligo(dt) n Co cobalt chelate His-tagged protein N Co N N N NA strand with (A) n stretch

electrode

Elektrochemická detekce tripletových opakování v DNA

Další aplikace v v elektrochemické detekci DNA Detekce poškození DNA Hybridizace DNA Stanovení koncentrace DNA Konforma ní zm ny DNA Vývoj DNA biosenzor

Detekce protein Oxida ní signály Katalytické signály Oxida ní signály tyrosinu a tryptofanu Streptavidin (1 mg/ml) Brdi kova reakce Alpha-synuclein (40 mg/ml) A140C mutant PeakH Metalothionein (100 ng/ml) -0.8-0.7 Co electrolyte A140C mutant 190 Signál proteinu 1 ma Y W Výška píku (µa) -0.6-0.5-0.4-0.3 dt/de (s/v) 140 90 0,6 0,7 0,8 0,9-0.2 40 Potenciál (V) -0.1 0-0.68-0.88-1.08-1.28-1.48-10 -1,70-1,75-1,80 Potenciál (V) Potenciál (V)

Alpha-synuclein je 14 kda protein, který je ve velké mí e exprimován v r zných ástech mozku, a který se ú astní patofyziologie n kterých neurodegenerativních onemocn ní. P i t chto onemocn ních postupn zanikají n které populace nervových bun k, což je spojeno s velmi vážnými psychickými a neurologickými p íznaky. Projevují se ztrátou pam ti a rozumových schopností, poruchami chování, asto i halucinacemi, bludy a celkovým úpadkem osobnosti. Neurologické projevy se týkají p edevším správné koordinace a ízení pohybu a e i. B Transverzální ez st edním mozkem, kde je dob e viditelná substantia nigra Substantia nigra Zúžená substantia nigra, jak ji m žeme vid t u Parkinsonovy choroby V nativní form je alpha synuclein nestrukturovaný (angl. unfolded) a svou fibrilární strukturu získává teprve až agregací. E Amfipatická oblast Centrální doména Kyselá oblast

Agregace alpha-synucleinu Normální protein (Monomer) A Abnormální protein (Agregát) B Protofibrily Amyloidní fibrily Póry Jak? Neurodegenerace a onemocn ní

Faktory, které urychlují agregaci alpha-synucleinu synucleinu: P ítomnost mutací - A30P, A53T a E46K mutované proteiny vytvá í fibrilární struktury rychleji než wt protein. Zkrácené verze protein (truncation) - zkrácený alpha-synuclein, který obsahuje pouze 120 resp. 108 aminokyselin je mnohem více náchyln jší k tvorb filament in vitro než celý (full-length) protein. Koncentrace proteinu. Interakce s ionty, p ípadn s jinými látkami. P ídavek malého množství agregátu alpha-synucleinu k nativní form tohoto proteinu.

[θ] (10 3 deg cm 2 dmol -1 ) CD spektroskopie Atomová silová mikroskopie 15 A 10 5 3 týdny agregovaný alpha-synuclein 0-5 -10 B -15-20 Nativní alpha-synuclein -25 195 205 215 225 235 245 255 Vlnová délka (nm)

Rtu ová elektroda Uhlíková elektroda 2000 1800 150 nm AS 190 250 nm AS 1600 dt/de (s/v) 1400 1200 1000 800 600 400 200 Výška píku (na) 140 90 40 0-200 -1.76-1.73-1.7-10 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95 Potenciál (V) Nativní alpha-synuclein (bez agregace) 24 hodin agregovaný alpha-synuclein r 80 hodin agregovaný alpha-synuclein

1 B Normalizovaná fluorescence 0.8 0.6 0.4 0.2 A Výška píku 1950 1450 950 450 Potenciál (V) 0 h 24 h 48 h 72 h -50-1.76-1.74-1.72-1.7-1.68 C [θ] (10 3 deg cm 2 dmol -1 ) 20 10 0-10 -20-30 0 h 3 týdny 195 215 235 255 Vlnová délka (nm) 0-0.2 0 50 100 150 200 250 as (h)

Protein MutS je termostabilní molekula jejíž velikost se pohybuje kolem 90 kda. Je sou ástí tzv. MMR systému (systém oprav chybného párování bází) a hraje velmi významnou úlohu v repara ním systému DNA u prokaryotických i eukaryotických bun k, kde rozpoznává nespárované nebo nesprávn párované báze v dvoušroubovici DNA. Homology proteinu MutS m žeme nalézt tém ve všech organismech. Eukaryotické genomy obsahují n kolikanásobné muts homologní (msh) geny a s výjimkou mitochondriálního proteinu MSH1, tvo í všechny ostatní eukaryotické proteiny MutS heterodimery. Systém m opravy chybného ho párovp rování bází u savc je v mnoha ohledech stejný jako u bakterií.

Protein MutS m žže e být využit pro detekci bodových mutací in vitro Hybridizace A B

K emu je dobrá elektrochemie? MAGNET Perfect duplex 1. 5 bio -TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG 3 2. 3 -AAA CTC CAC GCA CAA ACA CGG ACA GGA CCC 5 CPE HMDE GT mismatch 1. 5 bio -TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG 3 2. 3 -AAA CTC CAC GTA CAA ACA CGG ACA GGA CCC 5 GT mismatch s inserce jednoho thyminu 1. 5 bio -TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG 3 2. 3 -AAA CTC CAC GTA CAA ACA CGG ACA GGA CCC 5 T Inserce jednoho thyminu 1. 5 bio -TTT GAG GTG CGT GTT TGT GCC TGT CCT GGG 3 2. 3 -AAA CTC CAC GCA CAA ACA CGG ACAGGA CCC 5 T

Srovnání r zných typ duplex (1) Samotné STV-kuli ky (2) Perfect duplex (3) T insert (4) GT mismatch (5) GT mismatch + T insert (vedle sebe) Výška píku (%) (6) GT mismatch + T insert (vzdálený) 0 20 40 60 80 100